Nghiên cứu áp dụng phương pháp công nghệ sinh học trong việc làm sạch virus nhằm phục tráng một số giống hành tỏi ở bắc việt nam

MỤC LỤC Trang THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1 Thông tin chung .1 Mục tiêu Tính mới, sáng tạo Kết nghiên cứu Sản phẩm Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết nghiên cứu khả áp dụng INFORMATION ON RESEARCH RESULTS General information Objective(s) .3 Creativeness and innovativeness Research results .3 Products Effects, transfer alternatives of research results and applicability PHẦN I: MỞ ĐẦU I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung hành tỏi 1.1.1 Cây hành đẻ (Allium wakegi) 1.1.2 Cây tỏi (Allium sativum L) 1.2 Tình hình sản xuất hành tỏi Việt Nam 1.3 Bệnh virus họ hành tỏi 7 1.3.1 Các loài virus gây bệnh họ hành tỏi 1.3.2 Tác hại virus gây họ hành tỏi 10 1.4 Phòng trừ bệnh virus hại hành tỏi 12 1.4.1 Các biện pháp nhằm ngăn chặn khả lây lan vectơ truyền bệnh 12 1.4.2 Hạn chế truyền lan virus qua vectơ truyền bệnh 1.4.3 Các biện pháp tạo giống bệnh 13 1.5 Các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus 1.5.1 Phương pháp lây nhiễm giới 15 15 13 1.5.2 Phương pháp ELISA (Enzym linked immunosorbent assay) 16 1.5.3 Phương pháp RT – PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) 16 1.6 Những nghiên cứu nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem) hành tỏi 17 II TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 19 III.MỤC TIÊU ĐỀ TÀI .20 3.1 Mục tiêu chung 20 3.2 Mục tiêu cụ thể 20 IV CÁCH TIẾP CẬN .21 V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 thu thập mẫu 21 5.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào 21 5.3 Phương pháp tách đỉnh sinh trưởng 23 5.4 Phương pháp đánh giá độ virus tái sinh phương pháp lây nhiễm giới24 5.5 Phương pháp đánh giá độ virus tái sinh phương pháp RTPCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction) 24 PHẦN II: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 I KẾT QUẢ ĐIỀU TRA ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH BỆNH VIRUS TRÊN CÂY HÀNH TỎI .30 1.1 Thành phần, triệu chứng bệnh virus gây hại hành tỏi Hà Nội vùng phụ cận 30 1.2 Tình hình phát sinh phát triển bệnh virus gây hại họ hành tỏi Hà Nội vùng phụ cận31 1.2.1 Trên tỏi ta31 1.2.2 Trên hành Đẻ 32 II NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY MÔ PHÂN SINH ĐỈNH VÀ TÁI SINH CÂY IN VITRO 34 2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến sức sống khả phát sinh hình thái đỉnh sinh trưởng tỏi ta 34 2.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin đến sức sống phát sinh hình thái đỉnh sinh trưởng36 2.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp BA IAA đến sức sống phát sinh hình thái đỉnh sinh trưởng 38 2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến sức sống khả phát sinh hình thái đỉnh sinh trưởng hành Đẻ 40 2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng BA đến phát sinh hình thái hành Đẻ từ đỉnh sinh trưởng ( meristem) 41 2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin đến phát sinh hình thái hành Đẻ từ đỉnh sinh trưởng (meristem) 42 2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp BA IAA đến tái sinh chồi hành Đẻ từ đỉnh sinh trưởng (meristem) 43 2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp BA - NAA đến tái sinh chồi từ đỉnh sinh trưởng (meristem) 44 III NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KHÁNG VIRUS RIBAVIRIN ĐẾN NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG .46 3.1 Nghiên cứu xử lý hóa chất kháng virus Ribavirin tới khả tái sinh đỉnh sinh trưởng tỏi 46 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng xử lý hóa chất kháng virus Ribavirin tới khả tái sinh đỉnh sinh trưởng hành 48 IV ĐÁNH GIÁ ĐỘ SẠCH VIRUS CỦA CÂY TÁI SINH IN VITRO TỪ ĐỈNH SINH TRƯỞNG .49 4.1 Đánh giá phương pháp lây nhiễm giới thị 49 4.1.1 Đánh giá độ virus tỏi tái sinh từ đỉnh sinh trưởng 49 4.1.2 Đánh giá độ virus hành tái sinh từ meritem 51 4.2 Đánh giá phương pháp RT – PCR (Reverse Transcriptase – polymerase chain reaction) 53 4.2.1 Cây tái sinh từ meristem kích thước ≤ 0,5mm ni cấy môi trường không bổ sung Ribavirin 53 4.2.2 Cây tái sinh từ meristem kích thước 0,7-1,0mm ni cấy môi trường bổ sung Ribavirin với nồng độ khác 54 V NHÂN NHANH IN VITRO CÂY SẠCH BỆNH TÁI SINH TỪ ĐỈNH SINH TRƯỞNG 56 5.1 Trên tỏi 56 5.2 Trên hành 61 VI NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH RA RỄ ĐẾN SỰ RA RỄ CỦA CÂY TÁI SINH SẠCH VIRUS 63 6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích rễ đến rễ tỏi tái sinh từ đỉnh sinh trưởng 63 6.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến rễ tái sinh từ đỉnh sinh trưởng 63 6.1.2 Ảnh hưởng than hoạt tính (THT) đến rễ chồi tỏi virus 64 6.1.3 Ảnh hưởng tổ hợp THT với IBA αNAA đến rễ chồi tỏi virus 65 6.2 Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích rễ đến rễ hành Đẻ tái sinh từ đỉnh sinh trưởng 66 VII KHẢ NĂNG SỐNG, SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA CÂY TÁI SINH SẠCH VIRUS .68 PHẦN III KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 72 3.1 Kết luận 72 3.2 Đề nghị .73 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng Thành phần bệnh virus họ hành tỏi triệu chứng bệnh khu vực Hà Nội vùng phụ cận .30 Bảng 2a Diễn biến bệnh sọc vàng LYSV tỏi ta vụ Thu – Đông năm 2011 hai xã Đặng Xá Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội 32 Bảng 2b Diễn biến bệnh sọc vàng hành củ SYSV giống hành Đẻ Bắc Ninh vụ Thu – Đông năm 2011 33 Bảng Ảnh hưởng nồng độ Kinetin đến sức sống khả phát sinh hình thái đỉnh sinh trưởng (sau tuần nuôi cấy) 36 Bảng Ảnh hưởng nồng độ BA đến sức sống phát sinh hình thái đỉnh sinh trưởng (sau tuần nuôi cấy) .38 Bảng Ảnh hưởng tổ hợp BA IAA đến sức sống phát sinh hình thái đỉnh sinh trưởng (Sau tuần nuôi cấy) 39 Bảng 6: Ảnh hưởng tổ hợp BA α NAA đến sức sống phát sinh hình thái đỉnh sinh trưởng (Sau tuần nuôi cấy) 40 Bảng 7: Ảnh hưởng BA đến sức sống tái sinh chồi từ meristem (Sau tuần nuôi cấy) 42 Bảng 8: Ảnh hưởng kinetin đến sức sống tái sinh chồi từ meristem (Sau tuần nuôi cấy) 42 Bảng 9: Ảnh hưởng tổ hợp BA IAA đến sức sống tái sinh chồi meristem (Sau tuần nuôi cấy) 43 Bảng 10 Ảnh hưởng tổ hợp BA -NAA đến tái sinh chồi từ meristem (Sau tuần nuôi cấy) 44 Bảng 11: Ảnh hưởng tổ hợp BA số loại đường đến khả tái sinh từ callus (Sau tuần nuôi cấy) 45 Bảng 12 Ảnh hưởng của Ribavinin đến khả tái sinh đỉnh sinh trưởng tỏi độ virus (sau tuần) 47 Bảng 13 Ảnh hưởng Ribavirin tới sức sống khả tái sinh đỉnh sinh trưởng hành (Sau tuần nuôi cấy) 49 Bảng 14 Kết phương pháp lây nhiễm giới đánh giá độ virus tái sinh từ đỉnh sinh trưởng (≤ 0,5mm) .50 Bảng 15a: Kết đánh giá độ bệnh tái sinh từ meristem (≤ 0,5mm) phương pháp lây nhiễm giới 51 Bảng 15b Kết đánh giá độ tái sinh từ meristem (0,81,0mm) môi trường có bổ sung Ribavirin phương pháp lây nhiễm giới 52 Bảng 16: Ảnh hưởng tổ hợp αNAA BA đến nhân nhanh