Nhân giống in vitro cây sâm bố chính abelmoschus sagittifolius (kurz) merr từ hạt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Tên đề tài: Nhân giống in vitro sâm bố Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr từ hạt KHOA: CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP – MÔI TRƯỜNG GVHD: TS NGUYỄN TRẦN ĐÔNG PHƯƠNG BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Tên đề tài: Nhân giống in vitro sâm bố Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr từ hạt KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP – MÔI TRƯỜNG GVHD: TS NGUYỄN TRẦN ĐÔNG PHƯƠNG LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em muốn gửi lời cảm ơn chân thành cho Ban Giám Hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện học tập rèn luyện tốt kể hoành cảnh đại dịch Covid – 19 xảy khắp nơi Người thứ hai mà em muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Nguyễn Trần Đông Phương, người trực tiếp hướng dẫn, dạy bảo truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt trình học tập thực đề tài Tiếp theo chị Trinh Khu nông nghiệp Công nghệ cao hỗ trợ hạt giống để em thực đề tài Đồng thời, em chân thành cảm ơn bạn thành viên phòng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào thực vật giúp đỡ, hỗ trợ chia sẻ khó khăn trình học tập thực đề tài Và lời cuối cùng, xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình Cảm ơn tình cảm, quan tâm lo lắng lời động viên giúp có thêm động lực tự tin bước tiếp đường học vấn đường đời i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan chi Abelmoschus Tổng quan sâm bố (Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr.) 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.2.1.1 Khu vực phân bố 1.2.1.2 Phân loại 1.2.1.3 Thành phần hoá học tác dụng dược lý 1.2.2 Tình hình nghiên cứu Sâm Bố Chính Việt Nam 1.2.2.1 Nguồn gốc phân loại 1.2.2.2 Đặc điểm hình thái 1.2.2.3 Đặc điểm sinh thái 1.2.2.4 Những nghiên cứu tác dụng dược lý cơng dụng Chất điều hồ sinh trưởng thực vật GA3 BA 10 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 Vật liệu 12 2.1.1 Địa điểm thời gian thực 12 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 12 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 12 2.1.4 Điều kiện nuôi cấy 12 2.1.5 Môi trường nuôi cấy 12 2.1.6 Hoá chất 13 Phương pháp thu thập, tổng hợp tài liệu 13 Phương pháp thống kê 13 ii Phương pháp nghiên cứu chính: 13 2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng tiền xử lý GA3 đển khả nảy mầm hạt sâm bố 13 2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi sâm bố 14 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16 Khảo sát ảnh hưởng tiền xử lý GA3 đến khả nảy mầm hạt sâm bố 16 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi sâm bố 18 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 20 Kết luận 20 Kiến nghị 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 Tài liệu nước 21 Tài liệu nước 22 Phụ lục 24 iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AEL Abelmoschus esculentus BA - Benzylaminopurine Cs Cộng ĐC Đối chứng GA3 Gibberellic acid MS Murashige & Skoog iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ GA3 nảy mầm hạt sâm bố 