Nghiên cứu khoa học công nghệ NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN LỒI CHỊ NÂU (Dipterocarpus retusus) Ở PHÚ THỌ PHỤC VỤ CÔNG TÁC BẢO TỒN VÀ CHỌN GIỐNG NGUYỄN PHAN LAN HỒNG (1), VŨ ĐÌNH DUY (2), NGUYỄN THỊ PHƯƠNG TRANG (1), NGUYỄN MINH ĐỨC (3), VŨ ĐÌNH GIÁP (5), BÙI XUÂN PHƯƠNG (2), NGUYỄN MINH TÂM (4) ĐẶT VẤN ĐỀ Trên 40 loài họ Dầu với chi phân bố chủ yếu khu vực Đông Nam Bộ Tây Nguyên nước ta [1] Phần lớn chúng loài đặc hữu địa Trong thập kỷ qua, phần diện tích rừng tự nhiên, mơi trường sống nhiều loài họ Dầu bị chuyển đổi thành đất nông nghiệp khu dân cư Hiện nay, mảnh rừng cịn sót lại hậu q trình Mặt khác, số lồi họ Dầu gỗ lớn với giá trị thương mại cao, nhu cầu sử dụng lớn người dân địa phương, số loài bị khai thác mức Nhiều lồi có số lượng cá thể số quần thể thấp, khơng có tái sinh tự nhiên, có hội tiến hóa để thích nghi dễ bị tổn thương môi trường thay đổi Hiện tại, khoảng 35 loài họ Dầu bị đe dọa mức độ toàn cầu quốc gia [2, 3] Nhiều biện pháp áp dụng để bảo tồn phục hồi lồi Cơng tác bảo tồn nguyên vị chủ yếu thiết lập khu rừng đặc dụng Vườn Quốc gia, khu Bảo tồn thiên nhiên, khu Dự trữ sinh rừng phòng hộ Bảo tồn chuyển vị tiến hành song song với bảo tồn nguyên vị, sở thu thập hạt giống quần thể tự nhiên để xây dựng rừng giống vườn giống nhân giống hom Các giải pháp góp phần quan trọng bảo tồn phục hồi số loài bị đe dọa Để bảo tồn phục hồi hữu hiệu lồi họ Dầu, địi hỏi dẫn liệu sinh học, sinh thái mức độ đa dạng di truyền mức độ quần thể loài Mức độ đa dạng di truyền cao đảm bảo trì tồn chúng tương lai điều kiện biến đổi khí hậu Trong điều tra đa dạng di truyền cấu trúc di truyền thực vật, thị phân tử microsatellite (SSR) cơng cụ hữu ích tính đa hình phân bố phổ biến hệ gen sinh vật Chỉ thị sử dụng rộng rãi phân tích đa dạng di truyền số loài họ Dầu [4, 5] Trong báo này, đề cập đến số kết nghiên cứu đa dạng di truyền lồi Chị nâu (Dipterocarpus retusus) tỉnh Phú Thọ bị đe dọa, sở phân tích thị phân tử SSR đề xuất giải pháp bảo tồn phục hồi chúng VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thu thập mẫu thực địa Khảo sát thực địa cho lồi Chị nâu tiến hành rừng thứ sinh tỉnh Phú Thọ (Bảng 1) Trong thời gian khảo sát, chúng tơi xác định kích thước quần thể, nơi sống nguyên nhân ảnh hưởng đến quần thể ghi nhận sở quan sát vấn người dân địa phương Mẫu vỏ thu thập cho phân tích tính đa dạng di truyền, bảo quản silica gel thực địa âm 30oC tủ lạnh phịng thí nghiệm sử dụng để phân tích 78 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 29, 12-2022 Nghiên cứu khoa học công nghệ Bảng Địa điểm thu thập mẫu Chò nâu Phú Thọ Quần thể Số mẫu Chân Mộng 18 Phù Ninh 19 Hy Cương 20 Minh Phú 21 Nơi thu thập Chân Mộng, Đoan Hùng, Phú Thọ Phù Ninh, Đoan Hùng, Phú Thọ Hy Cương, Đoan Hùng, Phú Thọ Minh Phú, Đoan Hùng, Phú Thọ Độ cao Vĩ độ o Kinh độ 290-325 m 21 32’N 105o12’E 165-174 m 21o23’N 104o51’E 21o25’N 104o58’E 21o33’N 105o14’E 186-194 m 289-445 m 2.2 Nghiên cứu phịng thí nghiệm DNA tổng số tách chiết