chồi tỏi (sau tuần) 57 Bảng 17: Nhân nhanh chồi tỏi virus tái sinh chồi từ callus (sau tuần) 58 Bảng 18 Ảnh hưởng điều kiện khơng chiếu sáng tới q trình tạo củ in vitro virus (sau tuần) 60 Bảng 19 Ảnh hưởng tổ hợp BA kinetin đến nhân nhanh chồi (Sau tuần nuôi cấy) 62 Bảng 20 Ảnh hưởng IBA đến rễ chồi tỏi virus (sau tuần) 63 Bảng 21 Ảnh hưởng than hoạt tính (THT) đến rễ chồi tỏi virus (sau tuần nuôi cấy) 64 Bảng 22 Ảnh hưởng tổ hợp than hoạt tính (THT) với IBA αNAA đến rễ chồi tỏi virus (sau tuần nuôi cấy) 65 Bảng 23 Ảnh hưởng tổ hợp than hoạt tính chất điều tiết sinh trưởng tới rễ tái sinh (Sau tuần nuôi cấy) 67 Bảng 24 Khả sống sinh trưởng tái sinh từ meristem (sau tuần theo dõi) 68 Bảng 25 Khả sinh trưởng, phát triển hành, tỏi bệnh khỏe (sau trồng tháng) .70 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thông tin chung - Tên đề tài: Nghiên cứu áp dụng phương pháp công nghệ sinh học việc làm virus nhằm phục tráng số giống hành tỏi Bắc Việt Nam - Mã số: B2010-11-166 - Chủ nhiệm: PGS.TS.Nguyễn Thị Lý Anh - Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội - Thời gian thực hiện: 24 thỏng (thỏng 4/2010 đến 4/2012) Mục tiêu Nghiên cứu phục tráng số giống hành, tỏi áp dụng phương pháp công nghệ sinh học (nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, nhân nhanh in vitro, chẩn đoán bệnh marker phân tử…) nhằm tạo nguồn nguyên liệu phục vụ cho sản xuất giống hành, tỏi bệnh, chất lượng cao Tính mới, sáng tạo - Lần xây dựng thành công quy trình ni cấy đỉnh sinh trưởng ( apical meristem) cho giống hành Đẻ, giống tỏi ta tạo cỏc dũng cõy bệnh virus - Quy trình ni cấy meristem có hiệu tạo virus cao tương đối dễ thực - Quy trình sở cho việc cải tiến để áp dụng mở rộng trờn cỏc giống hành tỏi khác bị nhiễm bệnh virus Kết nghiên cứu - Đã điều tra, xác định số bệnh virus phổ biến gây hại hành tỏi khu vực Hà Nội vùng phụ cận - Đã xác định kích thước đỉnh sinh trưởng ni cấy phù hợp cho tái sinh in vitro - Đã xác định mơi trường ni cấy thích hợp cho tái sinh nhân nhanh in vitro hành tỏi từ đỉnh sinh trưởng, môi trường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng kết hợp với xử lý hoá chất kháng virus - Đã kiểm tra đánh giá độ bệnh virus hành, tỏi tái sinh từ meristem phương pháp lây nhiễm nhân tạo thị phương pháp RT-PCR - Đã trồng thử nghiệm hành, tỏi virus đánh giá sinh trưởng, phát triển chúng điều kiện vườn ươm Sản phẩm - Đề tài xây dựng 02 quy trình làm bệnh virus cho hành Đẻ tỏi ta phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem) - Đã tạo 1000 hành tỏi in vitro virus hồn tồn - Đề tài góp phần đào tạo 01 Thạc sĩ 04 kỹ sư ngành CNSH và bợ̀nh cõy - Có 02 báo chấp nhận đăng tạp chí “Khoa học phát triển” trường Đại học Nông nghiệp Hà nội Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết nghiên cứu khả áp dụng - Quy trình quy trình làm bệnh virus cho hành Đẻ tỏi ta phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (apical meristem) có hiệu tạo virus cao tương đối dễ thực - Các quy trình chuyển giao cho sở nghiên cứu, sản xuất giống có nhu cầu theo phương thức chuyển giao công nghệ - Cây hành tỏi bệnh tạo được dùng làm nguyên liệu cho việc tiếp tục sản xuất giống bệnh phục vụ cho nghiên cứu tạo giống đột biến, đa bội hóa … Ngày tháng Cơ quan chủ trì Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên) năm 2012 INFORMATION ON RESEARCH RESULTS General information Project title: Research on applying biotechnological method in eliminating viruses