So với các tế bào phát triển bằng metanol, M. acetivorans phát triển bằng acetate đã tổng hợp một lượng protein lớn hơn được mã hóa trong một đơn vị phiên mã 7 gen được chú thích cho phức hợp Mrp được báo cáo trước đây là hoạt động như một antiporter (chất trao đổi) chuyển natriproton trong liên giới Vi khuẩn. Sự khác biệt được báo cáo ở đây giữa M. acetivorans và M. mazei có thể là do sự thích nghi của M. acetivorans với môi trường biển.
VẬN CHUYỂN ĐIỆN TỬ TRONG CON ĐƯỜNG CHUYỂN ĐỔI ACETATE THÀNH METHANE TRONG VI KHUẨN CỔ SỐNG Ở BIỂN METHANOSARCINA ACETI VORANS Tóm tắt Phương pháp sắc ký lỏng – hybrid linear ion trap– phương pháp phổ khối cộng hưởng cyclotron ion biến đổi Fourier (Khối phổ cộng hưởng cyclotron ion biến đổi Fourier loại máy phân tích khối lượng để xác định tỷ lệ khối lượng điện tích ion dựa tần số cyclotron ion từ trường cố định) sử dụng để xác định đa dạng khác biệt protein tế bào tăng trưởng acetate so với protein tế bào tăng trưởng metanol Methanosarcina acetivorans phân lập biển mặt trao đổi chất đánh dấu 14 N so với 15N Nhiều 246 protein khác M acetivorans so sánh với 240 gen biểu khác báo cáo trước Methanosarcina mazei phân lập nước xác định phiên mã tế bào phát triển acetate so với tế bào phát triển metanol Sự khác biệt rõ ràng tiết lộ protein liên quan đến vận chuyển điện tử bảo tồn lượng So với tế bào phát triển metanol, M acetivorans phát triển acetate tổng hợp lượng lớn tiểu đơn vị mã hóa đơn vị phiên mã gen tương đồng với operon mã hóa phức hợp vận chuyển điện tử Rnf chuyển vị ion đặc trưng trước từ liên giới Vi khuẩn (domain bacteria) Kết hợp với phân tích trình tự sinh lý học, kết cho thấy M acetivorans thay phức hợp H2-evolving Ech hydrogenase loài Methanosarcina nước phức hợp Rnf, tạo gradient ion xuyên màng để tổng hợp ATP So với tế bào phát triển metanol, M acetivorans phát triển acetate tổng hợp lượng protein lớn mã hóa đơn vị phiên mã gen thích cho phức hợp Mrp báo cáo trước hoạt động antiporter (chất trao đổi) chuyển natri/proton liên giới Vi khuẩn Sự khác biệt báo cáo M acetivorans M mazei thích nghi M acetivorans với mơi trường biển Giới thiệu Việc chuyển đổi sinh khối điều kiện kị khí thành khí methane điều cần thiết cho chu trình carbon tồn cầu Hầu hết khí methane tạo quy trình hai bước chất hữu phức tạp lên men thành acetate, chất sau chuyển đổi thành khí methane carbon dioxide Quá trình tương tự chìa khóa để biến đổi sinh khối thực vật tái tạo thành khí methane (biomethanation: biometan hố q trình vật liệu hữu chuyển đổi vi sinh vật điều kiện yếm khí thành khí sinh học) nguồn lượng thay Việc sản xuất trồng lượng tái tạo cho q trình biometan hố đặc biệt thuận lợi để giảm lượng khí thải CO2 vào khí quyển, CO2 tạo cách đốt cháy khí methane tái chế thơng qua q trình quang hợp thực vật Sự hiểu biết đường chuyển đổi acetate thành methane quan trọng việc phát triển thơng số quy trình để kiểm sốt tối ưu hóa q trình biến đổi sinh học quy mô lớn sinh khối tái tạo Cơ sở cho hiểu biết việc xác định protein cần thiết cho đường hình thành khí methane từ acetate Cơ sở cho hiểu biết việc xác định protein cần thiết cho đường hình thành khí methane từ acetate Hồ sơ phiên mã loài nước Methanosarcina mazei (17) xác định gen điều chỉnh tăng để đáp ứng với phát triển axetat so với phát triển methanol, cho thấy vai trò protein mã hóa đặc trưng cho đường chuyển hóa acetate thành methane Kết cho thấy đường M mazei tương tự đường đề xuất