Nghiên cứu khoa học cơng nghệ THIẾT LẬP QUY TRÌNH PCR-RFLP XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VI RÚT BK PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN GHÉP THẬN ĐINH THỊ THU HẰNG (1), NGUYỄN THU TRANG (1, 2), HOÀNG XUÂN SỬ (1) ĐẶT VẤN ĐỀ Ghép thận công nhận tiến đáng kể y học đại xem phương pháp điều trị thay hiệu cho bệnh nhân suy thận mạn tính giai đoạn cuối Điều mang lại kết điều trị tích cực kinh tế cải thiện chất lượng sống cho bệnh nhân so với chạy thận nhân tạo Việc theo dõi điều trị bệnh nhân sau ghép thận đóng vai trị quan trọng trì chức thận ghép, giảm thiểu tối đa nguy mô ghép hay suy chức thận ghép [1] BK polyomavirus (BKV) vi rút hội phổ biến cộng đồng, lây nhiễm cho trẻ em thời thơ ấu qua đường hô hấp phân-miệng, có khả gây bệnh khơng triệu chứng tồn trạng thái tiềm ẩn Ở bệnh nhân ghép thận, việc sử dụng thuốc ức chế miễn dịch kéo dài điều kiện thuận lợi cho BKV dễ dàng tái hoạt động dẫn đến rối loạn chức thận ghép, khiến thể khơng nhận cấy ghép [1] BKV có kích thước nhỏ, xấp xỉ 40-45 nm, dạng hình trịn hình cầu, khơng có vỏ ngồi bao caspid hình nhị thập diện gồm 72 capsomer pentameric [2] Cấu trúc BKV bao gồm ba protein caspid VP1, VP2, VP3, hệ gen phân tử DNA sợi kép dạng vòng khép kín liên kết với histon [3] Hệ gen BKV-DNA có kích thước khoảng 5,1 kb, phiên mã hai chiều, mặt chức chia thành ba vùng: kiểm soát sớm, kiểm soát muộn kiểm soát khơng mã hóa Trong đó, vùng kiểm sốt muộn tập trung nhiều nghiên cứu phân tử vi rút, vùng mã hóa ba protein cấu trúc capsid với VP1 protein cấu trúc chính, chiếm xấp xỉ 80% toàn protein vỏ Sự đa đạng di truyền gen mã hóa protein VP1 để phân loại kiểu gen BKV BKV có bốn kiểu gen chính: I, II, III, IV, kiểu gen I phổ biến với tỷ lệ 80% kiểu gen IV khoảng 15% [4] Hai kiểu gen lại II III gặp hơn, công bố số quốc gia giới Anh, Nhật Bản Việc xác định kiểu gen BKV giúp cung cấp đặc điểm di truyền phân tử BKV có giá trị việc phát nguồn gốc phát sinh, góp phần giám sát BKV, dự báo mối liên quan tiềm tàng diễn biến gây bệnh BKV tiến triển BKVN (BKV-associated Nephropathy, bệnh thận BKV) bệnh nhân ghép thận Hiện nay, việc xác định kiểu gen thường thực thơng qua giải trình tự xây dựng chủng loại phát sinh Tuy nhiên cần thiết phải xây dựng quy trình xác định kiểu gen tối ưu rút ngắn thời gian với giá thành cạnh tranh mà bảo đảm độ tin cậy, độ xác cao Vì vậy, chúng tơi thực hiên cơng trình với mục tiêu thiết lập quy trình PCR- RFLP xác định kiểu gen chủng BKV phân lập từ bệnh nhân ghép thận Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 27, 12 - 2022 41 Nghiên cứu khoa học công nghệ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu nghiên cứu Mẫu bệnh phẩm gồm 30 mẫu nước tiểu dương tính BKV-DNA từ bệnh nhân theo dõi điều trị sau ghép thận Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y xét nghiệm định lượng BKV-DNA kỹ thuật real-time PCR theo quy trình Học viện Quân y với vùng gen đích VP1 [12] Nghiên cứu thiết kế theo phương pháp thực nghiệm mơ tả phân tích phịng thí nghiệm, sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử, với thiết bị thuộc Phòng Vi sinh mầm bệnh sinh học, Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y 2.2 PCR khuếch đại tinh sản phẩm PCR đoạn gen VP1 Mẫu nước tiểu thu thập ống falcon 50, ly tâm 3200 vòng/ phút 30 phút, thu cặn sử dụng để tách chiết DNA tổng số theo quy trình kit GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit Vùng gen VP1 BKV khuếch đại PCR sử dụng cặp mồi BK_(S+AS) có trình tự BK_S: 5’ATCAAAGAACTGCTCCTCAAT-3’ BK_AS: 