to vigorize some varieties of garlic and onion in the North of Vietnam Code number: B2010 – 11 - 166 Coordinator: Asc Prof Dr Nguyen Thi Ly Anh Implementing institution: Hanoi University of Agriculture Duration: 24 months, from 4/2010 to 4/2012 Objective(s) Using biotechnological methods (meristem culture, in vitro multi propagation, using molecular markers ) to create materials for seed production of virus-free garlic and onion varieties Creativeness and innovativeness Successfully develop apical meristem culture process for Wakegi onion and domestic garlic and create some virus-free lines for the first time The meristem culture process is highly effective in creating virus-free plants and easy to perform The process is considered as the basis for further improvement to apply to other infected garlic and onion varieties Research results - Investigated and identified some common viral diseases which are harmful to garlics and onions in Hanoi and surrounding areas - Identified the appropriate size of meristem for in vitro culture and regenerating completed plant from meristem - Identified the suitable culture medium for in vitro regeneration and rapid propagation of garlic and onion plants from the meristem, the medium for meristem culture with antiviral chemical treatment - Tested the virus-free level of onion and garlic plants which regenerate from meristem by using artificial infection on indicator plants and RT-PCR method - Grown the virus-free onion and garlic plants and evaluate the growth and development of them in nursery conditions Products - The study established two processes of viral disease elimination for Wakegi onion and domestic garlic by in vitro meristem culture method - The study created 1000 virus-free onion and garlic plants - The study helped train 01 Master and 04 Bachelors in biotechnology and pathology major - Two papers regarding the study results were accepted to be published in “Science and Development” journal Effects, transfer alternatives of research results and applicability - The viral disease elimination processes for De onion and domestic garlic by meristem culture are highly effective in creating virus-free plants and easy to perform These processes will be transferred to seed research and production facilities via technological transfer contract The virus-free onion and garlic plants are used for materials for virus-free seed production and the following research on creating mutant and poliploid plants Kết nghiên cứu cho thấy: + Trên môi trường MS0, bổ sung BA Ki nồng độ 2,0mg/l kích thích mẫu cấy tái sinh tạo callus, tỷ lệ tạo callus 43,76% công thức đối chứng tăng lên 100% CT2 BA Ki kích thích tăng sinh khối callus mạnh.Đồng thời, mơi trường kích thích callus tái sinh tạo chồi, tỷ lệ callus tạo chồi tăng từ 0% công thức đối chứng lên 67,23% cơng thức có bổ sung 2,0mg/l BA, 54,81% công thức bổ sung 2,0mg/l Kinetin + Việc thay 15g sacaroza/l 10g glucose/l + 5g manitol/l (MS3) có tác động kích thích mạnh khả phát sinh hình thái mẫu cấy Điều thể rõ so sánh CT1 CT4 Ở CT1 mẫu tạo callus với tỷ lệ 43,76%, CT4 cho tỷ lệ tạo callus đạt 100% tạo chồi đạt 10,27% + Trên môi trường MS3 bổ sung 2,0mg BA 2,0mg/l Kinetin tăng tỷ lệ mẫu tái sinh tạo chồi lên 100% Đồng thời, hệ số nhân chồi đạt 11,67 chồi/mẫu 7,35 chồi/mẫu + Kết luận: Mơi trường thích hợp để nhân nhanh chồi virus từ callus MS + 15g saccarose/l + 10g glucose/l + 5g manitol/l +2mg BA/l