THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN 33Số 70 Tháng 3/2022 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG BẢO VỆ TẾ BÀO KHỎI CÁC BỨC XẠ ION HÓA CỦA EPIGALLOCATECHIN GALLATE BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) Mục đích của n[.]
THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG BẢO VỆ TẾ BÀO KHỎI CÁC BỨC XẠ ION HÓA CỦA EPIGALLOCATECHIN GALLATE BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) Trần Thị Nhàn cộng Trường Đại học Điện Lực (EPU) Mục đích nghiên cứu đánh giá khả bảo vệ tế bào epigallocatechin gallate (EGCG) chiết xuất từ chè xanh khỏi ảnh hưởng xạ ion hóa Để đạt mục tiêu đề nghiên cứu tiến hành thực nghiệm sau: Tế bào nấm men nuôi cấy môi trường YDP lỏng chứa chiết xuất nấm men, peptone dextrose/glucose với có khơng có EGCG, chiếu xạ tia X tia gamma với liều xạ 50 100 Gy Ribonucleic acid (RNA) polymerase, enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp RNA thông tin (mRNA) từ khuôn DNA, chiết xuất từ tế bào nấm men chiếu xạ Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) áp dụng để tạo khuếch đại ngẫu nhiên RNA polymerase mẫu chiếu xạ Sử dụng kỹ thuật PCR, nhận thấy RNA thông tin cho việc tổng hợp protein từ DNA tổn thương đứt gẫy sợi đơn chiếu xạ tia X tia gamma với liều 50 kGy giảm từ 1,01 1,17 lần xuống 0,72 lần 0,57 lần bổ sung 500µM EGCG Đối với tế bào bị chiếu xạ với liều 100Gy, đại lượng giảm từ 1,07 1,90 lần xuống 0,79 lần 0,52 lần, tương ứng Kết nghiên cứu chứng tỏ EGCG có hiệu việc bảo vệ chống lại tổn thương sợi đơn DNA gây xạ ion hóa GIỚI THIỆU Bức xạ ion hóa sinh từ trình phân rã hạt nhân khơng ổn định khử kích thích nguyên tử hạt nhân chúng lò phản ứng hạt nhân, máy tia X, cyclotron thiết bị khác Bức xạ ion hóa gây thay đổi cấu trúc chức dẫn đến tổn thương tế bào chí gây chết tế bào Bức xạ ion hóa tạo gốc tự công đại phân tử sinh học DNA, protein, lipid phân tử khác tế bào Các phân tử DNA mục tiêu quan trọng xạ, việc chiếu xạ gây tổn thương nghiêm trọng phân tử DNA, dẫn đến đột biến chí chết tế bào Bức xạ ion hóa gây loạt tổn thương DNA đứt sợi đơn (SSB) liên kết phosphodiester, đứt sợi kép (DSB) vị trí đối lập bị dịch chuyển, tổn thương sở, liên kết chéo protein- DNA protein-protein (1,2,3) Có hai chế tương tác xạ ion hóa DNA Một liên quan đến ion hóa nguyên tử DNA (tác động trực tiếp), liên quan đến công gốc tự tạo phóng xạ phân tử nước xung quanh (tác động gián tiếp) (1) Epigallocatechin 3-Gallate (EGCG) thành phần trà xanh este epigallocatechin axit gallic, thuộc nhóm polyphenol catechin Tác dụng có lợi EGCG báo cáo nhiều mơ hình bệnh gan động vật tổn thương thiếu máu cục / tái tưới máu, gan nhiễm mỡ, tổn thương gan rượu ung thư (4,5) EGCG với polyphenol trà xanh khác thể đặc tính ức chế tăng trưởng nhiều dòng tế bào khối u (6) Một số chế đề xuất nhờ hợp chất phát huy tác dụng chống khối u: chúng bao gồm Số 70 - Tháng 3/2022 33 THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN phong tỏa yếu tố tăng trưởng liên kết với thụ thể chúng (10), q trình phosphoryl hóa (hoạt hóa) kinase protein kích hoạt mitogen (MAPK) (7,8) dẫn đến quan sát thấy cảm ứng enzym chuyển hóa thuốc giai đoạn II (9,10) Sự đời phản ứng chuỗi polymerase (PCR) biến đổi hoàn toàn khoa học sinh học từ thời điểm Mullis phát lần (3) PCR trình đơn giản sử dụng rộng rãi lượng nhỏ DNA khuếch đại thành nhiều Ngồi tính nhanh chóng mà xét nghiệm hoạt động, chứng minh cách định lượng mức độ diện trình tự cụ thể (3,4) Axit ribonucleic Messenger (mRNA) phân tử RNA sợi đơn tương ứng với trình tự di truyền gen đọc ribosome trình tổng hợp protein Mehtod PCR sử dụng để sàng lọc đột biến đoạn gen hprt Aghamohammadi el al (11) Trong nghiên cứu này, nghiên cứu khả bảo vệ EGCG đứt gãy sợi đơn DNA tế bào chiếu xạ cách sử dụng mồi để khuếch đại RNA polymerase, loại enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp mRNA từ DNA bị hư hỏng, thông qua khả điều chỉnh thấp 2.2 Chiếu xạ Trong nghiên cứu này, hai thí nghiệm tiến hành riêng biệt với chiếu xạ tia X tia gamma Bức xạ tia X thực máy LINAC Viện Nghiên cứu Kỹ thuật Hạt nhân (Đại học Fukui, Nhật Bản) với mẫu nấm men với tổng liều lượng 0, 50 100 Gy tốc độ liều 15 kGy/h Bức xạ tia gamma tiến hành với liều lượng (50 100 Gy) tốc độ liều thấp (5 kGy/h) nguồn 60Co Phịng thí nghiệm xạ Viện Nghiên cứu Khoa học Công nghiệp (ISIR, Đại học Osaka, Nhật Bản) 2.3 Biểu gen Tổng số RNA tế bào tách chiết cách sử dụng RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) Hai microgam RNA phiên mã ngược cách sử dụng hệ thống tổng hợp Superscript First Strand để chuyển đổi thành cDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA) Một phần mẫu từ phản ứng sử dụng làm khuôn mẫu để khuếch đại PCR với mồi Rad4 Rad4 primer protein nhận dạng tổn thương DNA (đứt sợi đơn) cần thiết cho trình sửa chữa cắt bỏ nucleotide gen toàn cầu Saccharomyces cerevisiae Cấu trúc đoạn mồi thể Bảng Bảng Cấu trúc đoạn mồi Rad4 [4] MẪU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu nghiên cứu Tế bào nấm men từ Công ty Takara Bio (Shinga, Nhật Bản) nuôi cấy môi trường chiết xuất nấm men-peptone-dextrose (YPD) có khơng có EGCG (500 μM), thêm vào ml môi trường nuôi cấy YPD để tế bào phát triển Các tế bào nuôi cấy 24 30°C lắc Các mẫu cấy bão hòa sử dụng để cấy vào môi trường tươi, mẫu cấy ủ thêm 30°C trước bắt đầu thí nghiệm EGCG mua từ Nacalai Tesque, Inc, Nhật Bản với độ tinh khiết ≥ 99,5% 34 Số 70 - Tháng 3/2022 Quá trình khuếch đại PCR thực hỗn hợp phản ứng 50 μL Hỗn hợp bao gồm 25 μL Bộ đệm phản ứng Taq tiêu chuẩn, μL mồi (15 pmol), μL RNA 22 μL nước Quá trình khuếch đại thực cách sử dụng tuần hoàn nhiệt lập trình 42oC 30 phút, 95oC phút, 50 chu kỳ 95oC 10 giây, 60oC 30 giây 72oC 30 giây, cuối bước kéo dài 72oC 10 giây bảo quản 10oC Thay đổi vòng lặp thước đo mơ tả mức độ thay THƠNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN đổi đại lượng phép đo ban đầu phép đo Axit ribonucleic Messenger (mRNA) phân tử RNA sợi đơn tương ứng với trình tự di truyền gen đọc ribosome trình tổng hợp protein [5] Sự thay đổi vịng lặp mRNA xác định theo công thức đây: (1) KẾT QUẢ Hình Sự thay đổi vịng lặp mRNA DNA nấm men chiếu xạ tia gamma có khơng có 500µM EGCG Sự thay đổi vòng lặp mRNA DNA chiếu xạ tia X có khơng có EGCG trình Kết với chiếu xạ tia X chiếu xạ tia gamma bày Hình cho thấy có EGCG, số lần thay đổi mRNA thấp so với số lần đối chứng Điều có nghĩa có 500 µM EGCG, số lượng đứt gãy sợi đơn DNA nhỏ so với trường hợp khơng có thuốc thử KẾT LUẬN EGCG hoạt động tác nhân ức chế phá hủy phân tử xạ ion hóa gây BioHình Sự thay đổi vịng lặp mRNA DNA flavonoid có chứa EGCG có tác dụng bảo vệ đối nấm men chiếu xạ tia X có với tổn thương DNA gốc hydroxyl gây khơng có 500µM EGCG Một chế giải thích tác dụng bảo Như thấy Hình 1, EGCG bảo vệ vệ flavonoid DNA tham gia DNA khỏi bị hư hại xạ ion hóa gây Tổn ion kim loại chelat, chẳng hạn đồng thương DNA giảm rõ ràng có EGCG Ở sắt (phản ứng Fenton) chiếu xạ tia X 50 Gy với diện 500 Các flavonoid tạo phức với đồng sắt ngăn µM EGCG, thay đổi vòng lặp mRNA giảm từ cản việc tạo loài trung gian phản ứng, 1,01 lần xuống 0,72 lần Con số giảm biết để bảo vệ DNA khỏi tổn thương oxy hóa từ 1,07 lần xuống 0,79 lần xạ tia X 100 Gy cơng • OH, H O • O2- 2 với diện 500 µM EGCG Kết oligonucleotide DNA Tác dụng loại bỏ tận chứng minh rõ ràng số lượng đứt gãy sợi gốc EGCG DNA hoạt động đơn DNA giảm có 500 µM EGCG kép: hoạt động thu dọn phản ứng trung gian Vai trò bảo vệ EGCG DNA khỏi khử ion lượng phản ứng Fenton (6,7) xạ ion hóa rõ ràng LET cao Đối với Các flavonoid tạo phức với đồng sắt ngăn chiếu xạ gamma, thay đổi vịng lặp mRNA cản hình thành ROS Trong hệ thống phản ứng giảm từ 1,17 