Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 12 58 Khảo sát hoạt tính kháng Candida spp của cao Trầu riêng rẽ và phối hợp với miconazol Lê Văn Kim Anh, Phạm Bền Chí * Khoa Dược, Đại học Ng[.]
Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 12 58 Khảo sát hoạt tính kháng Candida spp cao Trầu riêng rẽ phối hợp với miconazol Lê Văn Kim Anh, Phạm Bền Chí* Khoa Dược, Đại học Nguyễn Tất Thành * pbchi@ntt.edu.vn Tóm tắt Hiện nay, tỉ lệ Candida spp đề kháng với miconazol ngày cao Để đạt hiệu điều trị, cần tăng liều tăng số lần dùng miconazol ngày, nhiên lại gây nhiều tác dụng phụ gan, thận Do đó, xu phát triển sử dụng dược liệu dạng riêng rẽ phối hợp với thuốc hóa dược nhằm cải thiện vấn đề Đề tài thực nhằm chứng minh hiệu phối hợp cao Trầu (Piper betle L Piperaceae) với miconazol chủng Candida spp Lá Trầu nghiên cứu qui trình chiết xuất tinh chế với dung môi rẻ, thân thiện (cồn, nước) Bằng phương pháp khuếch tán giếng, vi pha lỗng mơi trường MHA bổ sung glucose % theo hình bàn cờ, cao Trầu tinh chế kháng C albicans ATCC 10231 chủng phân lập từ mẫu bệnh phẩm (C albicans 01, C krusei 8TX, C tropicalis 58) với MIC 2000 µg/mL Phối hợp cao Trầu tinh chế miconazol cho tương tác cộng lực chủng C albicans, tác động riêng rẽ chủng cịn lại ® 2020 Journal of Science and Technology - NTTU Mở đầu Từ lâu, Trầu (Piper betle L Piperaceae) dân gian sử dụng để điều trị bệnh đẹn miệng Candida spp gây Miconazol thuốc kháng nấm thuộc nhóm azol định thường xuyên Việt Nam để điều trị bệnh nhiễm Candida bị đề kháng nhiều Với mong muốn phát triển nguồn dược liệu tự nhiên Việt Nam giảm bớt tình trạng lạm dụng miconazol, nghiên cứu thực để chứng minh tác dụng kháng Candida spp in vitro phối hợp cao Trầu miconazol để làm sở khoa học cho việc xây dựng dạng bào chế dùng kem đánh răng, nước súc miệng, kem bôi da để điều trị bệnh lí Candida spp gây Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu: Lá Trầu thu mua Hóc Mơn, Tp Hồ Chí Minh vào tháng 5/2019 Nguyên liệu miconazol nitrat, xuất xứ Ấn Độ Vi nấm thử nghiệm: C albicans ATCC 10231, chủng C albicans 01, C tropicalis 58, C krusei 8TX phân lập từ mẫu niêm mạc miệng bệnh nhân ung thư [1] Đại học Nguyễn Tất Thành Nhận 24.11.2020 Được duyệt 20.12.2020 Công bố 30.12.2020 Từ khóa Candida spp., miconazol, Trầu , Piper betle, cộng lực 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Sơ định danh dược liệu thu mua Lá Trầu định danh sơ cách khảo sát đặc điểm hình thái, giải phẫu so sánh với tài liệu tham khảo [2] 2.2.2 Khảo sát qui trình chiết xuất tinh chế cao Trầu Với định hướng sử dụng cao dược liệu để bào chế dạng chế phẩm nên nghiên cứu sử dụng dung mơi có sẵn, rẻ tiền, không độc hại cồn 96 % nước Đun hồi lưu Trầu tươi với nước giờ, tỉ lệ dược liệu : nước (1 g : mL), để thu dịch chiết nước nóng Sau dịch chiết nước