ĐC CT5: tuần CT2 (5 tuần) tuần tuần CT5 (5 tuần) tuần Hình 16 Tái sinh chồi tỏi virus từ callus c Bước đầu nghiên cứu trình tạo củ in vitro từ chồi virus Củ tỏi (căn tỏi) quan chứa nhiều chất dự trữ glucide phần gốc cuống phình to tạo nên Sự hình thành tỏi xảy vào giai đoạn sinh trưởng phát triển sinh sản quan dinh dưỡng ngừng hẳn sinh trưởng, tập trung tích luỹ dinh dưỡng 61 quan dự trữ Nhiều nghiên cứu cỏc cõy có thân dạng đế tỏi thường phản ứng rõ với tác nhân nhiệt độ ánh sáng Trong nuôi cấy in vitro tỏi, sử dụng điều kiện tuần khơng chiếu sáng nhằm hạn chế q trình sinh trưởng sinh dưỡng, tăng tích luỹ cho quan dự trữ Thử nghiệm với mẫu tái sinh môi trường bổ xung 0.5 mg/l IBA 0.5 g/l than hoạt tính Mơi trường MS1 có lượng đường 50 g/l Cỏc cõy thí nghiệm đặt tối tuần Theo dõi kết cho thấy, công thức đối chứng (nuôi cấy điều kiện ánh sáng binh thường) cho kết đoạn thân củ khơng phình to Đối với cỏc cõy đặt tối quan sát thấy phình to thân củ, mơi truờng khác cho kích thước đoạn thân phình to khác Trên mơi trường MS1 có đặt tối cho kích thước củ lớn nhất, sau môi trường bố xung thêm 0.5 mg/l IBA kích thước củ nhỏ thu mơi trường bổ xung 0.5 g/l THT IBA auxin ức chế hình thành củ hành nên có phình to đoạn thân kích thước khơng lớn Than hoạt tính có tính hấp phụ số chất có lợi mơi trường ni cấy nên kích thước thân củ nhỏ Đặc biệt, chúng tơi quan sát thấy có rễ số chứng tỏ điều kiện bóng tối có ảnh hưởng kích thích tới hình thành rễ tái sinh Trong điều kiện thí nghiệm, bước đầu chúng tơi rút kết luận điều kiện khơng chiếu sáng có ảnh hưởng tích cực tới q trình tạo củ in vitro tỏi Trong chất điều tiết sinh trưởng IBA than hoạt tính có tác dụng âm tính với tạo củ tối Bảng 18 Ảnh hưởng điều kiện không chiếu sáng tới trình tạo củ in vitro virus (sau tuần) Công thức Không đặt tối (đ/c) Đặt tối tuần MS1 Đoạn thân củ khơng phình to Đoạn thân củ phình to, kích thước lớn MS1 + 0.5 mg/l IBA Đoạn thân củ khơng phình to Đoạn thân củ phình to, kích thước trung bình MS1 + 0.5 g/l THT Đoạn thân củ khơng phình to Đoạn thân củ phình to, kích thước nhỏ 62 Đoạn thân phình to (MS1) sau tuần đặt tối Đoạn thân củ phình Đoạn thân củ phình Kích thước củ in trung bình (MS1 + nhỏ (MS1 + 0.5 0.5 mg/l IBA) Sau tuần đặt tối g/l THT) Sau tuần đặt tối vitro sau tuần Hình 17 Ảnh hưởng điều kiện không chiếu sáng đến hình thành củ invitro tỏi virus 5.2 Trên hành Đối với hành (Allium wakegi) khụng thể nhân nhanh thõn vỡ thõn thật hành ngắn, thối hóa, chúng dạng đế giò nằm sát thân giả mà thường nhân nhanh cỏc nhỏnh hành, tép hành Do mơi trường nhân nhanh thích hợp cho hành mơi trường tạo nhiều nhánh Trên môi trường MS tiến hành bổ sung hai loại chất điều tiết sinh trưởng BA (6-benzyladenin) kinetin (N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6amine) với tỷ lệ khác theo công thức Kết thu sau tuần nuôi cấy thể bảng 19 Chồi nuôi cấy môi trường không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng cho hệ số nhân thấp 1,22 lần Chồi sinh trưởng mơi trường CT5 có hệ số nhân cao 2,61 chồi đẻ nhánh không đồng đều, tỷ lệ chồi đẻ nhánh 61,29% chủ yếu chồi đẻ từ 5-8 nhánh với chiều cao thấp 8,79cm, số lỏ/cõy ớt 5,93 Do mơi trường cho hệ số nhân cao chưa phải môi trường nhân nhanh tốt vỡ cõy đẻ nhánh nhiều dinh dưỡng hấp thụ không đủ nuụi nhỏnh đẻ thờm nờn cỏc nhỏnh đẻ thêm sức sống kộm, thõn giả nhỏ, khả tái sinh Chồi phát triển môi trường CT3 hệ số nhân thấp không đáng kể 2.55 (lần) so với cơng thức điều