Molecular typing protocol of ss469415590 in ifnl4 gene in relation to the clearance of hepatitis c virus

Untitled TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 20, SOÁ T1 2017 Trang 17 Xây dựng quy trình phân type đa hình đơn nucleotide trên gen IFNL4 có liên quan đến sự thanh thải virus viêm gan C  Nguyễn Trung Hi[.]

TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T1 - 2017 Xây dựng quy trình phân type đa hình đơn nucleotide gen IFNL4 có liên quan đến thải virus viêm gan C  Nguyễn Trung Hiếu  Trần Thị Nhựt Linh  Nguyễn Hữu Hùng Trường Đại học Nguyễn Tất thành  Nguyễn Hoàng Chƣơng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM ( Bài nhận ngày 19 tháng năm 2016, nhận đăng ngày 10 tháng 04 năm 2017) TĨM TẮT Chúng tơi xây dựng quy trình phân tử để xác hiệu cho dạng đa hình định đa hình đơn nucleotide (Single Nucleotide ss469415590_IFNL4_FAM cho đa hình G ss469415590_IFNL4_VIC cho đa hình TT Quy trình Polymorphism-SNP) gen IFNL4 kỹ thuật xây dựng đánh giá 95 mẫu DNA người real-time PCR với hai Taqman probe đặc hiệu cho tính tần số allele TT 93 % G dạng đa hình ss469415590 Quy trình xây % Kết so sánh hai phương pháp 10 dựng gồm bước: 1) Tách chiết DNA người từ mẫu lâm sàng cho thấy quy trình phân type máu tồn phần; 2) Nhân DNA người tách ss469415590 real-time PCR có độ xác chiết phản ứng real-time PCR (Polymerase 100 % chain reaction) với cặp mồi ss469415590_IFNL4_F ss469415590_IFNL4_R hai Taqman probe đặc Từ khóa: ss465415590, real-time PCR, SNP, interferon, Taqman probe MỞ ĐẦU Các nghiên cứu liên kết toàn gene (Genome Wide Association Study-GWAS) phát liên quan đa hình đơn nucleotide (Single Nucleotide Polymorphism-SNP) thải virus viêm gan C (Hepatitis C Virus-HCV) bệnh nhân điều trị interferon (IFN) kết hợp ribavirin Cụ thể SNP rs12979860, người mang genotype C/C có tỷ lệ đáp ứng siêu vi bền vững (Stable Viral Response-SVR) cao genotype khác C/T T/T Tương tự SNP rs8099917, người mang genotype T/T có tỷ lệ SVR cao người mang genotype T/G G/G [1, 2] Với lý này, việc phân biệt genotype có liên quan đến SNP cần thiết để tiên lượng khả đáp ứng điều trị bệnh nhân nhiễm HCV Trên thực tế, nhóm nghiên cứu nước phát triển nhiều phương pháp phân tử nhằm phân biệt genotype có liên quan đến SNP phương pháp realtime PCR với Taqman probe đặc hiệu cho alen, phương pháp PCR-RFLP phân biệt genotype dựa vào chiều dài sản phẩm cắt giới hạn phương pháp giải trình tự nucleotide Các phương pháp có ứng dụng thực tế lâm sàng Gần đây, SNP khác phát có liên quan đến thải HCV người bệnh điều trị với IFN-ribavirin, ss469415590 SNP gồm hai allele G TT, allele G allele bất lợi Trang 17 Science & Technology Development, Vol 20, No.T1- 2017 allele TT alen có lợi thải HCV điều trị [3] Cụ thể Franco cộng [4] cho thấy tỷ lệ thất bại điều trị 77 % người mang alen G tỷ lệ thấp (48 %) người không mang