nóng đến khoảng 1/10 thể tích, thu dịch C0 [3] Tiến hành khảo sát thể tích cồn 96 % mức (1, 3, 5, 10, 20, 40, 80, 100, 120, 140) mL thêm vào mL dịch C0 để thu dịch Ci tủa Ti Rửa tủa Ti với nước lần, sấy khô 70 0C Dịch Ci cô cạn bếp cách thủy 70 0C, thu cao Ci Tiến hành theo dõi khối lượng, hoạt tính kháng C albicans ATCC 10231 tủa Ti, cao C0 Ci phương pháp khuếch tán để tìm phân đoạn tối ưu Phân đoạn cao Trầu tinh chế 2.2.3 Khảo sát hoạt tính kháng Candida spp cao Trầu miconazol 2.2.3.1 Phương pháp khuếch tán giếng [4] Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 12 59 Môi trường thử nghiệm: Môi trường MHA bổ sung % glucose Vi nấm sau hoạt hóa phân lập mơi trường SDA 37 0C 48 giờ, phân tán nước muối sinh lí bổ sung 0,05 % tween 80 để đạt mật độ (1 – 5) x 106 CFU/mL Dùng que vô trùng thấm huyền dịch vi nấm trải bề mặt thạch Dùng dụng cụ chuyên dụng đục giếng Mẫu thử gồm cao tủa pha dung môi DMSO 10 % (hoặc nước) để đạt nồng độ 100 mg/mL, chứng âm DMSO 10 % Tiến hành nhỏ 60 µL mẫu thử vào giếng Ủ 37 0C 48 giờ, ghi nhận đường kính vùng ức chế Lặp lại lần để lấy giá trị trung bình 2.2.3.2 Phương pháp vi pha lỗng mơi trường thạch nấu chảy [5] Phương pháp dùng để xác định nồng độ tối thiểu ức chế phát triển Candida spp cao Trầu tinh chế, miconazol Môi trường thử nghiệm: MHA bổ sung % glucose Mẫu thử: cao Trầu tinh chế, miconazol pha dung dịch mẹ DMSO, sau tiến hành pha lỗng với mơi trường thành dãy nồng độ thử nghiệm giảm dần theo cấp số bảng nhựa 96 giếng: + Cao Trầu tinh chế: dung dịch mẹ 80.000 µg/mL Dãy nồng độ thử nghiệm: (7,8125 - 8.000) µg/mL + Miconazol: dung dịch mẹ 12.800 µg/mL Dãy nồng độ thử nghiệm: (0,125 – 128) µg/mL Vi nấm thử nghiệm chuẩn bị 2.2.3.1, sau hút 10 µL huyền dịch vi nấm lên bề mặt giếng để đạt số lượng 104 CFU Cao Trầu tinh chế MIC 8000 – 250 µg/mL A B C D E F G B2 C2 D2 E2 F2 G2 B3 C3 D3 E3 F3 G3 B4 C4 D4 E4 F4 G4 MIC B5 C5 D5 E5 F5 G5 Giá trị MIC nồng độ thấp ức chế vi nấm mọc bề mặt thạch Lặp lại thí nghiệm lần để lấy giá trị trung bình 2.2.3.4 Phương pháp vi pha lỗng theo hình bàn cờ [6] Phương pháp dùng để xác định hiệu phối hợp cao Trầu tinh chế miconazol Mẫu thử nghiệm pha lỗng liên tục ½ mơi trường thử nghiệm (hoặc bổ sung DMSO cho nồng độ giếng không %) thành dãy nồng độ từ cao đến thấp bảng nhựa 96 giếng: + Miconazol: 128 µg/mL – 0,25 µg/mL (từ ô A2 đến ô A11) + Cao Trầu tinh chế: từ 8.000 µg/mL – 250 µg/mL (từ ô B1 đến G1) Tiến hành phối hợp nồng độ miconazol cao Trầu tinh chế giếng từ B2 đến G11 Mỗi giếng chứa 100 µL gồm 50 µL cao Trầu tinh chế, µL miconazol 49 µL mơi trường thử nghiệm Vi nấm thử nghiệm chuẩn bị giống mục 2.2.3.2 Sau 48 ủ 37 0C, xác đinh MIC riêng rẽ, MIC phối hợp để tính hệ số FIC: FIC = MICA phối hợp MICA + MICB phối hợp MICB FIC ≤ 0,5 : hiệp lực bội tăng 0,5 < FIC ≤ 1: cộng lực < FIC ≤ : tác dụng riêng rẽ < FIC: đối kháng Miconazol 128 – 0,25 µg/mL B6 B7 B8 B9 C6 C7 C8 C9 D6 D7 D8 D9 E6 E7 E8 E9 F6 F7 F8 F9 G6 G7 G8 G9 10 11 B10 C10 D10 E10 F10 G10 B11 C11 D11 E11 F11 G11 12 Chứng âm Hình Bảng nhựa 96 giếng phương pháp vi pha lỗng theo hình bàn cờ Kết bàn luận 3.1 Sơ định danh dược liệu thu mua Các đặc điểm hình thái giải phẫu ghi nhận phù hợp với nghiên cứu Pradhan D cộng sự, chứng tỏ dược liệu thu mua Trầu [7] Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 12 60 Hình Đặc điểm hình thái giải phẫu Trầu thu mua 3.2 Qui trình chiết xuất tinh chế cao Trầu Để tìm qui trình chiết xuất tinh chế cao Trầu, cần theo dõi khối lượng hoạt tính kháng C albicans ATCC 10231 cao C0, Ci tủa Ti Kết thể Bảng Hình Bảng Khối lượng đường kính vùng ức chế trung bình tủa cao phân đoạn Trầu Thể tích cồn 96 % thêm vào (mL) 10 20 40 80 100 120 140 Tủa Ti Đường kính vùng ức Khối lượng (g) chế trung bình (mm) 0 T1= 0,0147 T2 = 0,0426 T3 = 0,0508 T4 = 0,1034 T5 = 0,1401 T6 = 0,1822 T7 = 0,1829 T8 = 0,1819 T9 = 0,1831 T10= 0,1847 Cao Ci Đường kính vùng ức Khối lượng (g) chế trung bình (mm) C0 = 0,6439 11 C1 = 0,6379 10,83 C2 = 0,6156 11 C3 = 0,6033 11,5 C4 = 0,555 11,33 C5 = 0,4379 12,33 C6 = 0,4029 13,17 C7 = 0,3681 21,83 C8 = 0,4136 23,83 C9 = 0,3996 23,67 C10 = 0,4197 25,33 Hình Vùng ức chế C albicans ATCC 10231 cao, tủa Trầu Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 12 61 Nhìn chung, thể tích cồn 96 % thêm vào nhiều lượng tủa tăng Các tủa Ti không cho vùng ức chế, chứng tỏ chúng khơng có hoạt tính Các cao C0 Ci cho vùng ức chế với đường kính vùng ức chế trung bình tăng dần từ C0 đến C10 Đường kính vùng ức chế cao C7 (tỉ lệ cồn 96 % : dịch chiết đậm đặc = 16 :1 ) lớn có ý nghĩa thống kê so với cao C0 – C6 (p < 0,05) Mặc dù cao C8, C9 có đường kính vùng ức chế lớn khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Cao C10 có đường kính vùng ức chế lớn C7 có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) để có cao C10, thể tích cồn 96 % thêm vào mL dịch chiết đậm đặc 140 mL (tỉ lệ 28 : 1), lượng lớn, gây tốn nâng cấp qui mơ tinh chế sau Qui trình chiết xuất tinh chế cao Trầu mô tả Hình Hình Qui trình chiết xuất tinh chế cao Trầu 3.3 Hoạt tính kháng Candida spp cao Trầu tinh chế miconazol Hoạt tính kháng Candida spp cao Trầu tinh chế miconazol riêng rẽ thể Bảng Hình Bảng Giá trị MIC cao Trầu tinh chế miconazol (µg/mL) Cao TK tinh chế Miconazol C albicans ATCC 10231 2000 C albicans 01 2000 32 C krusei 8TX 2000 C tropicalis 58 2000 32 Hình Bảng nhựa 96 giếng thử nghiệm MIC cao Trầu tinh chế miconazol Hoạt tính kháng Candida spp phối hợp cao Trầu tinh chế miconazol thể Bảng Hình Hình Bảng nhựa 96 giếng thử nghiệm xác định MIC cao Trầu tinh chế MCZ phối hợp Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 12 62 Bảng Tác động kháng