trước loài Methanosarcina nước khác (8–10, 29) Một phân tích proteomic gần loài vi sinh vật biển Methanosarcina acetivorans sử dụng điện di gel hai chiều matrix -assisted laser desorption– time of flight tandem mass spectrometry (MS) (gel 2-D/MS) xác định 34 protein có nhiều tế bào phát triển acetate so với tế bào phát triển methanol (25, 26) Ở đây, chúng tơi báo cáo phân tích sâu cách sử dụng sắc ký lỏng (LC)–hybrid linear ion trap –Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR) MS để xác định protein phong phú khác từ tế bào tăng trưởng acetate so với tế bào tăng trưởng methanol đánh dấu chuyển hóa 14N so với 15N tương ứng Kết cung cấp hiểu biết chi tiết đường acetate loài vi sinh vật biển này, cho thấy khác biệt sâu sắc đường chuyển hóa acetate thành methane M acetivorans so với M mazei loài Methanosarcina nước khác Vật liệu phương pháp Tăng trưởng tế bào Các tế bào phát triển từ acetate M acetivorans nuôi cấy mô tả trước (25) Các tế bào sinh trưởng methanol nuôi cấy mô tả trước (25), ngoại trừ việc 14NH4Cl thay 15NH4Cl (98%) (Sigma, St Louis, MO) Các tế bào từ hai môi trường thu giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân mật độ quang học 600nm 0,8 0,6 môi trường acetate methanol, mô tả trước (25) Chiết xuất protein, điện di gel SDS-polyacrylamide (PAGE) phân hủy gel Tế bào từ khoảng 40 ml dịch nuôi cấy tái huyền phù 100 µl Tris-HCl 10 mM chứa mM MgCl2 100 U DNase (Roche, Indianapolis, IN) ủ đá 20 phút Phương pháp xử lý thực sau bổ sung 900 µl urê M chứa 0,05% sodium dodecyl sulfate (SDS) vortex phút Lysate toàn tế bào làm cách ly tâm 13.000 x g 20 phút 4°C Nồng độ chiết xuất protein toàn tế bào, xác định xét nghiệm Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA), từ tế bào tăng trưởng acetate methanol 5,8 3,5 mg/ml Chiết xuất toàn tế bào tế bào tăng trưởng acetate methanol kết hợp để tạo hỗn hợp 1:1 (khối lượng/trọng lượng) protein đánh dấu 14 N 15N Một phần dịch chiết chứa 40 µg hỗn hợp pha lỗng thành 45 µl với dung dịch đệm mẫu SDS-PAGE bao gồm 2% (wt/vol) SDS, 25% (vol/vol) glycerol, 100 mM dithiothreitol, 0,01% bromophenol xanh lam 62,5 mM Tris-HCl (pH 7) Mẫu phân giải a precast 12-well linear gradient Criterion TrisHCl gel từ 10,5 đến 14% (Bio-Rad, Hercules, CA) phát triển 160 V 50 phút Gel nhuộm bạc mô tả trước (32) Các (lanes) cắt thành 10 phân đoạn, phân đoạn chứa tổng mật độ gần giống ước tính cách kiểm tra trực quan với hỗ trợ nguồn sáng mờ Mỗi phần băm riêng thành khối ~1-mm3 rửa, phân hủy gel bước chiết xuất peptide mô tả trước (36), ngoại trừ việc thể tích dung dịch thêm vào cho bước điều chỉnh để phù hợp với thể tích miếng gel cho phần SDS-PAGE Sequencing-grade Trypsin (Promega, Madison, WI) sử dụng làm enzyme tiêu hóa Dung dịch chiết xuất peptide thu cho phân đoạn ( ~1,2 ml) cô đặc đến thể tích cuối ~ 30 ul hệ thống SPD1010 SpeedVac (Thermo Savant, Holbrook, NY) 45°C ống ly tâm siêu nhỏ 1,5 ml Xác định protein xác định tỷ lệ đa dạng Protein xác định từ chiết xuất peptide phần gel SDS-PAGE chiều cách sử dụng chiến lược (strategy) shotgun proteomics tương tự mô tả trước (42) Khoảng 10 µl dung dịch chiết xuất peptide nạp vào cột 100 dBx 15 cm chứa đầy với hạt MagicC18 5~um (Michrom BioResources, Auburn, CA) theo sau gradient tuyến tính (linear gradient) 75 phút từ 2% đến 35 % (vol/vol) acetonitril 0,1% axit formic sử dụng tốc độ dòng chảy 300-nl/min Thiết bị Hydrid linear ion trap-FTICR (LTQ FT MS; Thermo