14 Bảng 2.2 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi sâm bố 15 Bảng 3.1 Ảnh hưởng tiền xử lý GA3 đến khả nảy mầm hạt sâm bố 16 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BA đến khả nhân nhanh chồi hạt sâm bố 18 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sâm bố Hình 3.1 Hạt sâm bố sau ngâm GA3 nuôi cấy môi trường MS có bổ sung BA mg/L sau 30 ngày ni cấy 17 Hình 3.2 Cây sâm bố ni cấy in vitro từ hạt ngâm GA3 30 mg/L nuôi cấy môi trường MS có bổ sung BA mức nồng độ khác sau 30 ngày nuôi cấy .19 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm vùng nhiệt đới gió mùa, mùa thay đổi quanh năm, thấy hệ thực vật nước ta vô phong phú, đa dạng đặc sắc Cây cỏ nước ta không dùng làm thực phẩm cho người mà kho dược liệu quý, tạo nên nguồn dược liệu đa dạng hữu ích Những loại thảo dược vốn sử dụng Đông y từ xa xưa, ngày tin dùng nguồn gốc tự nhiên có lợi cho sức khỏe Hiện nay, toàn giới Việt Nam, xu hướng nghiên cứu nhiều loài thực vật sử dụng sản phẩm tự nhiên ngày gia tăng Vì vậy, việc nghiên cứu để phát triển thuốc sản phẩm thuốc từ thực vật xu hướng quan tâm Sâm bố (Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr.) thuộc chi Abelmoschus, họ Bơng (Malvaceae) Rễ lồi y học cổ truyền sử dụng vị thuốc bổ cho thể, dùng thể suy nhược, ăn, ngủ, thần kinh suy nhược,… Ở Trung Quốc, người ta xem rễ, có tác dụng tư âm nhiệt, nung bạt độc, rễ dùng chữa lao phổi, ho phổi khô, sản hậu tiện bí, thần kinh suy nhược, mụn nhọt sưng lở Ở Việt Nam, Sâm bố sử dụng loài dược liệu quý, nhiên chưa có nghiên cứu đầy đủ để chứng minh cơng dụng lồi Gần đây, nhà khoa học tìm hoạt chất có hoạt tính sinh học Sâm Bố Chính Các nghiên cứu De-Li Chen et al (2016) tìm thấy thân củ Sâm Bố Chính chứa hợp chất sesquiterpenoid quinone - Acyl hibiscone B, hợp chất gây độc tế bào đáng kể giúp chống lại dòng tế bào ung thư người Hela HepG-2 Hiện nay, với lợi ích kinh kế tiềm dược liệu to lớn nhu cầu khai thác sâm bố ngày tăng Từ trước đến nay, đa phần dược liệu có khai thác chủ yếu từ thiên nhiên, nhiên việc khai thác mức làm cho sản lượng dược liệu tự nhiên giảm dần Thêm vào đó, diện tích đất rừng đất nơng nghiệp canh tác giảm theo việc chuyển đổi mục đích sử dụng đất làm cho nguồn dược liệu bị thiếu hụt, có sâm bố Thấy rõ khó khăn hạn chế sản lượng sâm bố Việt Nam tiềm to lớn tính dược liệu mà sâm bố mang lại nên chúng tơi chọn đề tài “Nhân giống in vitro sâm bố Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr từ hạt” với mục tiêu tìm mơi trường thích hợp cho hạt nảy mầm phát triển chiều cao sâm bố • Sử dụng mơi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/L, agar g/L chất điều hòa tăng trưởng thực vật GA3, BA (nồng độ thay đổi theo mục đích thí nghiệm) 2.1.6 Hố chất • Cồn 70o 90o • BA • GA3 Phương pháp thu thập, tổng hợp tài liệu • Thu thập, nghiên cứu tài liệu cơng bố ngồi nước nghiên cứu có liên quan Phương pháp thống kê • Sử dụng phần mềm Statgraphics Plus 3.0 phần mềm excel • Phân tích phương sai (ANOVA – analysis of variance) để so sánh khác biệt nghiệm thức • So sánh giá trị trung bình kiểm định Duncan Phương pháp nghiên cứu chính: 2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng tiền xử lý