Nghiên cứu cấy chuyển vi rút dịch tả lợn châu phi trên tế bào sơ cấp và kiểm tra vô trùng, thuần khiết của các chủng vi rút dịch tả lợn châu phi phân lập được

Bệnh dịch tả lợn Châu Phi xuất hiện tại Việt Nam vào năm 2019, được phát hiện đầu tiên tại trại lợn tỉnh Hưng Yên, sau đó lan rộng ra toàn quốc. Tính đến nay dịch bệnh cơ bản đã được khống chế, không còn lây lan trên diện rộng như thời điểm mà nó xuất hiện. Số liệu cập nhật mới nhất của Bộ NNPTNT cho thấy, từ đầu năm 2020 đến nay, bệnh dịch tả lợn Châu Phi có xu hướng giảm mạnh khi cả nước chỉ phát sinh thêm 24 ổ dịch bệnh dịch tả lợn Châu Phi làm 19.472 con lợn mắc bệnh và tiêu hủy

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA THÚ Y -  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU CẤY CHUYỂN VI RÚT DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI TRÊN TẾ BÀO SƠ CẤP VÀ KIỂM TRA VÔ TRÙNG, THUẦN KHIẾT CỦA CÁC CHỦNG VI RÚT DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI PHÂN LẬP ĐƯỢC Sinh viên thực : TRẦN THỊ BÍCH Lớp : TYC – K61 Mã SV : 613329 Giảng viên hướng dẫn : GS.TS NGUYỄN THỊ LAN Bộ môn : BỆNH LÝ THÚ Y HÀ NỘI - 2021 LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp, nhận nhiều giúp đỡ thầy giáo, gia đình, người thân bạn bè Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo, cô giáo cán Học viện Nông nghiệp Việt Nam Những người tận tình dạy, tạo điều kiện học tập cho tơi suốt q trình học tập rèn luyện trường Đặc biệt xin chân thành cảm ơn cô giáo – GS.TS Nguyễn Thị Lan, giảng viên môn Bệnh lý – khoa Thú y, người giúp đỡ tơi suốt q trình thực tập hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình tập thể cán nhân viên Bệnh viện Thú y – Phòng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ sinh học Thú y, Ngõ 64 – Ngô Xuân Quảng – Trâu Quỳ – Gia Lâm – Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành đề tài, đặc biệt Ths Nguyễn Thị Hoa, chị tận tình dạy tạo điều kiện tốt cho học tập làm việc phịng ni cấy tế bào Cuối xin gửi tới thầy cô, gia đình bạn bè tình cảm chân thành lời cảm ơn chân thành Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả Trần Thị Bích i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đề tài nghiên cứu thực hiện, kết nghiên cứu trình bày khóa luận trung thực, khách quan Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận tốt nghiệp cám ơn, thơng tin trích dẫn khóa luận tốt nghiệp rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả Trần Thị Bích ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích đề tài .2 Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 LỊCH SỬ CỦA BỆNH DTLCP 2.2 CĂN BỆNH HỌC 2.2.1 Nguyên nhân gây bệnh 2.2.3 Sức đề kháng vi rút Dịch tả lợn Châu Phi 2.2.4 Đặc tính nuôi cấy .8 2.2.5 Độc lực vi rút 2.3 DỊCH TỄ HỌC 10 2.3.1 Loài vật mắc bệnh 10 2.3.2 Chất chứa vi rút .10 2.3.3 Phương thức lây truyền 10 2.3.4 Cơ chế sinh bệnh .12 2.4 TRIỆU CHỨNG CỦA BỆNH DTLCP 13 2.5 BỆNH TÍCH CỦA BỆNH DTLCP 15 2.6 CHẨN ĐOÁN BỆNH 15 2.6.1 Chẩn đoán