từ 78 mẫu vỏ theo dẫn kít DNeasy Plant Pro Plant Kits Phản ứng PCR tiến hành với thể tích phản ứng 25µl chứa thành phần gồm dung dịch đệm 1x PCR; 2,5mM MgCl2; 2mM dNTPs; 0,5pmol cho mồi xuôi ngược; 50ng DNA tổng số 0,5U Taq polymerase Tám cặp mồi SSR sử dụng (Bảng 2) Quá trình nhân PCR tiến hành máy Gene amp PCR system 9700 theo chu trình nhiệt sau: (1) Biến tính ban đầu: 94oC phút; (2) Biến tính: 94 oC phút; (3) Bắt cặp: 54-56oC phút (tuỳ thuộc vào cặp mồi); (4) Kéo dài: 72oC phút; (5) Lặp lại (2) đến (4): 40 chu kỳ; (6) Phản ứng kết thúc: 72 oC 10 phút; (7) Giữ sản phẩm 4oC điện di Điện di sản phẩm PCR gel Polyacrylamide 8% 40ml dung dịch đệm 1xTAE điện di Sequi-Gen (Biorad), nhuộm GelRedTM Nucleotic Acid Gel Stain chụp ảnh máy soi gel BioDocAnalyze Kích thước alen xác định phần mềm Gel-Analyzer GenoSens1850 với thang marker 50bp DNA (Invitrogen) Bảng Trình tự nucleotide cặp mồi kích thước cho lồi Chị nâu Locus dipt1 dipt2 dipt3 dipt4 dipt5 dipt6 dipt7 dipt8 Trình tự lặp lại Trình tự nucleotide (5’-3’) F: CTTCCCTAAATTCCCCAATGTT R: TAATGGTGTGTGTACCAGGCAT F: ACAATGAAACTTGACCACCCAT R:CAAAAGGACATACCAGCCTAGC F: TAGGGCATATTGCTTTCTCATC R: CTTATTGCAGTCATCAAGGGAA F: TCTCAAAATCTGCAAAGACAGC R: CCATAGTCATCACCTCTAATGGTC F: TGGCAAACAAGCTACTGTTCAT R: CATGGGTTTAGCAACCTACACA F: CAGGAGGGGAATATGGAAAA R: AAGTCGTCATCTTTGGATTGCF: ATGCTTACCACCAATGTGAATG R: CTCGCAGCAGAACAACTTTCTA F: ATCTGTTCTTCTACAAGCC R: TTAGAACTTGAGTCAGATC Tm Kích Nguồn (oC) thước (bp) tài liệu (AG)15 55 193-211 [6] (GA)24 56 228-240 [6] (AG)15 55 214-226 [6] (GA)25 55 241-301 [6] (TA)8 56 258-262 [6] (AC)9 54 122-140 [6] (GA)6 55 170-180 [7] (CT)4TT(CT )5 54 166-178 [8] Ghi chú: F: mồi xuôi, R: mồi ngược, Tm: nhiệt độ bắt cặp phản ứng PCR Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 29, 12-2022 79 Nghiên cứu khoa học công nghệ 2.3 Phân tích số liệu Xác định thơng số đa dạng di truyền tỉ lệ phần trăm locus đa hình (PPL), số alen cho locus (NA), số alen hữu hiệu (NE), alen giàu cho locus (AR), số đa dạng Shannon (I), hệ số gen dị hợp tử quan sát (HO), gen dị hợp tử kỳ vọng (HE), hệ số khác quần thể (FST) hệ số cận noãn (FIS) sử dụng phần mềm GenALEx [9] Cấu trúc di truyền quần thể xác định theo phần mềm STRUCTURE [10], STRUCTURE HARVESTER [11] STRUCTURESELECTOR [12] Mối quan hệ di truyền quần thể xây dựng Poptree2 [13] Hiện tượng thắt cổ chai (bottleneck) cho quần thể Chò nâu sở mơ hình, IAM (Mơ hình alen không xác định - infinite allele model), SMM (Mô hình đột biến bước - stepwise mutation model) TPM (Mơ hình đột biến giai đoạn - twophase mutation model) sử dụng BOTTLENECK ver 1.2 [14] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đa dạng di truyền Tổng số 23 alen khác xác định cho cặp mồi SSR đa hình từ 78 Chị nâu tỉnh Phú Thọ Phân bố không gian alen lồi Chị nâu trình bày Hình Các thông số đa dạng di truyền cho locus trình bày Bảng Số alen trung bình (NA) cho locus 2,8, dao động từ locus dipt5 đến locus lại Số alen tìm thấy locus dipt1 quần thể Minh Phú, dipt4 