Electron, San Jose, CA) sử dụng để phân tích Trong chu kỳ thu thập liệu, lần quét biến đổi MS Fourier (FT) có độ phân giải cao với tích lũy lên đến x106 ion theo sau việc thu phổ MS song song cách sử dụng linear ion trap (tích lũy 3x104 ion) lên đến bảy số ion mạnh với loại trừ động học đặt phút Một chu kỳ thu thập liệu hoàn thành khoảng 3,5 giây Mỗi phần SDS-PAGE chiều phân tích hai lần Dữ liệu thu được tìm kiếm dựa sở liệu NCBI M acetivorans C2A hai tìm kiếm Sequest riêng biệt, tìm kiếm tương ứng với 14N tìm kiếm tương ứng với ghi nhãn 15N The precursor ion mass tolerance đặt thành ±1,4 Da trypsin định enzyme phân giải protein với tối đa hai lần phân cắt bị bỏ sót Để giảm thiểu tỷ lệ nhận dạng âm tính giả, peptides xác định giá trị tương quan chéo (Xcorr) lớn 1,5 (1) tái tạo LC/hybrid linear ion trap-FTICR MS chạy ban đầu chọn Chỉ peptit có dung sai khối lượng tiền chất (the precursor mass tolerance) ±10 ppm sau chấp nhận nhận dạng xác Trong khoảng 15% số lần nhận dạng peptide, đồng vị thứ hai ban đầu định làm ion tiền chất, dẫn đến dịch chuyển khối lượng 1-Da Trong trường hợp này, dịch chuyển hiệu chỉnh cho đỉnh đơn đồng vị trước áp dụng giới hạn độ xác khối lượng tiền chất 10 ppm Độ phong phú tương đối peptit xác định sau tính tốn chương trình phịng thí nghiệm phát triển (2) xác định tỷ lệ diện tích đỉnh sắc ký (chromatographic peak areas) cặp peptit đánh dấu đồng vị Để định lượng thành cơng, phải tìm cặp peptit 14N15N đồng rửa giải với peptit xác định cách sử dụng tiêu chí tìm kiếm sở liệu định chênh lệch khối lượng peptit tương ứng với số lượng nguyên tử nitơ chuỗi peptit Trong bước tiếp theo, tỷ lệ phong phú tương đối protein tính cách lấy trung bình tỷ lệ phong phú peptide xác định Điều quan trọng là, kết hợp dung sai khối lượng tiền chất (±10 ppm), giá trị Sequest Xcorr diện cặp đỉnh kết hợp cung cấp khả nhận dạng protein có độ tin cậy cao Phân tích sắc tố tế bào Các phần màng tế bào tế bào chất phân tách theo cách tương tự mô tả trước (21) Các tế bào tái tạo huyền phù dung dịch đệm Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) chứa DNase I (10 ug/ml) phá vỡ cách cho chúng lần qua máy ép tế bào áp lực Pháp (French pressure cell press: thiết bị sử dụng thí nghiệm sinh học để phá vỡ màng sinh chất tế bào cách đưa chúng qua van hẹp áp suất cao) 1,38x108 Pa Các mảnh vụn tế bào tách cách ly tâm 10.000 x g 20 phút 4°C Dịch chiết tế bào tách thành phần màng tế bào tế bào chất cách ly tâm 100.000 μg 60 phút 4°C Dung dịch phía loại bỏ màng chứa pellet rửa lần dung dịch đệm mô tả nối lại dung dịch đệm Nhuộm heme protein phân tách SDS-PAGE thực cách sử dụng o-dianisidine (Sigma) mô tả trước (35) Band 55-kDa tiết lộ cách nhuộm heme phần màng từ tế bào tăng trưởng acetate cắt bỏ chịu tiêu hóa gel chiết xuất peptide mô tả Các peptide phân tích LC/hydrid linear ion trap-FTICR MS Reduced-minus-oxidized-difference phân đoạn màng thu nhiệt độ phòng mô tả trước (22) cách sử dụng máy đo quang phổ Beckman DU-7400 Các mẫu oxy hóa khơng khí sau khử vài hạt dithionite RT-PCR Phiên mã ngược (RT)-PCR thực mơ tả trước (24), với sửa đổi RNA tổng số phân lập từ tế bào M acetivorans tăng trưởng axetat metanol cách sử dụng RNeasy Total RNA Mini (QIAGEN) RNA tinh khiết xử lý hai lần DNase I không chứa RNase (QIAGEN) lần RQ1 DNase (Promega) để loại bỏ DNA gây ô nhiễm RT-PCR thực với Access RT-PCR (Promega) sử dụng 50 đến 100 ng RNA tổng số tinh chế (trình tự mồi cặp mồi sử dụng