allele G Cơ chế phân tử đáp ứng người mang genotype G SNP nằm vùng mã hóa gene IFNL4 tạo interferon lambda Alen G tạo vùng mã hóa hồn chỉnh gene để tổng hợp IFNL4 allele TT làm lệch vùng mã hóa nên khơng tổng hợp IFNL4 Sự tiền kích hoạt truyền tín hiệu nội bào IFNL4 làm ức chế kích hoạt truyền tín hiệu nội bào interferon (IFN) type I (là interferon điều trị) type III Vì người mang allele G có cạnh tranh IFNL4 với IFN điều trị type làm giảm hiệu điều trị thuốc protein Theo tác giả, SNP liên quan chặt chẽ SNP rs12979860 rs8099917 việc thải HCV Với lý xây dựng phương pháp phân tử dựa kỹ thuật real-time PCR nhằm phân type SNP ss469415590 Phương pháp phân type nghiên cứu sử dụng để nghiên cứu phân bố tần số allele SNP có liên quan điều trị bệnh viêm gan siêu vi C ứng dụng để tiên lượng đáp ứng điều trị bệnh nhân viêm gan siêu vi C VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Chúng sử dụng primer Taqman probe cho phản ứng real-time PCR từ nghiên cứu Prokunika-Olsson cộng [3] bao gồm ss469415590_IFNL4_F(GCCTGCTGCAGAAGCAG AGAT) ss469415590_IFNL4_R (GCTCCAGCGAGCGGTAGTG) Các Taqman probe có gắn cấu tử MGB để tăng tính đặc hiệu bao gồm ss469415590_IFNL4_VIC (ATCGCAGAAGGCC) ss469415590_IFNL4_FAM (ATCGCA GCGGCCC) Các primer tổng hợp cung cấp công ty IDT DNA (Mỹ) Các Taqman probe chứa MGB Trang 18 tổng hợp cung cấp công ty Invitrogen (Mỹ) Các mẫu máu tồn phần, hóa chất thực phản ứng tách chiết DNA từ máu toàn phần, hóa chất thực phản ứng real-time duplex PCR, hóa chất dịng hóa sản phẩm PCR cung cấp Công ty TNHH Nam Khoa (Việt Nam) Tách chiết DNA từ máu toàn phần 500 L máu toàn phần huyền phù với 500 L dung dịch SSC 1X Ly tâm 10.000 v/p 30 giây loại dịch để thu nhận phân đoạn bạch cầu Rửa phân đoạn bạch cầu với dung dịch SSC 1X lần để thu nhận phân đoạn bạch cầu hemoglobin Thực bước phá tế bào, biến tính protein dung dịch guanidine-phenol-chloroform Ly tâm thu nhận dịch chứa DNA gen Tủa DNA gene với isopropanol rửa tủa DNA với ethanol 70 % DNA giữ trong dung dịch TE 1X Thực phản ứng real-time duplex PCR Thành phần phản ứng real-time tích 25 L bao gồm PCR buffer, dNTP, MgCl2, primer ss469415590_IFNL4_F ss469415590_IFNL4_R với nồng độ cuối 10 pmole, Taqman MGB probe ss469415590_IFNL4_VIC ss46941 5590_IFNL4_FAM với nồng độ cuối pmole Chương trình luân nhiệt sau: 95 oC–5 phút (1 chu kỳ), 95 oC–15 giây, 60 oC–1 phút (40 chu kỳ) Tiến hành phản ứng real-time PCR phân tích kết real-time thực máy luân nhiệt RotorGene Q (Qiagen) Giải trình tự nucleotide DNA người nhân phản ứng PCR với cặp mồi ss469415590_IFNL4_F ss469415590_IFNL4_R Sản phẩm PCR tinh giải trình tự nucleotide cơng ty Macrogen (Hàn Quốc) Trình tự DNA giải mã phân tích chương trình Chromas (Technelysium Ply Ltd) Xử lý thống kê Các kết real-time PCR xử lý công cụ Excel Phân phối Hardy-Weinberg tần số alen TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T1 - 2017 tính tốn phần mềm SNP Stats (http://bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nguyên nhân chọn SNP ss469415590 Ngồi đa hình đơn nucleotide (SNP) rs12979860 rs8099917, gần SNP phát có liên quan đến thải HCV điều trị bệnh nhiễm virus với IFN SNP có hai allele G TT, G allele bất lợi cịn TT allele có lợi Việc xác định đa hình đơn nucleotide SNP giúp tiên lượng cho việc điều trị bệnh viêm gan siêu vi C thuốc IFN, vốn phương thức điều trị HCV giới [5] Ngoài ra, Việt Nam thời điểm thực nghiên cứu này, chúng tơi chưa thấy có nghiên cứu nhằm phân type ss469415590 tiến hành Với lý này, thực nghiên cứu xây dựng quy trình phân tử dựa kỹ thuật real-time nhằm phân type ss469415590 Thiết kế kiểm tra mẫu chứng amplicon deltaG Theo Prokunika-Olsson [3] tần số allele TT đạt tới 93 % người châu Á, điều có nghĩa genotype G/G khó phát đề tài Vì vậy, cần thiết kế amplicon DNA mang alen G để làm mẫu chứng xây dựng quy trình phân type SNP Chúng tơi sử dụng đoạn trình tự nucleotide nằm hai primer ss469415590_IFNL4_F ss469415590_IFNL4_R gene IFNL4 kéo dài đầu 5‟ 3‟ đoạn trình tự để tạo điều kiện thuận lợi cho bắt cặp cặp primer vào mạch khn Trình tự nucleotide amplicon deltaG trình bày sau: 5‟CCCTCTCTTTGGCTTCCCTGACGTCTCTCGG CCTGCTGCAGAAGCAGAGATGCGGCCGAGTG TCTGGGCCGCAGTGGCCGCCGGGCTGTGGGT CCTGTGCACGGTGATCGCAGCGGCCCCCCGGC GCTGCCTGCTCTCGCACTACCGCTCGCTGGAG CCCGGACGCTGGCGGCTGCCAAGGCGCTGAG GGACCGCTACGT-3‟ Vùng gạch đầu 5‟ 3‟ amplicon vị trí bắt cặp cặp primer, vùng gạch in nghiêng trình tự vị trí bắt cặp Taqman probe G, chữ in đậm vị trí SNP ss469415590 Sau đó, đoạn trình tự gửi tổng hợp hóa học cơng ty IDT DNA dạng đoạn DNA mạch đơi (gBlock® gene fragment) Đoạn DNA mạch đơi tinh HPLC kiểm tra trình tự nucleotide cơng ty IDT DNA Chúng tơi khảo sát khả hoạt động amplicon phản ứng real-time PCR với hệ primer Taqman probe kết trình bày Hình Hình Kết khảo sát hoạt động amplicon delta G với hệ primer-Taqman probe Các đường huỳnh quang ghi sau: (1) (2) mẫu amplicon delta G mẫu chứng âm với cặp primer ss469415590_IFNL4_Fss469415590_IFNL4_R Taqman probe ss469415590_IFNL4_FAM, (3) (4) mẫu amplicon delta G mẫu chứng âm với cặp primer ss469415590_IFNL4_F- ss469415590_IFNL4_R Taqman probe ss469415590_IFNL4_VIC Trang 19 Science & Technology Development, Vol 20, No.T1- 2017 Kết khảo sát cho thấy mẫu amplicon G hoạt động tốt phản ứng real-time PCR thể qua tín hiệu huỳnh quang mẫu (1) khơng có tín hiệu huỳnh quang mẫu (2), (3), (4) Sản phẩm PCR từ amplicon G dịng hóa vào vector pJET1.2 (Fermentas) để tạo thành pIFNL4-dG Ngoài ra, mẫu chứng DNA mang genotype TT thu nhận phương pháp giải trình tự nhân PCR với cặp primer ss469415590_IFNL4_F ss469415590_IFNL4_R Sản phẩm PCR thu nhận được dịng hóa vào vector pJET1.2 để tạo thành pIFNL4-TT Các plasmid sử dụng làm mẫu chứng cho thí nghiệm sau