Candida spp phối hợp cao Trầu tinh chế miconazol Chủng C albicans ATCC 10231 C albicans 01 C krusei 8TX C tropicalis 58 Giếng xác định MIC E10 E9 E8 F8 E5 E6 E7 E8 F6 B9 B10 C9 C10 B5 B6 C5 C6 MIC phối hợp (μg/mL) (Cao TK : MCZ) 1000 : 0,5 1000 : 1000 : 500 : 1000 : 16 1000 : 1000 : 1000 : 500 : 8000 : 8000 : 0,5 4000 : 4000 : 0,5 8000 : 16 8000 : 4000 : 16 4000 : FIC 0,625 0,75 0,75 0,75 0,625 0,562 0,5 4,5 4,25 2,5 2,25 4,5 4,25 2,5 2,25 Tác động Cộng lực Cộng lực Hiệp lực Đối kháng Riêng rẽ Đối kháng Riêng rẽ Tỉ lệ nồng độ cao TK - MCZ 2000 : 1000 : 500 : 250 : 62,5 : 125 : 250 : 500 : 62,5 : 8000 : 16000 : 4000 : 8000 : 8000 : 16000 : 4000 : 8000 : Căn vào giá trị FIC cho thấy: Trên chủng C albicans ATCC 10231, cao Trầu tinh chế tương tác cộng lực với miconazol tỉ lệ nồng độ 2.000 : 1, 1.000 : 1, 500 : 250 : Trong phối hợp, cao Trầu tinh chế làm giảm MIC riêng rẽ miconazol xuống (2 – 8) lần, miconazol làm giảm MIC cao Trầu tinh chế riêng rẽ xuống (2 – 4) lần Trên chủng C albicans 01, cao Trầu tinh chế tương tác cộng lực với miconazol tỉ lệ nồng độ 125 : 1, 250 : 1, 500 : Mặc dù có tỉ lệ nồng độ cao Trầu tinh chế miconazol (62,5 : 1), nồng độ cao Trầu 500 µg/mL, miconazol µg/mL lại cho tương tác hiệp lực Trong phối hợp, cao Trầu tinh chế làm giảm MIC riêng rẽ miconazol xuống (2 – 16) lần, miconazol làm giảm MIC cao Trầu tinh chế riêng rẽ xuống (2 – 4) lần Cao Trầu tinh chế tương tác riêng rẽ đối kháng với miconazol C krusei 8TX C tropicalis 58 lớn gấp 7,8 lần so với cao DCM (MIC = 256 µg/mL) [3] nghiên cứu này, sử dụng dung mơi an tồn, rẻ tiền, thân thiện với mơi trường (cồn, nước) nên tiện lợi, tiết kiệm dễ áp dụng nâng cấp qui mô Hơn nữa, cao Trầu tinh chế thu không cần khảo sát tiêu dư lượng dung môi tồn dư xây dựng tiêu chuẩn sở, giúp đơn giản hóa cơng tác tiêu chuẩn hóa kiểm nghiệm Đề tài chứng minh hoạt tính kháng Candida spp cao Trầu tinh chế (MIC = 2.000 µg/mL), đồng thời tìm tỉ lệ phối hợp cho tương tác cộng lực cao Trầu tinh chế miconazol chủng C albicans – chủng gây bệnh phổ biến Các kết tiền đề để tiếp tục thực nghiên cứu mơ hình in vivo khảo sát độc tính chúng trước ứng dụng bào chế sản phẩm điều trị bệnh lí C albicans gây Kết luận Lời cám ơn Nghiên cứu tài trợ Quĩ Phát triển Khoa học Công Nghệ - Đại học Nguyễn Tất Thành đề tài mã số 2020.01.092 Tóm lại, nghiên cứu tìm qui trình chiết xuất tinh chế cao Trầu định hướng hoạt tính kháng C albicans ATCC 10231 Mặc dù cao Trầu tinh chế thu có MIC Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 12 63 Tài liệu tham khảo Đinh Quang Long, Phạm Bền Chí (2020), "Khảo sát tính nhạy cảm số chủng Candida spp phân lập từ miệng bệnh nhân ung thư với số thuốc kháng nấm",Tạp chí khoa học cơng nghệ - Đại học Nguyễn Tất Thành.