lần xuống 0,57 lần có 500 µM Fenton, Fe2+ phản ứng với H2O2 bị oxy hóa EGCG liều hấp thụ 50 Gy giảm từ 1,09 thành Fe3+ tạo gốc hydroxyl, dẫn đến tổn thương DNA EGCG thể sức mạnh khử lớn lần xuống 0,51 lần 100 Gy (Hình 2) ion sắt, đặc biệt nồng độ cao Tác Số 70 - Tháng 3/2022 35 THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN động loại bỏ tận gốc EGCG DNA hoạt động kép: ROS Hoạt động nhặt rác, khử ion công suất phản ứng Fenton (5) Ở nồng độ thấp, EGCG bảo vệ DNA chống lại phá hủy oxy hóa với gia tăng nồng độ, EGCG làm giảm sức mạnh ion sắt, làm tăng tốc độ tạo gốc hydroxyl từ phản ứng Fenton, chiếm ưu so với khả quét gốc tự tác động lên hư hại lên DNA TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Radiation Biology: A Handbook for Teachers and Students, TCS (Training Course Series), No 42 (2010), International Atomic Energy Agency, Vienna [2] BEIR V (Biological Effects of Ionizing Radiation, V) (1990) Health Effects of Exposure to Low Levels of Ionizing Radiation,; Washington (DC): National Academies Press (US), 1990 ISBN-10: 0-309-039975 [3] Eric Hall (1994) Radiobiology for the Radiologist, 4th ed (Philadelphia: J B Lippincott, 1994), [4] Cheng Chen, Qian Liu, Lin Liu, Yi-yang Hu, and Qin Feng (2018) Potential Biological Effects of Epigallocatechin-3-gallate on the Treatment of Nonalcoholic Fatty Liver Disease Mol Nutr Food Res 2018, 62, DOI: 10.1002/mnfr.201700483 [5] Ryuchiro Sakata, Takato Ueno, Toru Nakamura, Masaharu Sakamoto, Takuji Torimura, Michio Sata (2004) Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate inhibits platelet-derived growth factor-induced proliferation of human hepatic stellate cell line LI90, Journal of Hepatology 40(1): 52-59 [6] Yang GY, Liao J, Kim K, Yurkow EJ, Yang CS (1998) Inhibition of growth and induction of apoptosis in human cancer cell lines by tea polyphenols Carcinogenesis 19:611–616 [7] Yang GY, Liao J, Li C, Chung J, Yurkow EJ, Ho CT, Yang CS (2000) Effect of black and green tea polyphenols on c-jun phosphorylation and H2O2 production in transformed and non-transformed human bronchial cell lines: possible mechanisms of cell growth inhibition and apoptosis induction Carcinogenesis 21:2035–2039 36 Số 70 - Tháng 3/2022 [8] Liang YC, Lin-Shiau SY, Chen CF, Lin JK (1997) Suppression of extracellular signals and cell proliferation through EGF receptor binding by ()-epigallocatechin gallate in human A431 epidermoid carcinoma cells J Cell Biochem 67:55–65 [9] Chen C, Yu R, Owuor ED, Kong AN (2000) Activation of antioxidant response element (ARE), mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and caspases by major green tea polyphenol components during cell survival and death Arch Pharm Res 23:605–612 [10] Kong AN, Yu R, Chen C, Mandlekar S, Primiano T (2000) Signal transduction events elicited by natural products: role of MAPK and caspase pathways in homeostatic response and induction of apoptosis Arch Pharm Res 23:1–16 [11] Aghamohammadi SZ, David TM, Thacker LSJ (1992) Rapid screening for deletion mutations in the hprt gene under X-ray and α-irradiation using the polymerase chain reaction: X-ray and α-particle mutant spectra Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 269(1): 1-7 ... động thu dọn phản ứng trung gian Vai trò bảo vệ EGCG DNA khỏi khử ion lượng phản ứng Fenton (6,7) xạ ion hóa rõ ràng LET cao Đối với Các flavonoid tạo phức với đồng sắt ngăn chiếu xạ gamma, thay... gen hprt Aghamohammadi el al (11) Trong nghiên cứu này, nghiên cứu khả bảo vệ EGCG đứt gãy sợi đơn DNA tế bào chiếu xạ cách sử dụng mồi để khuếch đại RNA polymerase, loại enzyme chịu trách nhiệm... tác dụng bảo Như thấy Hình 1, EGCG bảo vệ vệ flavonoid DNA tham gia DNA khỏi bị hư hại xạ ion hóa gây Tổn ion kim loại chelat, chẳng hạn đồng thương DNA giảm rõ ràng có EGCG Ở sắt (phản ứng Fenton)