liệt kê Bảng S1 S2 tài liệu bổ sung) PCR đối chứng thực mà không cần bổ sung RT với bốn mồi khác để xác nhận việc loại bỏ hoàn toàn DNA Kết thảo luận Xác định protein Các phân tích gel/MS 2-D trước M acetivorans phân lập biển xác định tổng cộng 412 gen sản phẩm Việc xác định cường độ điểm định có 34 sản phẩm gen khác tế bào phát triển axetat metanol Để có phân tích định tính định lượng sâu hơn, sử dụng cột ion tuyến tính LC/lai-FTICR MS để phân tích tế bào phát triển axetat metanol dán nhãn chuyển hóa 14N 15 N tương ứng Tổng cộng có 1.081 protein phát (dữ liệu chưa công bố), chiếm 21% số 4.524 gen báo cáo gen Trong số 1.081 protein phát hiện, 246 tìm thấy có khác biệt gấp lần tế bào phát triển axetat metanol xác định hai nhiều cặp peptit 246 protein coi đóng vai trị cụ thể tăng trưởng hình thành khí mê-tan từ metanol axetat Lịch sử phiên mã gần chủng phân lập nước M mazei phát 3.371 gen biểu hiện, 240 số cho thấy biểu khác biệt gấp 2,5 lần tế bào phát triển axetat metanol Trong số 246 protein khác xác định cho M acetivorans, 60 mã hóa gen tương đồng ≥2,5 lần biểu chuyên biệt M mazei Trong số 60 protein từ M acetivorans, mơ hình phong phú khác cho 57 protein phù hợp với hồ sơ phiên mã M mazei Hơn nữa, phương pháp báo cáo cho M acetivorans xác định 20 loại protein đa dạng khác trước xác định gel/MS 2-D so với mẫu phân tích tất 20 protein phù hợp với kết gel/MS 2-D Những kết chứng xác nhận mạnh mẽ phương pháp thử nghiệm sử dụng nghiên cứu Ở đây, tập trung vào protein chọn lọc có tính đa dạng khác biệt cao xác định hai phức hợp enzyme đề xuất liên quan đến chức vận chuyển điện tử M acetivorans phát triển axetat Con đường chuyển đổi acetate thành metan M.acetivorans Lịch sử phiên mã tế bào M mazei phát triển acetate so sánh với methanol cho thấy đường chuyển đổi acetate thành metan tương tự trước xác định loài Methanosarcina nước khác Tuy nhiên, M acetivorans phân lập từ trầm tích biển có chức chuyển đổi acetate thành metan trình phân hủy kỵ khí tảo bẹ khổng lồ Do đó, so sánh chủng phân lập nước M Mazei với protein M acetivorans có giá trị để xác định enzyme lõi thiết yếu đường dẫn acetate cách đánh giá tính linh hoạt trao đổi chất để đáp ứng với môi trường Phương pháp thử nghiệm tiên tiến sử dụng nghiên cứu xác định số protein không xác định phân tích gel/MS 2-D trước đó, dẫn đến hiểu biết chi tiết đường Hình Con đường tổng thể chia thành hai phần Phần liên quan đến việc chuyển đổi nhóm methyl acetate thành metan, gọi phản ứng carbon xúc tác enzyme thể màu xanh hình Hình Con đường đề xuất để chuyển đổi acetate thành metan M acetivorans ACK, acetate kinase; PTA, phosphotransacetylase; COA-SH, Coenzyme A; Thmpt, tetrahydromethanopterin; FDR, giảm ferredoxin; FDO, oxy hóa ferredoxin; CDH, CO dehydrogenase/acetyl CoA synthase; Com-sh, coenzyme m; MTR, methyl-THMPT: comSHYLTransferase; COB-SH, Coenzyme B; Cam, anhydrase carbonic; MA-RNF, M Acetivorans RNF; MP, methanophenazine; HDR-DE, heterodisulfide reductase; MRP, nhiều sức cản/pH điều chỉnh Na+ /H+ đối vận (antiporter); ATP, H -Transporting ATP synthase Phản ứng chuyển carbon xúc tác enzyme thể màu xanh lam (xem văn bản) Phản ứng truyền electron xúc tác enzyme thể màu xanh (i) Các phản ứng carbon dẫn đến metan Các kết thể Bảng phù hợp với vai trò đề xuất trước acetate kinase, phosphotransacetylase, CO dehydrogenase/acetyl coenzyme A (COA), methyltetrahydromethanopterin (THMPT) phân tích gel 2-D/MS Tuy nhiên, phương