Khảo sát quy trình tách chiết DNA ngƣời từ máu tồn phần Máu tồn phần thường chứa chất có khả ức chế phản ứng PCR, bật haemoglobin, protein IgG heparin [6-8] Trong nghiên cứu này, sử dụng chất chống đông EDTA quy trình tách chiết có sử dụng chất biến tính protein mạnh phenol guanidine thiocyanate giúp loại bỏ hiệu protein nên chất ức chế chủ yếu lại haemoglobin nằm phân đoạn hồng cầu Do đó, điểm quan trọng quy trình tách chiết DNA từ máu tồn phần nghiên cứu phải loại bỏ phân đoạn hồng cầu máu toàn phần thu nhận phân đoạn bạch cầu để tách chiết DNA Chúng loại bỏ hồng cầu máu toàn phần cách ly giải hồng cầu với dung dịch SSC 1X Sau đó, thực tách chiết DNA tổng số từ phân đoạn bạch cầu phương pháp phenolchloroform Chất lượng DNA tách chiết đánh giá thông qua phương pháp đo quang phổ kế phương pháp PCR Kết đo quang phổ cho thấy mẫu DNA có độ tinh cao (kết khơng trình bày) Kết PCR với cặp primer ss469415590_IFNL4_Fss469415590_IFNL4_R trình bày Hình Hình Kết nhân PCR DNA tách chiết từ máu toàn phần người Giếng 1: thang DNA; giếng 2: mẫu chứng âm; giếng dến 6: mẫu DNA từ máu toàn phần người Kết Hình cho thấy sản phẩm PCR có kích thước mong đợi 128 bp so sánh với thang DNA 100 bp Điều cho thấy DNA tách chiết từ máu tồn phần người khơng chứa chất ức chế PCR Tóm lại quy trình tách chiết DNA sử dụng cho DNA có khả nhân phản ứng PCR Khảo sát độ đặc hiệu primer-probe Độ đặc hiệu cặp primer định nghĩa khả nhân chọn lọc đích Vì Trang 20 chúng tơi khảo sát khả nhân chọn lọc cặp primer nhiều loại vật liệu di truyền khác nhau, bao gồm loại virus, vi khuẩn, nấm bệnh Các tác nhân xuất lúc thể người có khả nhân với cặp primer cặp primer sử dụng khơng đặc hiệu Ngồi ra, độ đặc hiệu Taqman probe cho alen khảo sát phản ứng real-time PCR với mẫu amplicon Kết khảo sát trình bày Bảng Hình TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T1 - 2017 Bảng Kết khảo sát khả nhân chọn lọc cặp primer IFNL4F IFNL4R Tác nhân Hepatitis C Virus Hepatitis B Virus DNA người Dengue Virus Escherichia coli Staphylococcus aureus Streptococcus pneumonia Candida albicans Nhân với cặp primer + - Nhân với primer đặc hiệu loài + + + + + + + Hình Kết khảo sát độ đặc hiệu allele Taqman probe Chú thích đường tín hiệu huỳnh quang: (1),(2),(3) plasmid pIFNL4-dG, plasmid pIFNL4-TT, mẫu chứng âm với cặp primer ss469415590_IFNL4_Fss469415590_IFNL4_R Taqman probe ss469415590_IFNL4_FAM, (4),(5),(6) plasmid pIFNL4-TT, plasmid pIFNL4-dG, mẫu chứng âm với cặp primer ss469415590_IFNL4_F - ss469415590_IFNL4_R Taqman probe ss469415590_IFNL4_VIC Kết khảo sát khả nhân chọn lọc cặp primer ss469415590_IFNL4_F ss469415590_IFNL4_R cho thấy cặp primer nhân chọn lọc DNA từ người cho sản phẩm PCR với kích thước mong đợi 128 bp Để kh ng định sản phẩm PCR có kích thước 128 bp thu nhận từ cặp primer ss469415590_IFNL4_F ss469415590_IFNL4_R đặc hiệu cho gene