Hy Cương dipt7 Minh Phú, khơng có locus quần thể lại Chân Mộng Phù Ninh Sáu locus tổng số locus nghiên cứu có kết thiếu hụt gen dị hợp tử phương trình Hardy-Weinberg có mặt alen lặn Hệ số gen dị hợp tử quan sát (HO) trung bình 0,265, dao động từ 0,1 locus dipt4 đến 0,41 locus dipt3, hệ số gen dị hợp tử kỳ vọng (HE) trung bình 0,283, dao động từ 0,098 locus dipt4 đến 0,477 locus dipt2 Số alen giàu (AR) trung bình 2,6, dao động từ locus dipt5 đến locus dipt2 dipt8 Chỉ số Fix (chỉ mức độ quan hệ sinh sản) cho lồi Chị nâu trung bình 0,075 Bốn locus có giá trị Fix dương, vượt trội gen đồng hợp tử, điều xuất hiện tượng thụ phấn cận noãn Tuy nhiên, locus có giá trị Fix âm khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 80 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 29, 12-2022 Nghiên cứu khoa học công nghệ Ở mức độ quần thể, tỉ lệ phần trăm locus đa hình cao (90,63%), dao động từ 87,5% quần thể Chân Mộng, Phù Ninh Hy Cương đến 100% quần thể Minh Phú Số alen cho quần thể dao động từ 17 quần thể Chân Mộng Hy Cương đến 22 Minh Phú (Bảng 4) Số alen hữu hiệu thấp (AE = 1,2) quan sát quần thể Chân Mộng cao (1,7) hai quần thể Phù Ninh Minh Phú Số alen giàu số alen cho quần thể tương đương Hệ số gen dị hợp tử quan sát thấp quan sát quần thể Chân Mộng (HO = 0,153) cao Minh Phú (0,333), trung bình 0,265 Hệ số gen dị hợp tử kỳ vọng thấp (HE = 0,16) cao (0,367) quan sát tương ứng quần thể Chân Mộng Minh Phú Chỉ số Fix (FIS) khác từ -0,044 Hy Cương đến 0,225 Phù Ninh, trung bình 0,092 Chỉ số đa dạng Shannon trung bình 0,487 (0,303-0,622) Bảng Đa dạng di truyền locus cho lồi Chị nâu NE AR HO HE FIS 3 3 3 1,2 2,1 1,8 1,1 1,3 1,3 1,4 2,6 2,8 2,1 2,5 2,9 0,168 0,391 0,41 0,1 0,221 0,245 0,215 0,374 0,185 0,477 0,401 0,098 0,205 0,23 0,232 0,467 0,09 0,18 -0,022 -0,016 -0,078 -0,065 0,073 0.2 Null FIT allele no 0,153 0,135 0,344 0,067 0,199 0,041 0,064 0,057 0,053 no -0,025 0,136 0,216 0,06 0,243 2,8 1,5 2,6 0,265 (0,04) 0,283 0.075 (0,048) 0,156 (0,042) Locus NA dipt1 dipt2 dipt3 dipt4 dipt5 dipt6 dipt7 dipt8 Mean FST G’ST HW Nm 0,069* 0,2** 0,216** 0,078* 0,121** 0,038 0,155** 0,055* 0,064 0,411 0,386 0,068 0,141 0,027 0,192 0,07 nd nd ns ** nd nd *** ns 3,349 1,002 0,905 2,946 1,814 6,375 1,366 4,315 0,135 (0,032) 0,18 (0,057) 2,759 (0,671) Ghi chú: NA: Số alen cho locus, NE: alen hữu hiệu, AR: Alen giàu, HO HE: hệ số gen dị hợp tử quan sát kỳ vọng, FIS: số fix, alen lặn (Null alen), FIT: Hệ số cận nỗn cho lồi, FST: số khác di truyền quần thể theo Weir Cockerham (1984), G’ST: số khác di truyền quần thể theo Hedrick (2005), Nm: trao đổi di truyền, nd: khơng xác định, ns: khơng có ý nghĩa, *p < 0,05, ** p < 0,001, ***p < 0,0001 Bảng Đa dạng di truyền mức độ quần thể Chò nâu kết kiểm tra tượng thắt cổ chai Quần thể Chân Mộng Phù Ninh Hy Cương Minh Phú Trung bình Giá trị P bottleneck A B C PPL (%) Số alen NA NE AR I HO HE FIS FIS IIM 87,5 17 2,1 1,2 2,1 0,303 0,153 0,16 0,072* 0,078 0,003 0,004 ns 87,5 19 2,4 1,7 2,4 0,553 