GA3 đển khả nảy mầm hạt sâm bố Mục đích thí nghiệm: Tìm nồng độ thích hợp giúp hạt giống sâm bố nảy mầm thích hợp Vật liệu thí nghiệm: Hạt giống sâm bố Mơ tả thí nghiệm: Hạt giống sâm bố rửa với xà phòng vòi nước, khử trùng qua cồn 70o phút, sau ngâm Javel 50 % 20 phút Sau khử trùng xong, đem ngâm hạt giống với dung dịch GA3 120 phút mức nồng độ khác theo bảng 2.1 Sau đó, cấy hạt vào mơi trường MS bổ sung sucrose 30 g/L, pH 5,8, BA mg/L 13 Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, nghiệm thức lặp lại lần, hạt bình thuỷ tinh 500 mL Thời gian theo dõi: 30 ngày Chỉ tiêu đánh giá: Tỉ lệ nảy mầm hạt Bảng 2.1 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ GA3 nảy mầm hạt sâm bố Nghiệm thức Nồng độ GA3 (mg/L) ĐC G1 10 G2 20 G3 30 2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi sâm bố Mục đích thí nghiệm: Tìm nồng độ thích hợp để phát triển chiều cao tốt Vật liệu thí nghiệm: Hạt giống sâm bố Mơ tả thí nghiệm: Hạt giống sâm bố rửa với xà phịng vịi nước, khử trùng qua cồn 70o phút, sau ngâm Javel 50 % 20 phút Sau khử trùng xong, đem ngâm hạt giống với dung dịch GA3 nồng độ 30 mg/L vòng 120 phút Sau tiến hành ni cấy in vitro môi trường MS bổ sung sucrose 30g/L, pH 5,8, BA nồng độ khác theo bảng 2.2 Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, nghiệm thức lặp lại lần, hạt bình thuỷ tinh 500 mL Thời gian theo dõi: 30 ngày Chỉ tiêu đánh giá: Số lượng cây, chiều cao 14 Bảng 2.2 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi sâm bố Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/L) ĐC B1 B2 B3 15 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết Khảo sát ảnh hưởng tiền xử lý GA3 đến khả nảy mầm hạt sâm bố Kết thu từ bảng 3.1 cho thấy hạt sâm bố ngâm dung dịch GA3 mừng nồng độ khác cho tỷ lệ mầm tốt so với không ngâm dung dịch GA3, nồng độ 30 mg/L cho kết tốt So sánh với kết nghiên cứu Trịnh Thị Hương cs (2019), tiền xử lý hạt sâm bố với dung dịch GA3 nồng độ 20 mg/L thời gian 120 phút cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao (82,00%), mức nồng độ 30 mg/L tỷ lệ hạt nảy mầm đạt 56,00% Đối với nghiên cứu Phan Duy Hiệp cs (2014), cho thấy tiền xử lý hạt sâm bố với GA3 120 phút mức nồng độ 30 mg/L giúp nâng cao tỷ lệ nảy mầm hạt (55,60%) Dựa vào nghiên cứu cho thấy GA3 ảnh hưởng lớn tới trình nảy mầm mơi trường in vitro hạt sâm bố Ngồi ra, GA3 ảnh hưởng đến chiều cao con, nghiệm thức hạt sâm bố tiền xử lý GA3 cho cao nhiều so với nghiệm thức không xử lý Bảng 3.1 Ảnh hưởng tiền xử lý GA3 đến khả nảy mầm hạt sâm bố Nghiệm thức Số hạt nảy mầm ( hạt / bình ) ĐC 0,4c G1 3,2a G2 2,0b G3 3,2a 16 Các chữ a, b, c khác cột khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95% ĐC G1 G2 G3 Hình 3.1 Hạt sâm bố sau ngâm GA3 ni cấy mơi trường MS có bổ sung BA mg/L sau 30 ngày nuôi cấy ĐC - Đối chứng G1, G2, G3 tương ứng với GA3 mức nồng độ 10; 20; 30 mg/L 17 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi sâm bố Kết từ thí nghiệm cho thấy, nghiệm thức nảy mầm tốt, khơng có khác biệt có ý nghĩa qua thống kê Xét chiều cao, nghiệm thức có bổ sung BA môi trường cho kết chiều cao tốt hẳn so với với nghiệm thức không bổ sung với BA môi trường Theo nghiên cứu Trịnh Thị