IFNL4, chúng tơi giải trình tự hai sản phẩm PCR với cặp primer này, sản phẩm đồng hợp tử TT/TT, sản phẩm lại dị hợp tử TT/G Trạng thái đồng hợp tử dị hợp tử sản phẩm PCR với cặp primer ss469415590_IFNL4_F ss469415590_IFNL4_R xác định phản ứng real-time PCR với hai Taqman probe đặc hiệu ss469415590_IFNL4_FAM ss469415590_IFNL4_VIC Kết giải phân tích trình tự nucleotide hai sản phẩm PCR trình bày Hình 4A, 4B, 4C Trang 21 Science & Technology Development, Vol 20, No.T1- 2017 4A 4B 4C Hình A, B, C Kết giải trình tự sản phẩm PCR đồng hợp tử TT/TT dị hợp tử TT/G Kết Hình 4A 4B cho thấy cho thấy sản phẩm PCR vùng trình tự nucleotide gene IFNL4 Mẫu dị hợp tử TT/G cho thấy có bước sóng đơi vị trí SNP vị trí mũi tên Hình 4C Như vậy, cặp primer sử dụng hồn toàn đặc hiệu cho gen IFNL4, cụ thể đoạn DNA chứa SNP ss469415590 Ngoài ra, Taqman probe cho thấy tính đặc hiệu allele cao: Taqman probe ss469415590_IFNL4_FAM cho kết dương tính pIFNL4-dG ngược lại Taqman probe ss469415590_IFNL4_VIC cho kết dương tính pIFNL4-TT Kết khảo sát độ đặc hiệu hệ primer Taqman probe cho thấy tính đặc hiệu cao phương pháp real-time duplex PCR việc phân type SNP ss469415590 Khảo sát độ nhạy Chúng khảo sát độ nhạy phương pháp real-time duplex PCR nồng độ pha loãng hai plasmid pIFNL4-dG pIFNL4-TT từ 5x104 đến 5x100 phản ứng PCR Tiến hành phản ứng PCR lặp lại lần nồng độ plasmid Kết trình bày Bảng Bảng Kết khảo sát độ nhạy phương pháp real-time duplex PCR Nồng độ pIFNL4-dG 5x104 copy/phản ứng 5x103 copy/phản ứng 5x102 copy/phản ứng 5x101 copy/phản ứng 5x100 copy/phản ứng Trang 22 Chu kỳ ngưỡng 21,5 ± 0,2 25,8 ± 0,4 29,5 ± 0,5 33,2 ± 0,7 37,6 ± 0,8 Nồng độ pIFNL4-TT 5x104 copy/phản ứng 5x103 copy/phản ứng 5x102 copy/phản ứng 5x101 copy/phản ứng 5x100 copy/phản ứng Chu kỳ ngưỡng 21,8± 0,2 25,2 ± 0,5 28,8 ± 0,6 32,9 ± 0,7 36,5 ± 0,9 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T1 - 2017 Bảng Kết ứng dụng quy trình phân type ss469115590 95 mẫu lâm sàng Tần số Genotype TT/TT TT/G G/G 86,3 % (82/95) 13,7 % (13/95) % (0/95) Alen TT G 93 % 7% Kết cho thấy phản ứng real-time duplex PCR có khả phát 5x100 plasmid phản ứng thể độ nhạy cao 23 % quần thể người châu Phi Điều giải thích khơng có mẫu mang genotype G/G 95 mẫu lâm sàng nghiên cứu Ứng dụng quy trình 95 mẫu DNA lâm sàng So sánh phƣơng pháp real-time duplex PCR với kỹ thuật giải trình tự nucleotide việc phân type ss469415590 Chúng ứng dụng quy trình xây dựng 95 mẫu máu toàn phần thu từ lâm sàng Kết phân type ss469415590 95 mẫu lâm sàng tần số allele trình bày Bảng Kết cho thấy có 82 mẫu mang genotype TT/TT 13 mẫu mang genotype G/TT Khơng có mẫu mang genotype G/G Các allele ss469415590 phân bố theo định luật Hardy-Weinberg (P=0,47) Tần số allele TT G 93 % % Kết phù hợp với kết cơng trình Prokunika-Olsson [3] đó, tần số allele TT chiếm tới 93 % quần thể người châu Á, tần số allele 68 % người châu Âu Kỹ thuật giải trình tự nucleotide tiêu chuẩn vàng phương pháp xác định genotype sinh vật Vì chúng tơi so sánh phương pháp real-time duplex PCR nghiên cứu với kỹ thuật giải trình tự nucleotide để đánh giá tính xác phương pháp Vùng gene giải trình tự nucleotide vùng genE nằm cặp primer ss469415590_IFNL4_F ss469415590_IFNL4_R So sánh hai phương pháp 10 mẫu lâm sàng Kết so sánh trình bày Bảng Bảng Kết so sánh real-time duplex PCR giải trình tự nucleotide việc phân type ss469415590 10 mẫu lâm sàng Mẫu máu 10 Kết giải trình tự nucleotide TT/TT TT/G TT/TT TT/TT TT/TT TT/TT TT/TT TT/TT TT/TT TT/TT Kết real-time duplex PCR TT/TT TT/G TT/TT TT/TT TT/TT TT/TT TT/TT TT/TT TT/TT TT/TT Trang 23 Science & Technology Development, Vol 20, No.T1- 2017 Kết so sánh cho thấy phương pháp real-time duplex PCR cho kết phân type ss469415590 tương đồng hoàn toàn với kỹ thuật giải trình tự nucleotide vùng gene IFNL4 chứa SNP KẾT LUẬN Chúng bước đầu xây dựng thành công quy trình real-time duplex PCR nhằm phân type ss49941550 Kết khảo sát cho thấy quy trình có độ đặc hiệu cao việc phân biệt allele G TT ss469415590, quy trình có khả phát phân type với nồng độ DNA 5x100 sao/phản ứng Độ xác 100 % so sánh với phương pháp chuẩn kỹ thuật giải trình tự nucleotide Quy trình đánh giá 95 mẫu DNA lâm sàng kết tần số allele TT G người Việt Nam 93 % % Từ kết này, nghiên cứu tiếp theo, đánh giá tiêu chất lượng độ nhạy độ đặc hiệu lâm sàng, độ ổn định, độ lặp lại, so sánh với phương pháp giải trình tự nucleotide số lượng mẫu lớn để đưa quy trình phân type ứng dụng thực tế lâm sàng nhằm tiên lượng điều trị bệnh viêm gan siêu vi C thuốc IFN Lời cảm ơn: Nghiên cứu tài trợ Quỹ phát triển Khoa học Công nghệ NTTU đề tài mã số 2016.01.21 Molecular typing protocol of ss469415590 in IFNL4 gene in relation to the clearance of hepatitis C virus  Nguyen Trung Hieu  Tran Thi Nhut Linh  Nguyen Huu Hung University Nguyen Tat Thanh  Nguyen Hoang Chuong University of Science, VNU-HCM ABSTRACT We built a molecular typing protocol of the ss469415590 SNP in the IFNL4 gene based on the real-time PCR technique with two Taqman probes which are specific for each allele of ss469415590 The protocol includes: (1) DNA extraction from whole blood; (2) DNA amplification in real-time PCR reactions with the primer pair of ss469415590_IFNL4_F - ss469415590_IFNL4_R and two speific Taqman probes ss469415590_IFNL4_FAM for the G allele and ss469415590_IFNL4_VIC for the TT allele The typing protocol was evaluated on 95 clinical DNA samples The allele frequencies were calculated as 93 % for the TT allele and % for the G allele The comparison of the typing protocol to the sequencing method revealed 100 % identical results Keywords: ss465415590, real-time PCR, SNP, interferon, Taqman probe Trang 24 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T1 - 2017 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] D Ge, J Fellay, A.J Thompson, J.S Simon, K.V Shianna, T.J Urban, E.L Heinzen, P Qiu , A.H Bertelsen, A.J Muir, M Sulkowski, J.G McHutchison, D.B Goldstein, Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment-induced viral clearance, Nature, 461, 399–401 (2009) [2] V Suppiah, M Moldovan, G Ahlenstiel, T Berg, M Weltman, M.L Abate, M Bassendine, U Spengler,G.J Dore, E Powell, S Riordan, D Sheridan, A Smedile, V Fragomeli, T Müller , M Bahlo, G.J Stewart, D.R Booth, J George, IL28B is associated with response to chronic hepatitis C interferon-alpha and ribavirin therapy, Nature Genetics, 41, 1100–1104 (2009) [3] L.O Prokunina, B Muchmore, W Tang, R.M Pfeiffer, H Park, H Dickensheets, D Hergott , P Porter-Gill, A Mumy, I Kohaar, S Chen, N Brand, M Tarway, L Liu, F Sheikh, J Astemborski, H.L Bonkovsky, B.R Edlin, C.D Howell, T.R Morgan, D.L Thomas, B Rehermann, R.P Donnelly, T.R O'Brien, A variant upstream of IFNL3 (IL28B) creating a new interferon gene IFNL4 is associated with impaired clearance of hepatitis C virus, Nature Genetics, 45, 164–171 (2013) [4].S Franco, E Aparicio, M Parera, B Clotet, C Tural, M.A Martinez, IFNL4 ss469415590 variant is a better predictor than ILF3 (IL28B) rs12979860 of pegylated interferonalpha/ribavirin therapy failure in hepatitis C virus/HIV-1 coinfected patients, AIDS, 28, 133– 136 (2013) [5] European Association for Study of the Liver, EASL clinical practice guidelines: management of chronic hepatitis B virus infection, Journal of Hepatology, 57, 167–185 (2015) [6] A Akane, K Matsubara, H Nakamura, S Takahashi, K Kimura., Identification of the heme compound copurified with deoxyribonucleic acid (DNA) from bloodstains, a major inhibitor of polymerase chain reaction (PCR) amplification, Journal of Forensic Sciences, 39, 362–372 (1994) [7] J Satsangi, D.P Jewell, K Welsh, M Bunce, J.I Bell, Effect of heparin on polymerase chain reaction, Lancet, 343, 1509–1510 (1994) [8] W.A Al-Soud, L.J Jönsson, P Rådström, Identification and characterization of immunoglobulin g in blood as a major inhibitor of diagnostic PCR, Journal of Clinical Microbiology, 38, 345–350 (2000) Trang 25 ... 5‟CCCTCTCTTTGGCTTCCCTGACGTCTCTCGG CCTGCTGCAGAAGCAGAGATGCGGCCGAGTG TCTGGGCCGCAGTGGCCGCCGGGCTGTGGGT CCTGTGCACGGTGATCGCAGCGGCCCCCCGGC GCTGCCTGCTCTCGCACTACCGCTCGCTGGAG CCCGGACGCTGGCGGCTGCCAAGGCGCTGAG... ss469415590_ IFNL4_ R (GCTCCAGCGAGCGGTAGTG) C? ?c Taqman probe c? ? gắn c? ??u tử MGB để tăng tính đ? ?c hiệu bao gồm ss469415590_ IFNL4_ VIC (ATCGCAGAAGGCC) ss469415590_ IFNL4_ FAM (ATCGCA GCGGCCC) C? ?c primer... Khoa h? ?c Công nghệ NTTU đề tài mã số 2016.01.21 Molecular typing protocol of ss469415590 in IFNL4 gene in relation to the clearance of hepatitis C virus  Nguyen Trung Hieu  Tran Thi Nhut Linh