pháp tiên tiến sử dụng nghiên cứu tiếp tục cho thấy anhydrase carbonic (CAM; MA2536) có nhiều tế bào M acetivorans phát triển môi trường acetate, tương ứng với tăng điều hòa gen mã hóa enzyme M Mazei Sự tham gia enzyme việc chuyển đổi acetate thành metan lần báo cáo cho Methanosarcina thermophila trước đề xuất để tạo điều kiện cho việc loại bỏ CO2 khỏi tế bào cách chuyển đổi thành bicarbonate bên ngồi tế bào (Hình 1) Bảng Sự đa dạng protein đóng vai trị đường chuyển hóa Acetate thành Methane M acetivorans Tất enzyme đề xuất để xúc tác chuyển đổi nhóm methyl actetate thành metan M acetivorans (Hình 1) xác định loài Methanosarcina nước khác gần cách phân lập M Mazei nước Do đó, enzyme phản ứng coi cốt lõi đường chuyển đổi acetate thành metan lồi Methanosarcina mơi trương nước biển Tuy nhiên, kết trình bày phần cho thấy khác biệt đáng kể phản ứng vận chuyển điện tử đường acetate M acetivorans so với loài Methanosarcina nước khác (ii) Vận chuyển điện tử bảo toàn lượng Sự phong phú Cdh tế bào phát triển axetat so với tế bào phát triển metanol báo cáo trước (25, 26) xác nhận cho thấy bước vận chuyển điện tử đề xuất cho M acetivorans giống bước M mazei loài Methanosarcina nước khác, Cdh oxy hóa nhóm carbonyl acetyl-CoA cho điện tử cho ferredoxin (40, 41) Tuy nhiên, nêu chi tiết bên phần tiếp theo, vận chuyển điện tử từ ferredoxin khử sang CoM-S-S-CoB đề xuất cho M acetivorans (Hình 1) khác với vận chuyển loài nước Ở loài nước ngọt, ferredoxin khử đề xuất để tặng điện tử cho Ech hydrogenase gắn màng tạo H2 bơm proton màng (15, 28, 29) H2 bị oxy hóa hydrogenase khác tặng điện tử cho methanophenazine màng Cuối cùng, methanophenazine khử tặng electron cho heterodisulfide reductase làm giảm CoM-S-S-CoB, kèm theo đẩy proton Tuy nhiên, gen M acetivorans khơng chứa gen mã hóa Ech hydrogenase chức (11, 18), cho thấy thành phần vận chuyển điện tử thay liên quan đến việc chuyển điện tử sang CoM-S-S-CoB Các phân tích gel/MS 2-D trước sản phẩm MA0659 có tế bào M acetivorans nuôi cấy axetat; nhiên, mức độ phong phú so với tế bào phát triển metanol không xác định, điều ngăn cản việc đề xuất vai trò sản phẩm việc chuyển đổi hai chất thành metan (25) Tuy nhiên, người ta đưa giả thuyết MA0659 mã hóa sáu tiểu đơn vị phức hợp mã hóa cụm gen MA0659- 0664 với khả thay chức bơm ion Ech hydrogenase Ở đây, sản phẩm MA0659, MA0661 MA0664 có nhiều gấp nhiều lần tế bào phát triển axetat so với tế bào M acetivorans phát triển metanol (Bảng 1), hỗ trợ vai trị đường axetat Hơn nữa, phân tích RT-PCR cho thấy MA0658 MA0665 đồng phiên mã với MA0659-664 (Hình 2) Cuối cùng, việc xóa gen đồng phiên mã tạo đột biến M acetivorans phát triển axetat (P C W Metcalf, Đại học Illinois) Những kết cho thấy cách mạnh mẽ MA0658-0665 mã hóa phức hợp tám tiểu đơn vị hoạt động trình phát triển M acetivorans axetat Đáng ý, gen M mazei không chứa gen tương đồng với MA0658-0665 (18), hỗ trợ thêm cho vai trò phức hợp đặc trưng cho M acetivorans Hình Lập đồ phiên mã cụm gen M acetivorans RT-PCR (A) MA4566-MA4572 (B) MA0658-MA0665 Mũi tên đại diện gen hướng phiên mã Các sản phẩm RT-PCR dự đoán thể dòng bên gen dán nhãn chữ Dự đốn kích thước sản phẩm RT-PCR hiển thị ngoặc đơn Các chữ phía gel tương ứng với sản phẩm RT-PCR dự đoán RT-PCR thực với tổng số RNA từ tế bào M acetivorans ni cấy axetat Mặc dù MA0659-0664 thích mã hóa cho tiểu đơn vị sodium translocating NADH:ubiquinone oxyoreductase (Nqr), việc tìm kiếm sở liệu