quan trọng có tới 90,32% chồi đẻ nhánh phần lớn chồi đẻ 3-4 nhánh cỏc nhỏnh tương đối mập, to 63 hơn, cao 11,09cm, số lỏ/nhỏnh nhiều Do đó, mơi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi virus môi trường MS bổ sung 1mg/lBA 0.5mg/l kinetin Bảng 19 Ảnh hưởng tổ hợp BA kinetin đến nhân nhanh chồi (Sau tuần nuôi cấy) Chỉ tiêu Công Tỷ lệ chồi đẻ nhánh Thức (%) Chiều cao trung bình chồi (cm) Số lỏ/chồi (lỏ) Số rễ/chồi (rễ) Hệ số nhân (số nhánh/ chồi) CT1 22,58 5,76 3,65 1,32 1,22 CT2 22,58 10,70 3,45 0,61 1,38 CT3 90,32 11,09 6,58 0,35 2,55 CT4 51,61 9,77 5,26 0,29 2,22 CT5 61,29 8,79 5,93 0,51 2,61 LSD5% 0,14 0,12 0,04 0,05 CV% 0,80 1,40 4,00 1,50 Chú thích: CT1: MS+ 0mg/lBA + 0mg/kinetin CT2: MS+1,5mg/lBA+0mg/l kinetin; CT3:MS+1mg/lBA+0,5mg/l kinetin; CT4: MS+0,5mg/lBA+1mg/l kinetin CT5:MS+0,75mg/lBA+0,75mg/l kinetin Hình 18 Ảnh hưởng tổ hợp BA, Kinetin đến nhân nhanh chồi 64 VI NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH RA RỄ ĐẾN SỰ RA RỄ CỦA CÂY TÁI SINH SẠCH VIRUS 6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích rễ đến rễ tỏi tái sinh từ đỉnh sinh trưởng Sau tạo tái sinh, việc kích thích cho rễ quan trọng Nó làm tăng sức sống khả sinh trưởng, phát triển cho vườn ươm Trong thí nghiệm tái sinh chồi, chúng tơi thấy khơng có hình thành rễ mẫu cấy Vì vậy, việc tìm mơi trường thích hợp để cảm ứng tạo rễ tái sinh trở nên có ý nghĩa Ở thí nghiệm này, chúng tơi tiến hành thí nghiệm với IBA than hoạt tính (THT) Mẫu cấy cỏc cõy thu sau trình nhân nhanh có từ trở lên 6.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến rễ tái sinh từ đỉnh sinh trưởng IBA loại auxin dùng thông dụng nuôi cấy mô nhằm kích thích phát sinh rễ nhiều đối tượng thực vật Do vậy, tiến hành thử nghiệm với mức nồng độ IBA khác Kết thể bảng 20 Bảng 20 Ảnh hưởng IBA đến rễ chồi tỏi virus (sau tuần) Nồng độ TL sống (%) TL rễ (%) Số rễ/cõy (rễ) Chiều cao (cm) Số lỏ/cõy (lỏ) 100 6,70 2,10 4,70 3,45 CT 0,25 100 43,30 3,67 5,23 3,82 CT 0,50 100 56,72 4,53 5,65 3,87 CT 1,00 100 50,10 4,47 5,10 3,55 CV% 0.6 1.3 LSD5% 0.61 0.89 Công thức IBA (mg/l) CT1 (Đ/C) Qua bảng 20, thấy rằng: + IBA bổ sung vào môi trường nuôi cấy không ảnh hưởng đến khả sống mẫu chồi, tỷ lệ sống đạt 100% tất công thức 65 + Bổ sung IBA vào mơi trường ni cấy có tác dụng làm tăng rễ chồi đồng thời làm tăng chất lượng tỏi cấy mô Điều thể qua tiêu chiều cao, số lỏ/cõy Ở cơng thức đối chứng, có cú hình thành rễ tỷ lệ chồi rễ thấp đạt 6,70% số rễ đạt 2,10 rễ/cõy Tỷ lệ rễ tăng lên trờn cỏc cơng thức có bổ sung IBA vào mơi trường ni cấy Điều chứng tỏ IBA có tác dụng kích thích rễ cho mẫu chồi CT3 có nồng độ IBA bổ sung vào môi trường 0,5mg/l cho tỷ lệ chồi rễ cao 56,72% đạt 4,53 rễ/cõy 6.1.2 Ảnh hưởng than hoạt tính (THT) đến rễ chồi tỏi virus Than hoạt tính (THT) đưa vào môi trường nuôi cấy với mục đích tạo mơi trường tối giống tự nhiên thích hợp cho phát triển rễ Do đó, THT thường bổ sung vào mơi trường nhằm kích thích hình thành phát triển rễ Bảng 21 Ảnh hưởng than hoạt tính (THT) đến rễ chồi tỏi virus (sau tuần nuôi cấy) Nồng độ THT Công thức (g/l) TL sống TL rễ (%) (%) Số rễ/cõy (rễ) C cao (cm) Số lỏ/cõy (lỏ) CT1(Đ/C) 100 6,70 2,10 4,70 3,45 CT2 0,5 100 50,00 4,67 4,23 3,38 CT3 1,0 100 43,30 4,80 4,10 3,36 CV% 0.7 1.0 LSD5% 0.62 0.66 Bảng 21 cho thấy rằng: + THT có tác dụng kích thích hình thành rễ chồi tỏi Tỷ lệ chồi tạo rễ cao 50,00% CT2 (0,5g THT/l) Bên cạnh đó, THT kích thích tăng số rễ hình thành chồi (từ 2,10 