0,263 0,329 0,225** 0,126 0,003 0,054 0,014 87,5 17 2,1 1,5 2,1 0,472 0,313 0,292 0,044*** 0,198 0,003 0,069 0,003 100 22 2,7 1,7 2,7 0,622 0,333 0,367 0,115*** 0,122 0,01 0,001 0,004 0,487 0,265 0,092 0,125 90,63 1,5 0,287 Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 29, 12-2022 81 Nghiên cứu khoa học công nghệ Ghi chú: PPL: tỉ lệ phần trăm locus đa hình, NA: số alen cho locus, AE: số alen hữu hiệu, AR: Số alen giàu, I: số đa dạng Shannon, HO HE: hệ số gen dị hợp tử quan sát kỳ vọng, FIS: số fix, FISIIM: số cận noãn điều chỉnh với alen lặn, A: thiếu hụt gen dị hợp tử, kiểm định với tail, B: vượt trội gen dị hợp tử với kiểm định tail, C: vượt trội gen dị hợp tử với kiểm định tail, SE: sai số cho phép, *p < 0,05, **p < 0,01 ***p < 0,001 Chỉ số Fix dương quan sát quần thể Chân Mộng, Phù Ninh Minh Phú giá trị âm quan sát Hy Cương Chỉ số Fix quần thể có ý nghĩa Các số hiệu chỉnh theo mơ hình sinh sản cận nỗn (FISIIM) dao động từ 0,078 Chân Mộng đến 0,198 Hy Cương, trung bình 0,125 Chỉ số sau hiệu chỉnh cao số FIS Chỉ số cận nỗn cho lồi (FIT) trung bình 0,156 (Bảng 3) vượt trội hệ số gen đồng hợp tử Phân tích tượng thắt cổ chai thiếu hụt gen dị hợp tử tìm thấy cho quần thể Minh Phú có ý nghĩa (p < 0,01) Điều giả thiết có dấu hiệu suy giảm kích thước quần thể Minh Phú So với kết nghiên cứu trước đây, Chị nâu có mức độ đa dạng thấp (HE = 0,265; HE = 0,287), ví dụ Shorea leprosula (HE = 0,709 [15]; HE = 0,686 [16]; HO = 0,63 - 0,66, HE = 0,69 - 0,71 [17], S robusta (HO = 0,68, HE = 0,68 [18], Dryobalanops aromatica (HO = 0,572, HE = 0,607 [5] Dr beccarii (HO = 0,406, HE = 0,404 [8], Dipterocarpus dyeri (HO = 0,527, HE = 0,601 [19] Hơn nữa, kết số alen cho locus thấp so với loài Dryobalanops aromatica (NA = 5,1; NA = 6,54 [20], S leprosula (NA = 11,0-11,4 [17] Lồi Chị nâu suy giảm số alen giàu Đa dạng di truyền cao phản ánh khả thích nghi tốt với mơi trường trì khả tiến hóa lồi Chị nâu lồi bị đe dọa có đa dạng di truyền thấp, nơi sống bị suy giảm phân cắt mạnh Loài đối tượng bị khai thác mức Đây nguyên nhân ảnh hưởng đến đa dạng di truyền lồi Phú Thọ 3.2 Cấu trúc di truyền quần thể Phân tích ANOVA mức độ khác mức phân tử, chủ yếu xảy cá thể lồi Chị nâu (chiếm 77,13%), mức độ khác xảy quần thể 14,34% thấp (8,53%) cá thể quần thể (Bảng 5) Mức độ khác phù hợp với kết phân tích mức độ khác di truyền quần thể (FST = 0,135 G’ST = 0,18) Kết mức độ trao đổi di truyền lồi cao, trung bình (Nm = 2,759) Bảng Khác mức độ phân tử (ANOVA) từ quần thể Phú Thọ 82 df (mức tự do) Tổng bình phương Thành phần khác Tổng mức độ khác (%) Giữa quần thể 27,341 0,2 14,34 Giữa cá thể quần thể 74 97,319 0,119 8,53 Trong cá thể 78 84 1,077 77,13 Tổng 155 208,66 1,396 100 Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 29, 12-2022 Nghiên cứu khoa học cơng nghệ Trên sở phân tích nhóm gen quần thể theo phương pháp NJ sử dụng ma trận giá trị FST khám phá nhóm gen chính, nhóm gồm quần thể Chân Mộng, nhóm gồm quần thể cịn lại (Hình 2) Tuy nhiên, nhóm 