cho thấy trình tự axit amin có tương đồng lớn với tiểu đơn vị phức hợp Rnf (cố định đạm Rhodobacter) có liên quan, sắc lớn với cụm gen rnf thích cho Clostridium tetani (Hình 3) Phức hợp Rnf lần mô tả Rhodobacter capsulatus (34), nơi đề xuất để mã hóa phức hợp liên kết màng sáu tiểu đơn vị (20) (RnfABCDGE) oxy hóa NADH khử ferredoxin sau tặng điện tử cho nitrogenase (23, 34) Quá trình giả thuyết vận chuyển điện tử ngược không thuận lợi mặt nhiệt động thúc đẩy gradient điện hóa (27, 33) Trước trình đề xuất (23) phức hợp Rnf họ liên kết lượng hoạt động để tạo gradient điện hóa để tổng hợp ATP, phù hợp với chức đề xuất M acetivorans Ví dụ, trước người ta đề xuất phức hợp Rnf C tetani, mã hóa cụm gen Hình 3, oxy hóa ferredoxin làm giảm NAD kết hợp với trình loại natri bên ngồi màng tế bào (5) Hình Tổ chức gen so sánh trình tự gen M acetivorans với gen rnf mrp từ miền Bacteria (A) So sánh đơn vị phiên mã M acetivorans MA0658-0665 với cụm C tetani rnfCDGEAB (5) (B) So sánh đơn vị phiên mã M acetivorans MA45664572 với operon B subtilis mrpABCDEFG (19) Các số ngoặc đơn phần trăm danh tính protein mã hóa gen định mũi tên Hình Cấu trúc liên kết chức dự đoán cho MA0658-0665 sản phẩm gen M acetivorans Fdr, giảm ferredoxin; Fdo bị oxy hóa ferredoxin; Cyt c, sắc tố c; MP, methanophenazin Các tiểu đơn vị phức hợp Rnf từ R capsulatus (Rc-Rnf) phân tích đặc trưng trước (20, 23), dự đốn chức cho tiểu đơn vị phức hợp M acetivorans Rnf (Ma-Rnf) mã hóa MA0658-0665 (Hình 4) Các sản phẩm MA0660/ MA0662/MA0663 chia sẻ trình tự nhận dạng bảo tồn phân đoạn kỵ nước (không hiển thị) với RnfD/RnfE/RnfA đề xuất trước bao gồm kênh ion phức hợp RcRnf Do đó, sản phẩm MA0660/MA0662/MA0663 giả thuyết nằm phức hợp gắn màng có chức kênh ion để chuyển vị trí proton natri bên ngồi màng (Hình 4), tạo gradient ion điều khiển trình tổng hợp ATP (Hình 1) Trình tự axit amin MA0664/MA0659/MA0661 tương đồng với RnfB/RnfC/RnfG (Hình 5), mà trước đề xuất nằm phức hợp chuyển điện tử R capsulatus, đề xuất chức tương tự cho sản phẩm MA0664/ MA0659/MA0661 Hình So sánh trình tự axit amin suy từ MA0658-0665 với trình tự tiểu đơn vị Rnf từ Rhodobacter capsulatus (21) Dư lượng giống hệt định dấu hoa thị Các họa tiết Cysteine tương phản ngược lại bảng A B Threonine quy định cộng hóa trị liên kết FMN biểu thị mũi tên bên trình tự bảng C Các số bên phải biểu thị vị trí axit amin Trình tự bị cắt ngắn định Trình tự chỉnh với ClustalW Trình tự axit amin MA0664 giống với trình tự RnfB (Hình 5A), trước chứng minh có chứa cụm [2Fe-2S] cho tương tác với ferredoxin Do đó, sản phẩm MA0664 giả thuyết tương tác với ferredoxin (Hình 4) Đề xuất hỗ trợ trình tự axit amin MA0664, chứa bốn motif cysteine có khả nối bốn cụm [4Fe4S], ba số bảo tồn giống với RnfB (Hình 5A) Những kết phù hợp với vai trò sản phẩm MA0664 tạo thành “dây” dẫn điện tử lưu huỳnh sắt có nguồn gốc từ cụm ferredoxin sắt-lưu huỳnh Sản phẩm MA0659 có đồng với RnfC (Hình 5B), trước đề xuất có chức oxy hóa NADH chứa hai cụm [4Fe-4S] với flavin mononucleotide (FMN), trình tự axit amin MA0659 khơng có đồng thuận motif gắn với FMN Trình tự axit amin MA0659 có hai motif cysteine phù hợp với gắn hai cụm [4Fe-4S] (Hình 5B) Do đó, sản phẩm MA0659 cho mở rộng trình chuyển điện tử trung gian “dây” sắt-lưu huỳnh ferredoxin MA0661 (Hình 4) Sản phẩm MA0661 chia sẻ đặc điểm nhận dạng với tiểu đơn vị RnfG (Hình 5C), mở rộng thành motif (ETPGLGX37-43GAT) bảo tồn với tiểu đơn vị