rễ/cây công thức đối chứng tăng lên 4,80 rễ/cõy CT3) + Chiều cao số lỏ/cõy lại giảm dần tăng nồng độ THT Chiều cao đạt 4,70cm đạt 3,45 lỏ/cõy công thức đối chứng giảm xuống 4,10cm 3,36 lỏ/cõy CT3 (1g THT/l) Như vậy, THT làm giảm nhẹ sinh trưởng phát triển tỏi THT biết đến có khả hấp thụ lớn nên 66 trường hợp nú hấp thụ phần dinh dưỡng có mơi trường ni cấy ảnh hưởng đến sinh trưởng tỏi 6.1.3 Ảnh hưởng tổ hợp THT với IBA αNAA đến rễ chồi tỏi virus Có thể nói, tỷ lệ tái sinh tạo rễ bổ sung riêng rẽ THT IBA chưa cao đạt 60% kết từ hai thí nghiệm cho thấy THT IBA có khả làm tăng tỷ lệ tái sinh tạo rễ chồi tỏi Do vậy, đặt giả thuyết kết hợp THT với auxin IBA αNAA cho tỷ lệ chồi tái sinh tạo rễ cao Bảng 22 Ảnh hưởng tổ hợp than hoạt tính (THT) với IBA αNAA đến rễ chồi tỏi virus (sau tuần nuôi cấy) Nồng độ THT (g/l) Nồng độ αNAA Nồng độ IBA (mg/l) (mg/l) CT1(Đ/C) 0 CT2 0,5 CT3 TL sống (%) Tạo rễ (%) Số rễ/cõy (rễ) C.cao (cm) Số lỏ/cõy (lỏ) 100 6,74 2,22 5,12 3,58 0 100 51,54 4,74 5,00 3,60 0,5 0,25 100 96,38 5,02 5,31 3,60 CT4 0,5 0,5 100 100 5,19 5,47 3,69 CT5 0,5 0,25 100 93,20 5,07 5,32 3,61 CT6 0,5 0,5 100 98,00 5,12 5,34 3,66 CV% 1.0 1.2 LSD5% 0.94 0.75 Cơng thức Kết thí nghiệm cho thấy: + Tất cỏc cụng thưc thí nghiệm cho tỷ lệ sống 100% + Bổ sung αNAA IBA vào mơi trường có chứa 0,5g THT/l kích thích sinh trưởng rễ, thân chồi Sự sinh trưởng chiều cao, số cơng thức Hình 19 Cây hành hồn chỉnh 67 tương đối đồng đều, trung bình từ chiều cao từ 5,00 – 5,47cm số từ 3,58 – 3,69 lỏ/cõy + Tỷ lệ chồi tạo rễ tăng nhiều so với công thức đối chứng công thức chứa 0,5g THT Tỷ lệ chồi tạo rễ công thức bổ sung thêm αNAA IBA đạt cao, thấp 93,20% tổ hợp 0,5g THT + 0,25mg IBA/l (CT5) cao tổ hợp 0,5g THT + 0,5mg αNAA/l (CT4) + Số rễ hình thành chồi cao không bổ sung thêm αNAA IBA, cơng thức cho số rễ hình thành nhiều CT4 (đạt 5,19 rễ/cõy) Bên cạnh tổ hợp cho chất lượng rễ tốt Điều yếu tố cần thiết đảm bảo cho thích nghi giai đoạn sau in vitro + Qua thí nghiệm tạo hồn chỉnh chúng tơi kết luận: Mơi trường tạo hồn chỉnh tốt cho chồi tỏi môi trường MS0 + 0,5g THT/l + 0,5mg αNAA/l, đạt tỷ lệ rễ 100%, số rễ 5,19 rễ/cõy sinh trưởng phát triển tốt 6.2 Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích rễ đến rễ hành Đẻ tái sinh từ đỉnh sinh trưởng Sau tạo chồi tái sinh việc kích thích cho rễ việc làm quan trọng Nó làm tăng sức sống khả sinh trưởng, phát triển in vitro đưa vườm ươm Theo Novark, F J cộng (1983) môi trường rễ tốt họ hành tỏi mơi trường có bổ sung auxin (như IAA) số trường hợp thay IAA GA3 có tác dụng kích thích rễ Bên cạnh đó, Việc sử dụng than hoạt tính rễ cõy nghiên cứu nhiều đối tượng dưa hấu (Krug cộng sự, 2005; Pirinc cộng sự, 2003); cói Juncus effusus L., (Sarma cộng sự, 2000) Trong thí nghiệm chúng tơi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp than hoạt tính hai loại chất điều tiết sinh trưởng dụng phổ biến IAA NAA tới rễ tái sinh Mẫu nuôi cấy hành từ thí nghiệm nhân nhanh tương đối đồng đặc điểm hình thái cấy cơng thức thí nghiệm thu kết thể bảng 23 68 Cây hành tái sinh rễ tất cơng thức thí nghiệm với tỷ lệ 100% Trên môi trường MS bổ sung thêm than hoạt tính phát triển so với môi trường khác chiều cao, số lá, số nhánh số rễ Không thấp cao 9.68cm, khả đẻ nhỏnh kộm 1.4 nhỏnh/cõy mà khả rễ 2.17 rễ/cõy, chiều dài rễ hạn chế 5.86cm Do than hoạt tính khơng có tác dụng tốt cho sinh trưởng, rễ hành Có thể than hoạt tính hấp phụ chất điều tiết sinh trưởng số chất dinh dưỡng