5’GCACTCCCTGCATTTCCAAGGG -3’ tương ứng với vị trí nucleotide 1361-1381 1919-1940 (chủng Dunlop, mã số: V01108.1) cho sản phẩm có kích thước theo tính tốn lý thuyết 580 bp Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 1X GoTaq Master Mix (Promega- Mỹ); 0,1 μM mồi xuôi, mồi ngược loại, μl DNA khuôn, nước khử ion vừa đủ thể tích 25 μl Q trình khuếch đại thực máy PCR Eppendorf Mastercycler proS (Đức) với chu trình: (95o C/7 phút, (95oC/ 45 giây; 58oC/ 45 giây; 72oC/ 45 giây)x40, (72º phút) Các sản phẩm PCR kích thước theo tính tốn lý thuyết tinh sử dụng GeneJET PCR Purification Kit GeneJET Gel Extraction Kit Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1,2% đệm TBE 0,5X, điều kiện 110V/60 phút, nhuộm ethidium bromua, chụp ảnh lưu kết máy UVP Eppendorf 2.3 Thiết lập phản ứng PCR - RFLP định type BKV Sản phẩm PCR đoạn gen VP1 với cặp mồi BK_(S+AS) sau tinh xác định kiểu gen enzym giới hạn RsaI AluI Thành phần phản ứng cắt enzym giới hạn sau: 1X Buffer (Thermo Scientific- Mỹ); μl enzym giới hạn loại, μl DNA sản phẩm tinh sạch, nước khử ion vừa đủ thể tích 20 μl Ủ hỗn hợp phản ứng 37 oC phút với Fast Digest Enzyme RsaI 16 với AluI Hỗn hợp phản ứng cắt enzym giới hạn kiểm tra điện di gel agarose 2,0 %, đệm TBE 0,5X điều kiện 100V/ 70 phút gồm: Sơ đồ chiến thuật sử dụng enzym giới hạn xác định kiểu gen BKV, bao - Vị trí cắt hai enzym RsaI AluI - Kích thước băng cắt tương ứng phân biệt bốn kiểu gen BKV 42 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 27, 12 - 2022 Nghiên cứu khoa học công nghệ Bảng Sơ đồ chiến thuật sử dụng enzyme giới hạn xác định kiểu gen BKV vùng gen VP1 khuếch đại cặp mồi BK_(S+AS) RsaI AluI Số điểm cắt Vị trí cắt Kích thước sản phẩm (bp) Số điểm cắt Vị trí cắt Kích thước sản phẩm (bp) Kiểu gen 47/ 430 47; 150; 383 123/290 123; 167; 290 I 47 47; 533 123/290 123; 167; 290 II 47/353 47; 227; 306 123 123; 457 III 47/490 47; 90; 443 123 123; 457 IV TT 2.4 Giải trình tự xây dựng phát sinh chủng loại Đồng thời để khẳng định kết quả, kiểu gen BKV mẫu nghiên cứu giải trình tự hai chiều sử dụng mồi BK_S/ BK_AS Kết giải trình tự kiểm tra loại bỏ vùng mơ hồ đầu cuối Bioedit, so sánh với trình tự Genbank phần mềm BLAST (NCBI) Xây dựng phát sinh chủng loại phần mềm Mega 11 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Thiết lập quy trình PCR- RFLP gen đích VP1 xác định kiểu gen chủng vi rút BK Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 27, 12 - 2022 43 Nghiên cứu khoa học công nghệ Các mẫu nước tiểu sau tách chiết DNA tổng số định lượng nồng độ BKV-DNA kỹ thuật real-time PCR nước tiểu theo quy trình Học viện Quân y Nồng độ BKVcủa mẫu bệnh phẩm nghiên cứu xác định đạt nồng độ từ 105 -1010 copy/ml Với 30 mẫu DNA-BKV này, sử dụng kĩ thuật PCR để khuếch đại đoạn gen VP1 BKV cặp mồi BK_(S+AS) cho sản phẩm có kích thước tính toán lý thuyết 580 bp Như vậy, khuếch đại thành công đoạn gen VP1 từ 30/30 mẫu bệnh phẩm (hình 1) a) b) Hình Khuếch đại đoạn gen VP1 cặp mồi BK_(S+AS) Chú thích: M-Marker 100bp; NC: Đối chứng âm nước khử ion a) 1-5: Sản phẩm PCR từ DNA mẫu bệnh phẩm BK272U, BK528U, BK334U, BK510U, BK572U b) 1-5: Sản phẩm PCR tinh mẫu bệnh phẩm BK272U, BK528U, BK334U, BK510U, BK572U Kết hình cho thấy giếng lên băng tính tốn, băng sáng, đậm nét Như vậy, đoạn gen VP1 30 mẫu bệnh phẩm khuếch đại tinh thành công Các sản phẩm PCR đoạn gen VP1 với cặp mồi BK_(S+AS) sau tinh xác định kiểu gen cắt enzym giới hạn RsaI AluI Với enzym giới hạn RsaI, mẫu nghiên cứu cho hai nhóm sản phẩm cắt gồm nhóm 20 mẫu đồng loạt cho ba sản phẩm