Hương cs (2019), mẫu chồi nuôi cấy mơi trường BA từ - mg/L có chiều cao từ 1,42 – 3,38 cm Lý cho vấn đề xét đến yếu tố BA Ở thí nghiệm này, hạt giống nảy mầm trực tiếp thành mà không tạo chồi nên BA trực tiếp ảnh hưởng đến chiều cao Trong đó, thí nghiệm Trịnh Thị Hương cs (2019) tạo chồi nên BA tập trung vào trình tạo cụm chồi nên chiều cao chồi in vitro thấp so với in vitro Bảng 3.2 Ảnh hưởng BA đến khả nhân nhanh chồi hạt sâm bố Nghiệm thức Số (cây / bình) Chiều cao (cm) ĐC 2,8a 5,36b B1 3,2a 8,12a B2 2,8a 8,70a B3 2,6a 8,00a Các chữ a, b, c, d khác cột khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95% 18 ĐC B1 B2 B3 Hình 3.2 Cây sâm bố ni cấy in vitro từ hạt ngâm GA3 30 mg/L nuôi cấy môi trường MS có bổ sung BA mức nồng độ khác sau 30 ngày nuôi cấy ĐC - Đối chứng B1, B2, G3 tương ứng với BA mức nồng độ 1; 2; mg/L 19 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Tiền xử lý hạt sâm bố vịng 120 phút với nồng độ GA3 30 mg/L giúp tăng nâng cao tỷ lệ nảy mầm chiều cao Mơi trường thích hợp để tăng chiều cao sâm bố mơi trường MS có bổ sung nồng độ từ BA mg/L, sucrose 30 g/L, pH 5,8 Kiến nghị Nếu có thời gian, điều kiện làm nghiên cứu thêm: − Khảo sát thêm ảnh hưởng chất điều hoà sinh trưởng NAA đến khả tạo rễ của mơ sâm bố 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước − Trịnh Thị Hương cs (2019) Nghiên cứu nhân giống in vitro sâm bố (Hibiscus sagittifolius Kurz) thông qua nuôi cấy từ hạt đốt thân Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 216-221 − Dương Thị Phương Thảo (2021) Nghiên cứu đặc điểm thực vật đánh giá sơ chất lượng dược liệu Sâm bố (Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr.) Việt Nam − Trần Công Luận Bùi Trần Minh Phương (2011), "Khảo sát thành phần hóa học rễ sâm bố (Hibiscus sagittifolius Kurz Malvaceae) trồng Bạc Liêu" Tạp chí Dược liệu, 5, 339-441 − Trần Cơng Luận, Trần Đình Hợp, Nguyễn Cơng Đức (2005), Nghiên cứu loài mang tên Sâm Lộc Ninh - Bình Phước Sở Khoa học Cơng nghệ Bình Phước − Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, tập 2, NXB Y học, 666 − Phan Văn Đệ cs (2001), Khảo sát hình thái, giải phẫu thành phần hóa học Sâm bố (Abelmoschus sagittifolius Kurz Merr.) mọc hoang trồng, Kỷ yếu cơng trình nghiên cứu khoa học cơng nghệ 2001-2005, Viện dược liệu − Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, 813-815 − Đào Thị Vui (2007), Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng dược lý theo hướng điều trị loét dày rễ củ sâm báo (Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr Họ Bông (Malvaceae), Luận văn Tiến sĩ, Hà Nội, 140 − Lê Thị Diên, (2004 - 2006), Xây dựng mơ hình phát triển thuốc nam đất rừng giao có tham gia cộng đồng kết hợp với đào tạo thôn Hà An, xã Hương Phú, huyện Nam Đông, tỉnh Thừa Thiên Huế − Phan Duy Hiệp cs (2014), Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên phát sinh hình thái số giống sâm bố 21 (Hibiscus sagittifolius Kurz) điều kiện in vitro Tạp chí Cơng Nghệ Sinh Học 36(1se): 266-271 − Phạm Hồng Hộ (2006), Cây có vị thuốc Việt Nam, NXB Trẻ, Tp Hồ Chí Minh, 112 − Nguyễn Thị Thu Hương cs (2005), "Một số tác dụng dược lý Sâm bố thập tử Harmand thu hái Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước", Kỷ Yếu cơng trình Nghiên cứu khoa học 2001-2005, Viện dược liệu Tài liệu nước − Chen, D L., Zhang, X P., Ma, G X., Wu, H F., Yang, J S., & Xu, X D (2016) A new sesquiterpenoid quinone with cytotoxicity from Abelmoschus sagittifolius Natural product research, 30(5), 565-569 − Patil, P., Sutar, S., Joseph, J K., Malik, S., Rao, S., Yadav, S., & Bhat, K V (2015) A systematic review of the genus Abelmoschus (Malvaceae) Rheedea, 25(1), 14-30 − L G Monte, T Santi-Gadelha, L B Reis, E Braganhol, R F Prietsch, O A Dellagostin, E Lacerda RR, C A Gadelha, F R Conceicao and L S Pinto (2014), "Lectin of Abelmoschus esculentus (okra) promotes selective antitumor effects in human breast cancer cells", Biotechnol Lett, 36(3), 461469 − T Yan, T Nian, Z Liao, F Xiao, B Wu, K Bi, B He and Y Jia (2020), "Antidepressant effects of a polysaccharide from okra (Abelmoschus esculentus (L) Moench) by anti-inflammation and rebalancing the gut microbiota", Int J Biol Macromol, 144, 427-440 − Y Chen, G Cai, X Sun and X Chen (2016), "Treatment of chronic kidney disease using a traditional Chinese medicine, Flos Abelmoschus manihot (Linnaeus) Medicus (Malvaceae)", Clin Exp Pharmacol Physiol, 43(2), 145148 − M Z Gul, L M Bhakshu, F Ahmad, A K Kondapi, I A Qureshi and I A Ghazi (2011), "Evaluation of Abelmoschus moschatus extracts for 22 antioxidant, free radical scavenging, antimicrobial and antiproliferative activities using in vitro assays", BMC Complement Altern Med, 11, 64 − Y Z Chen, Z X Gong, G Y Cai, Q Gao, X M Chen, L Tang, R B Wei and J H Zhou (2015), "Efficacy and safety of Flos Abelmoschus manihot (Malvaceae) on type diabetic nephropathy: A systematic review", Chin J Integr Med, 21(6), 464-472 Trang web − http://www.theplantlist.org/browse/A/Malvaceae/Abelmoschus/ 23 PHỤ LỤC • Thành phần môi trường MS (Murashige Skoog) BẢNG 1: THÀNH PHẦN MUỐI KHOÁNG CƠ BẢN (mg/L) Skoog I Skoog II Skoog III NH4NO3 1650,0 KNO3 1900,0 KH2P04 170,00 MgSO4.7H2O 370,00 CaCl2.2H2O 440,00 Na2EDTA 37,30 FeSO4.7H2O 27,80 Mn2SO4.4H2O 22,30 H3BO3 6,20 ZnSO4.7H2O 8,6 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 BẢNG 2: THÀNH PHẦN VITAMIN CỦA MOREL (mg/L) Morel’s Vitamin Pirydoxine (B6) 1,00 Biotin (II) 0,01 Nicotinic Acid (P.P) 1,00 Thiamin-HCl (B1) 1,00 Pantotheate-Ca 1,00 Meso-inositol 100,00 • Phân tích thống kê ANOVA 24 Khảo sát ảnh hưởng tiền xử lý GA3 đến khả nảy mầm hạt sâm bố 25 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi sâm bố 26 27 ... có sâm bố Thấy rõ khó khăn hạn chế sản lượng sâm bố Việt Nam tiềm to lớn tính dược liệu mà sâm bố mang lại nên chọn đề tài ? ?Nhân giống in vitro sâm bố Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr từ hạt? ??... ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Tên đề tài: Nhân giống in vitro sâm bố Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr từ hạt KHOA: CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP... 2016) Tổng quan sâm bố (Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr. ) 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.2.1.1 Khu vực phân bố Trên giới, loài Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr phân bố khu vực châu