lâm sàng 15 2.6.2 Chẩn đoán phân biệt 16 2.6.3 Chẩn đốn phịng thí nghiệm 17 2.7 PHÒNG, ĐIỀU TRỊ VÀ KIỂM SOÁT BỆNH 18 iii Phần III ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 19 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu .19 3.1.3 Thời gian nghiên cứu .19 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 19 3.3 VẬT LIỆU 19 3.3.1 Hóa chất 19 3.3.2 Dụng cụ mẫu vật 20 3.3.3 Máy móc, thiết bị .20 3.3.4 Mẫu vi rút để cấy chuyển 20 3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.4.1 Phục hồi tế bào sơ cấp đại thực bào phế nang phổi 20 3.4.2 Phân lập vi rút DTLCP môi trường tế bào sơ cấp PAM .20 3.4.3 Phương pháp PCR 21 3.3.4 Phương pháp RT-PCR .23 3.4.5 Phương pháp điện di đọc kết 25 3.4.6 Phương pháp xác định hiệu giá vi rút 26 3.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 27 PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết cấy chuyển vi rút DTLCP môi trường tế bào sơ cấp PAM 28 4.2 Kết nghiên cứu nồng độ vi rút sau thích nghi tế bào sơ cấp PAM .32 4.3 Kết kiểm tra vô trùng chủng vi rút DTLCP 33 4.4 Kết kiểm tra độ vô trùng, khiết chủng vi rút DTLCP 36 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 5.1 KẾT LUẬN 42 iv 5.2 KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Khả tồn vi rút DTLCP nhiều điều kiện môi trường Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR .22 Bảng 3.2 Trình tự nucleotide cặp mồi sử dụng phản ứng PCR 22 Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR .23 Bảng 3.4 Nhiệt độ gắn mồi vi rút CPV2 Mycoplasma cần kiểm tra .23 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng RT-PCR 24 Bảng 3.6 Trình tự nucleotide cặp mồi sử dụng phản ứng RT- PCR .25 Bảng 3.7 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR 25 Bảng 3.8 Nhiệt độ gắn mồi vi rút 25 Bảng 4.1 Kết theo dõi nhân lên vi rút DTLCP môi trường tế bào sơ cấp PAM qua đời cấy chuyển 28 Bảng 4.2 Kết cấy chuyển vi rút DTLCP phân lập môi trường tế bào sơ cấp PAM đời cấy chuyển P3 30 Bảng 4.3 Kết cấy chuyển vi rút DTLCP phân lập môi trường tế bào sơ cấp PAM đời cấy chuyển P7 31 Bảng 4.4 Kết xác định nồng độ vi rút HAD50/ml chủng vi rút DTLCP đời P7 32 Bảng 4.5 Kết kiểm tra vô trùng chủng vi rút phân lập đời P7 33 Bảng 4.6 Kết kiểm tra độ vô trùng chủng vi rút DTLCP đời P7 môi trường Thioglycollat, trypticaza đậu tương, thạch máu .37 Bảng 4.7 Kết kiểm tra vô trùng chủng vi rút DTLCP đời P7 môi trường canh thang PPLO, thạch PPLO 38 Bảng 4.8 Kết kiểm tra vô trùng chủng vi rút DTLCP đời P7 môi trường thạch XLD, canh thang tetrathionat 39 Bảng 4.9 Kiểm tra vô trùng chủng vi rút DTLCP đời P7 thạch Sabouraud 40 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình thái cấu trúc vi rút Dịch tả lợn Châu Phi Hình 4.1 Khả gây bệnh tích tế bào (HAD) vi rút đời P3 DTLCP mơi trường tế bào sơ cấp PAM sau thích nghi tế bào .31 Hình 4.2 Kết điện di sản phẩm PCR phát Mycoplasma 34 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR phát PCV2 34 Hình 4.4 Kết điện di sản phẩm