(10), tr.52-57 Trần Hùng (2004), "Phương pháp nghiên cứu dược liệu", Đại học Y Dược Tp HCM Phan Thị Thanh Thủy, Nguyễn Đinh Nga (2012), "Xây dựng tiêu chuẩn sở cao chiết nước Trầu không (Piper betle L Piperaceae)", Luận văn Thạc sĩ Dược học, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Balouiri M et al (2016), "Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review", Journal of Pharmaceutical Analysis (2), pp 71-79 Golus J et al (2016), "The agar microdilution method–a new method for antimicrobial susceptibility testing for essential oils and plant extracts", Journal of Applied Microbiology 121 (5), pp 1291-1299 Ernst E J et al (2005), Antifungal agents: methods and protocols, Vol 118, Springer Science & Business Media Pradhan D et al (2013), "Golden Heart of the Nature: Piper betle L", Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry (6) The study on anti – Candida activities of Piper betle’s extract in dependence and combination with miconazole Le Van Kim Anh, Pham Ben Chi* Faculty of Pharmacy, Nguyen Tat Thanh University * pbchi@ntt.edu.vn Abstract In recent years, Candida spp has a high rate of resistance against miconazole To achive a therapeutic effect, it is necessary to increase either the dose or the frequency of administration of miconazole, but it can cause many side effects on the liver and kidneys Therefore, studies have tended to focus on natural medicinal products to recplace or combine with chemical medicines to solve this problem This study was conducted to assess the antifungal activity of the betle - extract in independence and combination with miconazole on Candida spp The process of extraction and purification from betle leaves were studied using cheap, and safe sovents (alcohol, water) Via agar microdilution method in MHA added with % glucose, the purified extract had an MIC value of 2000 µg/m: on the strains of C albicans ATCC 10231, C albicans 01, C krusei 8TX and C tropicalis 58 With checkerboard assay, the combination of purified betel extract and miconazole demonstrated synergistic effect and additive effect on strains of C albicans, and separated effect on the other strains Keywords Candida spp., Piper betle, additive effect, miconazole, betle leave Đại học Nguyễn Tất Thành ... chế cao Trầu 3.3 Hoạt tính kháng Candida spp cao Trầu tinh chế miconazol Hoạt tính kháng Candida spp cao Trầu tinh chế miconazol riêng rẽ thể Bảng Hình Bảng Giá trị MIC cao Trầu tinh chế miconazol. .. miconazol làm giảm MIC cao Trầu tinh chế riêng rẽ xuống (2 – 4) lần Cao Trầu tinh chế tương tác riêng rẽ đối kháng với miconazol C krusei 8TX C tropicalis 58 lớn gấp 7,8 lần so với cao DCM (MIC = 256... 10231, cao Trầu tinh chế tương tác cộng lực với miconazol tỉ lệ nồng độ 2.000 : 1, 1.000 : 1, 500 : 250 : Trong phối hợp, cao Trầu tinh chế làm giảm MIC riêng rẽ miconazol xuống (2 – 8) lần, miconazol