cắt có kích thước khoảng 47, 150, 383 bp nhóm 10 mẫu cho ba sản phẩm cắt có kích thước 47, 90, 443 bp tương ứng thuộc kiểu gen I IV BKV theo sơ đồ chiến thuật cắt enzym giới hạn (hình 2a) Để khẳng định kết quả, mẫu tiếp tục cắt enzym giới hạn AluI cho sản phẩm cắt có kích thước 290 bp (băng 123, 167 bp mờ) với 20 mẫu thuộc kiểu gen I sản phẩm cắt có kích thước 457 bp (băng 123 mờ) với 10 mẫu lại thuộc kiểu gen IV (hình 2b) 44 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 27, 12 - 2022 Nghiên cứu khoa học cơng nghệ a) b) Hình Điện di kiểm tra sản phẩm cắt đoạn gen VP1-BKV enzyme giới hạn Chú thích: 1-Marker 50bp; 2- Đối chứng sản phẩm PCR-VP1 không cắt a) 3-7: Sản phẩm cắt mẫu BK272U, BK334U, BK510U, BK528U, BK572U enzyme giới hạn RsaI b) 3-7: Sản phẩm cắt mẫu BK272U, BK334U, BK510U, BK528U, BK572U enzyme giới hạn AluI Khi sử dụng hai enzym cắt kiểm tra mẫu, nhận kết kiểu gen Kết minh họa hình cho thấy, mẫu giếng 3,4,5,7 tương ứng sản phẩm cắt mẫu BK272U, BK334U, BK510U, BK572U thuộc kiểu gen IV, mẫu giếng tương ứng sản phẩm cắt mẫu BK528U thuộc kiểu gen I Như vậy, sử dụng đồng thời hai enzym giới hạn RsaI AluI, bước đầu xác định 20 mẫu mang kiểu gen I (chiếm 66,7 %) 10 mẫu mang kiểu gen IV (chiếm 33,3%) 30 mẫu bệnh phẩm nghiên cứu 3.2 Phân tích đặc điểm kiểu gen chủng vi rút BK phân lập từ bệnh nhân ghép thận Từ kết giải trình tự so sánh với trình tự tham chiếu Genbank công cụ BLAST cho thấy trình tự đoạn gen VP1 nghiên cứu có độ tương đồng cao với trình tự tham chiếu, đạt độ tin cậy 99% Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa vào phương pháp Neighbor Joining với hệ số bootstrap lặp lại 1000 lần (hình 3) Kết xác định kiểu gen BKV-VP1 sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP với hai enzym giới hạn RsaI, AluI giải trình tự đồng 100% Trong 30 mẫu bệnh phẩm, có 20 mẫu mang kiểu gen I (chiếm 66,7 %) 10 mẫu mang kiểu gen IV (chiếm 33,3%) Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 27, 12 - 2022 45 Nghiên cứu khoa học công nghệ Hình So sánh trình tự đoạn gen VP1 BKV công cụ BLAST phát sinh chủng loại 46 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 27, 12 - 2022 Nghiên cứu khoa học công nghệ Đến nay, BKV kiểu gen I xác định kiểu gen chiếm chủ đạo toàn giới, tỷ lệ khoảng 80% bệnh nhân ghép thận có BKV dương tính nước tiểu Tác giả Krumbholz báo cáo, Đức, bệnh nhân nhiễm BKV chủ yếu kiểu gen I Điều đồng thuận với báo cáo Ikegaya công bố kiểu gen I-BKV chủ yếu với tỷ lệ khác cộng đồng Châu Âu Trong đó, Nishimoto cộng cơng bố kiểu gen IV có nguồn gốc từ Châu Á phân bố với tỷ lệ khác quốc gia Nghiên cứu Pastrana cộng (2013) xác định BKV kiểu gen IV chiếm tỷ lệ cao bệnh nhân BKVN sau ghép thận [5] Theo nghiên cứu Jin cộng năm 1995, hai kỹ thuật PCR-RFLP giải trình tự kỹ thuật đảm bảo độ nhạy đáng tin cậy để xác định kiểu gen BKV trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đầy đủ thống kê xác đồng hai phương pháp [6] Bảng So sánh kết kiểu gen sử dụng hai phương pháp STT Kí hiệu mẫu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 BK269U BK272U BK334U BK374U BK350U BK420U BK510U BK528U BK540U BK548U BK572U BK579U BK589U BK674U BK682U BK132UF BK152UF BK158UF BK198UF BK458UF BK468UF BK469UF BK483UF BK489UF BK507UF Kết định type Enzyme RsaI Enzyme AluI Giải trình tự I I I IV IV IV IV IV IV I I I I I I I I I IV IV IV I I I I I I I I I IV IV IV I I I IV IV IV I I I I I I I I I IV IV IV I I I I I I IV IV IV I I I IV IV IV I I I I I I IV IV IV Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 27, 12 - 2022 47