NqrC loài Vibrio (23) threonine đầu C motif liên kết cộng hóa trị FMN (3, 14, 30) Do đó, sản phẩm MA0661 giả thuyết có chứa FMN, nhận electron từ sản phẩm MA0659 (Hình 4) Mặc dù MA0658 (18) dự đoán protein, kiểm tra kỹ năm motif CXXCH motif CXXXCH phù hợp với cytochrome đa sắc tố loại c mà có liên kết cộng hóa trị heme với phối tử trục histidine Kết SDS-PAGE dung dịch ly giải toàn tế bào xác định hai dải protein tế bào phát triển axetat metanol nhuộm màu dương tính với heme, dải xấp xỉ 25 kDa dải lại 55 kDa (Hình 6A) Sản phẩm MA0658 có khối lượng phân tử tính tốn 55 kDa protein 55kDa nhuộm heme có nhiều tế bào tăng trưởng axetat tế bào tăng trưởng metanol, phù hợp với phong phú sản phẩm khác mã hóa MA06580665 cụm gen đồng phiên mã Những kết protein 55-kDa nhuộm heme mã hóa MA0658 chứa heme liên kết cộng hóa trị dự đốn từ trình tự axit amin SDS-PAGE nhuộm heme phần tế bào chất màng tế bào phát triển axetat (Hình 6B) sản phẩm MA0658 có liên quan đến màng Phân tích LC/bẫy ion tuyến tính lai-FTICR MS dải protein 55-kDa xác định hai peptit (Y121GLYDFDAR129 S481IAVTYDKPRPVEVET EPAL500) dành riêng cho sản phẩm MA0658 Hơn nữa, phổ sai biệt giảm-trừ-oxy hóa cho thấy mức độ phổ biến cytochrom loại c552 phần màng tế bào phát triển axetat (Hình 6C) Những kết sản phẩm MA0658 cytochrom c gắn màng Do đó, người ta đưa giả thuyết cytochrom c làm trung gian chuyển điện tử từ sản phẩm MA0661 sang methanophenazine (Hình 4) trình tăng trưởng với axetat Hình Phân tích cytochrom loại c M acetivorans (A) Các protein phân tách SDS-PAGE nhuộm heme từ dung dịch ly giải tồn tế bào (35 µg) tế bào tăng trưởng axetat (AC) tăng trưởng metanol (ME) (B) Các protein nhuộm heme phân tách SDS-PAGE (18 µg) từ phân số tế bào chất (AC-CF) màng (AC-MF) tế bào phát triển axetat (C) Phổ chênh lệch khử-trừ-oxy hóa phân số màng tế bào phát triển axetat metanol Mỗi hỗn dịch mem brane chứa mg/ml protein Mũi tên khối lượng phân tử gần dải xác định sau nhuộm với Coomassie brilliant blue R Trình tự axit amin MA0665 khơng liên quan đến loại protein có chức biết (18) Tuy nhiên, sản phẩm MA0665 thuộc họ (UPF0132) gồm protein nhỏ tích hợp màng xác định tất Archaea sinh khí mê-tan mà gen giải trình tự (18) Do đó, khơng thể dự đốn chức năng, sản phẩm MA0665 cho có liên kết với màng (Hình 4) Như thảo luận trên, kết trình bày bước cuối trình vận chuyển điện tử M acetivorans phát triển axetat trình khử heterodisulfide CoM-S-SCoB (Hình 1) Các sản phẩm MA0687 MA0688, thích để mã hóa hai tiểu đơn vị heterodisulfide reductase (HdrDE type) (18), tìm thấy tế bào phát triển axetat (Bảng 1), cho thấy tổng hợp enzyme Hơn nữa, phân tích RT-PCR (Hình 2) cho thấy q trình đồng phiên mã MA0687-0688 tế bào phát triển axetat HdrDE type có chức làm giảm CoM-S-S-CoB trình chuyển đổi metanol thành metan tất loài Methanosarcina nghiên cứu trước (6) Do đó, giả sử HdrDE type có chức đường metanol M acetivorans, mức độ phong phú tương đối tìm thấy tế bào tăng trưởng axetat so với loại tìm thấy tế bào tăng trưởng metanol (Bảng 1) cho thấy HdrDE type yếu tố đóng góp cho hoạt tính heterodisulfide reductase tế bào phát triển axetat HdrDE type đặc trưng từ M thermophila nuôi cấy axetat (37) Methanosarcina barkeri (16) Ở loài nước này, HdrDE type liên kết với hydrogenase (Vho) đề xuất oxy hóa H2 khử methanophenazine, chất tặng điện tử cho HdrDE Tuy nhiên, trường hợp khơng có Ech hydrogenase M acetivorans, người ta đưa giả thuyết methanophenazine