RT-PCR phát CSFV 35 Hình 4.5 Kết điện di sản phẩm RT-PCR phát PRRSV .35 Hình 4.6 Kết kiểm tra vơ trùng môi trường nước thịt 41 Hình 4.7 Kết kiểm tra vơ trùng môi trường thạch máu .41 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt VIRUS DTLCP : African swine fever (Dịch tả lợn Châu Phi) VIRUS DTLCPV : African swine fever virus (virus Dịch tả lợn Châu Phi) PAM : Porcine Alveolar Macrophages (đại thực bào phế nang phổi lợn) CPE : Cytophathogenic Effect (bệnh tích tế bào) HAD : Haemadsorption (phản ứng hấp phụ hồng cầu) CSF : Classic Swine Fever (bệnh dịch tả lợn cổ điển) PRRS : Porcine reproductive and respiratory syndrome (Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn) FBS : Fetal Bovine Serum (Huyết thai bò) PBS : Phosphate Buffered Saline (dung dịch muối đệm phosphat) DNA : Deoxyribonucleic acid ( Axit Deoxyribonucleic) RNA : Ribonucleic acid ( axit Ribonucleic ) ELISA : Enzym – linked Imnuno Sorbent Assay ( phương pháp miễn dịch gắn enzyme EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid (axit Ethylene diamine tetraacetic ) Realtime PCR : Realtime Polymerase Chain Reaction ( phản ứng chuỗi Polymerase thời gian thực) RPMI : Môi trường nuôi cấy tế bào Ct : Cycle threshold ( chu kỳ ngưỡng) DMSO : Dimethy sulfoxide DTLCP : Dịch tả lợn Châu Phi Hpi : Giờ sau gây nhiễm viii TÓM TẮT NỘI DUNG Tên sinh viên: Trần Thị Bích Tên đề tài: Nghiên cứu cấy chuyển vi rút DTLCP tế bào sơ cấp kiểm tra vô trùng, khiết chủng vi rút DTLCP phân lập Ngành: Thú y Lớp: K61 – TYC Địa điểm thực tập: Phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y – Khoa Thú y, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Tơi thực đề tài nhằm mục đích: Nghiên cứu cấy chuyển vi rút Dịch tả lợn Châu Phi (DTLCP) làm sở cho việc định hướng nghiên cứu vắc xin chế phẩm sinh học hay kit chẩn đốn góp phần giảm thiệt hại kinh tế cho nghành chăn nuôi Phương pháp nghiên cứu: - Phương pháp phục hồi cấy chuyển vi rút tế bào đại thực bào phế nang lợn (PAM) - Phương pháp phân lập virus DTLCP - Phương pháp PCR - Phương pháp RT- PCR - Phương pháp điên di đọc kết - Phương pháp xác định hiệu giá virus - Phương pháp xử lý số liệu Kết kết luận: - Cấy chuyển thành cơng 15 chủng vi rút Dịch tả lợn Châu Phi liên tiếp đời tế bào PAM Hiệu giá chủng vi rút đạt từ 2,73 x 105 đến 1,26 x 107 HAD50/ml Kết hiệu giá cho thấy sau cấy chuyển vi rút DTLCP thích nghi tốt tế bào PAM ix ... nhiên cứu đề tài ? ?Nghiên cứu cấy chuyển vi rút DTLCP tế bào sơ cấp kiểm tra vô trùng, khiết chủng vi rút DTLCP phân lập được” 1.2 Mục đích đề tài Tơi thực đề tài nhằm mục đích: Nghiên cứu cấy chuyển. .. thấy sau cấy chuyển vi rút DTLCP thích nghi tốt tế bào PAM ix - Kết kiểm tra vô trùng, khiết chủng vi rút DTLCP phân lập cho thấy rằng: dịch nuôi cấy vi rút khơng có tượng tạp nhiễm vi khuẩn,... 28 4.2 Kết nghiên cứu nồng độ vi rút sau thích nghi tế bào sơ cấp PAM .32 4.3 Kết kiểm tra vô trùng chủng vi rút DTLCP 33 4.4 Kết kiểm tra độ vô trùng, khiết chủng vi rút DTLCP