2, quần thể Phù Ninh tách thành nhóm độc lập Kết phù hợp với phân tích Bayesia sử dụng STRUCTURE kết hợp với STRUCTURE HARVESTER (Hình 3) với STRUCTURESELECTOR (Hình 4) Kết giả thiết rằng, cấu trúc nhóm gen liên quan đến trao đổi di truyền quần thể với khoảng cách địa lý Khoảng cách địa lý quần thể gần có cấu trúc gen tương đồng kết hợp với để hình thành nhóm Tuy nhiên, mức độ rối loạn thảm thực vật khai thác loài ảnh hưởng đến cấu trúc di truyền quần thể loài nghiên cứu Hình Mối quan hệ di truyền quần thể Chị nâu sở phân tích NJ Hình Kết phân tích STRUCTURE cho quần thể Chị nâu Phú Thọ, giá trị deltaK với nhóm K (1-10) mức độ trộn lẫn nhóm gen quần thể Mức độ đa dạng di truyền khác quần thể Chò nâu tương tự loài D alatus (FST = 0,274), Hopea ordorata (FST = 0,26) [4], Dryobalanops beccarii (FST = 0,308) [5] Trao đổi di truyền Chò nâu xác định phát tán hạt phấn, đóng góp vào cấu trúc di truyền loài Mức độ khác quần thể thấp phản ánh mức độ trao đổi di truyền cao Lồi Chị nâu có mức độ trao đổi di truyền cao (Nm > 1) số lượng di trú cho hệ cao Cấu trúc di truyền Chò nâu xác định rõ Bởi vậy, giả thiết tồn cấu trúc di truyền Chò nâu kết trao đổi gen liên quan đến khoảng cách địa lý phân cách nơi sống hướng đến nhóm gen khác Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 29, 12-2022 83 Nghiên cứu khoa học cơng nghệ Hình Các nhóm gen xác định MedMed K, MedMean K, MaxMed K MaxMean K 3.3 Bảo tồn phục hồi loài bị đe dọa Trước nguy suy giảm biến nhiều loài động thực vật (462 loài thực vật 418 loài động vật bị đe dọa theo Sách Đỏ Việt Nam [3] hoạt động phá rừng khai thác mức, hệ thống khu bảo tồn thiết lập Lồi Chị nâu phân bố chủ yếu số tỉnh miền núi phía Bắc bảo vệ khu bảo tồn thuộc khu vực Tuy nhiên, để bảo tồn hiệu quả, kết nghiên cứu sinh học sinh thái đa dạng di truyền mức độ quần thể lồi đóng vai trị quan trọng có ý nghĩa Trên sở sử dụng cặp mồi SSR phân tích cho 78 cá thể thuộc quần thể Chò nâu Phú Thọ, mức độ đa dạng di truyền thấp xác định Quần thể nhỏ cô lập thường trì mức độ đa dạng di truyền thấp liên quan đến trôi dạt gen ngẫu nhiên tăng gen đồng hợp tử cho alen phổ biến alen hiếm, phản ánh mối quan hệ thụ phấn cận noãn cao xuất quần thể Mức độ khác quần thể loài liên quan đến khả hạn chế trao đổi di truyền quần thể thông qua thụ phấn nhờ trùng di chuyển hạt theo dịng nước gió nhờ có cánh Khoảng cách địa lý lớn nơi sống bị phân cắt quần thể lồi làm hạn chế dịng gen Hệ số sai khác di truyền lớn mức độ cô lập quần thể cao Trên sở kết nghiên cứu, quần thể Chò nâu đề xuất bảo tồn hai mức độ, nguyên vị chuyển vị Quần thể có mức độ đa dạng di truyền cao Hy Cương Minh Phú ưu tiên cho công tác bảo tồn nguyên vị Cận noãn cao (FIS > 0,2) phát quần thể Phù Ninh kích thước quần thể bị suy giảm Điều hạn chế phát tán hạt phấn Để tránh cận noãn bảo tồn chuyển vị thông qua thu thập hạt nhân giống vườn giống xem nguồn vật liệu để phục hồi tính đa dạng quần thể lồi 84 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 29, 12-2022