làm trung gian chuyển điện tử trực tiếp từ phức hợp Ma-Rnf sang HdrDE mà khơng có tham gia H2 hydrogenase (Hình 1) Sơ đồ vận chuyển điện tử đề xuất trình chuyển đổi axetat thành mêtan M acetivorans (Hình 4) phù hợp với việc khơng có Ech hydrogenase có chức mã hóa gen (18) với đặc điểm sinh hóa trước cho thấy H2 khơng phải vật trung gian cho loài (31) Hơn nữa, phân tích di truyền gần kết luận M acetivorans sử dụng sơ đồ vận chuyển điện tử bảo tồn lượng chưa biết khác với sơ đồ loài Methanosarcina nước chỗ khơng liên quan đến H2 (13) Sự không liên quan H2 với tư cách chất mang điện tử bắt buộc tương thích với mơi trường biển mà từ M acetivorans phân lập (38) Trong mơi trường biển, lồi khử sunfat lấn át lồi sinh khí mê-tan H2 (44) Trừ H2 tiến hóa dẫn truyền bên theo chế chưa biết, lượng đáng kể bị lồi khử sunfat Do đó, M acetivorans phát triển sơ đồ vận chuyển điện tử không liên quan đến H2, trái ngược với loài nước Người ta muốn giả định phức hợp Ma-Rnf bơm natri để tạo gradient natri trực tiếp gián tiếp thúc đẩy trình tổng hợp ATP, phù hợp với giống Ma-Rnf với phức hợp Nqr bơm natri loài sinh vật biển (4, 43) Thật vậy, vai trò bơm natri trước đề xuất (5) cho phức hợp Rnf tương đồng C tetani (Hình 3) Bộ gen M acetivorans thích cụm bảy gen (MA4566-72) mã hóa cho phức hợp Mrp (điều hòa đa kháng/pH) mà sản phẩm hai gen (MA4567 MA4568) có nhiều đáng kể tế bào phát triển axetat , cho thấy vai trò phức hợp Mrp q trình tăng trưởng với axetat Phân tích RT-PCR cho thấy biểu gen MA4566-72 đơn vị phiên mã (Hình 2) Sự tương đồng gen mã hóa phức hợp Mrp tìm thấy nhiều loài khác từ domain Bacteria, bao gồm Bacillus subtilis (Hình 3B) Đây chứng báo cáo tổng hợp phức hợp Mrp domain Archaea Một chức Mrp B subtilis chức chất phản chuyển natri/proton thứ cấp (19); đó, chức khả thi Mrp M acetivorans chuyển đổi gradient natri thành gradient proton thúc đẩy trình tổng hợp ATP enzym tổng hợp ATP synthase loại A1A0 chuyển vị proton (Hình 1) có nhiều tế bào phát triển acetate (Bảng 1) ) Trước người ta lưu ý (19) tiểu đơn vị phức hợp Mrp từ domain Bacteria có tính đồng cao với số tiểu đơn vị NADH dehydrogenase chuyển vị proton hệ thống hydrolyase hình thành từ Escherichia coli, người ta đưa giả thuyết phức hợp Mrp hoạt động phức hợp loại ion sơ cấp cung cấp lượng vận chuyển điện tử Bộ gen M mazei khơng thích để mã hóa phức hợp Mrp (18), phù hợp với vai trò phức hợp cụ thể M acetivorans môi trường biển Rõ ràng, kết trình bày mời điều tra chức tiềm Kết luận So sánh toàn cầu điều hịa biểu gene q trình tổng hợp protein loài methanoarchaeal đứa gợi ý khác biệt lớn đường chuyển đổi axetat thành mêtan loài nước sinh vật biển Kết cho thấy thích nghi M acetivorans với môi trường biển sử dụng hai phức hợp protein đa tiểu đơn vị, tìm thấy domain Bacteria, để vận chuyển điện tử bảo tồn lượng ... protein cần thiết cho đường hình thành khí methane từ acetate Cơ sở cho hiểu biết vi? ??c xác định protein cần thiết cho đường hình thành khí methane từ acetate Hồ sơ phiên mã loài nước Methanosarcina. .. cho đường chuyển hóa acetate thành methane Kết cho thấy đường M mazei tương tự đường đề xuất trước loài Methanosarcina nước khác (8–10, 29) Một phân tích proteomic gần loài vi sinh vật biển Methanosarcina. .. triển axetat Con đường chuyển đổi acetate thành metan M .acetivorans Lịch sử phiên mã tế bào M mazei phát triển acetate so sánh với methanol cho thấy đường chuyển đổi acetate thành metan tương tự