có mơi trường dẫn đến cản trở tăng trưởng chiều dài thân, tính hướng sỏng, tớnh ưu ngọn, tạo rễ phân hóa mạch dẫn làm cho cõy lựn hơn, khả đẻ nhánh rễ so với cõy trờn môi trường đối chứng Bảng 23 Ảnh hưởng tổ hợp than hoạt tính chất điều tiết sinh trưởng tới rễ tái sinh (Sau tuần nuôi cấy) Công thức Tỷ lệ rễ (%) Số rễ/cõy Chiều dài rễ (cm) Chiều cao (cm) Số lỏ/cõy Số nhỏnh/cõy CT1 100 3,18 9,70 11,78 5,66 1,97 CT2 100 2,17 5,86 9,68 3,53 1,40 CT3 100 2,63 13,73 12,16 4,58 1,77 CT4 100 2,92 15,80 12,00 4,17 1,68 LSD5% 0,05 0,07 0,03 0,08 0,05 CV% 0,90 0,30 0,10 1,00 1,40 Chú thích: CT1: MS, CT2: MS+0,5mg/l THT, CT3: MS+0,5mg/l THT+0,5 mg/l IAA, CT4: MS+0,5mg/l THT+0,5 mg/l αNAA Trên môi trường MS bổ sung đồng thời than hoạt tính auxin cao hơn, rễ dài có ý nghĩa so với cõy trờn môi trường MS khả đẻ nhánh, rễ Thí nghiệm cho thấy auxin IAA, NAA có tác dụng kích thích phân chia tế bào làm kéo dài chiều cao chiều dài rễ lại ức chế sinh sản chồi bên, rễ phụ tái sinh, nhanh già Trong hai loại auxin NAA có hiệu mạnh so với IAA, rễ tốt 2,92 rễ/cõy rễ dài 15,8cm NAA auxin nhân tạo IAA auxin tự nhiên nên đặc điểm phân tử NAA không bị tác dụng enzyme oxy hóa auxin (auxin-oxydase) Nhưng 69 môi trường tốt cho rễ hành môi trường MS không bổ sung thêm chất điều tiết sinh trưởng than hoạt tính với số rễ/cõy nhiều 3,18 rễ tương đối phát triển Tóm lại hành có khả rễ mạnh tỷ lệ rễ 100% tất cơng thức thí nghiệm Trên mơi trường MS khơng bổ sung chất điều tiết sinh trưởng có khả rễ tốt nhất, than hoạt tính khơng có thích hợp cho q trình rễ phát triển cây, bổ sung thêm IAA NAA làm tăng chiều cao chiều dài rễ, nhanh bị già hóa mà hạn chế phát sinh chồi phụ rễ phụ VII KHẢ NĂNG SỐNG, SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA CÂY TÁI SINH SẠCH VIRUS Đưa vườn ươm giai đoạn quan trọng trình sản xuất giống phương pháp ni cấy mơ tế bào, có có ý nghĩa đến ứng dụng trình nhân nhanh in vitro vào thực tiễn sản xuất Cây đưa vào giá thể phải khỏe mạnh, không bị nhiễm nấm, khuẩn, chiều dài trung bình từ – 6cm Cây có số lượng rễ nhiều, rễ dài Cây trồng nhiều loại giá thể khác : cát, trấu hun, xơ dừa, hỗn hợp cát – xơ dừa,… Trong thí nghiệm chúng tơi tiến hành trồng trờn giỏ thể cát + trấu hun (tỷ lệ : 1) Giá thể trước xử lý để tránh nhiễm nấm, bệnh Cây đủ tiêu chuẩn dùng nước rửa agar bỏm trờn rễ, sau trồng vào giá thể Cây trồng vào thời gian sớm chiều mát để tránh cho không bị héo nước Cây sau lấy khỏi ống nghiệm phải xử lý để trồng Cây trồng chậu, chậu trồng Sau tuần theo dõi, kết thu thể bảng 24 Bảng 24 Khả sống sinh trưởng tái sinh từ meristem (sau tuần theo dõi) Chỉ tiêu theo dõi Loại Cây hành in vitrro Tỏi Cây in Tỷ lệ sống Chiều cao Số Số chồi (%) (cm) (lỏ/cõy) (chồi/cõy) 77,78 16,4 3,21 1,28 - - - vitro 70 Củ in vitrro 100 22,0 2,40 1,10 Qua bảng 24 cho thấy cỏc cõy hành in vitro bệnh có khả sống cao sinh trưởng tốt giai đoạn vườn ươm Các củ tỏi in vitro sau trụ̀ ng mụ ṭ tuõ̀ n bắt đầu nảy mầm Sau đó mọc từ củ tăng trưởng chiều cao nhanh, lá mới và bắt đầu đẻ nhánh Sau tuõ̀ n trụ̀ ng tại vườn ươm đủ tiêu chuẩn xuất vườn đờ̉ trụ̀ ng điều kiện sản xuất Trong đó các tỏi in vitro đưa vườm ươm thời tiết khô lạnh của tháng 12/2011 đã không thích ứng được điều kiện vườm ươm và chết dần, sau tuõ̀ n trụ̀ ng không còn nào sống sót Do vậy, để có thể trồng tỏi in vitro sạch bệnh chúng cần phải tiếp tục nghiên cứu về mùa vụ cây, giá thể, chế độ chăm sóc và dinh dưỡng…đờ̉ xác định được điều kiện thích hợp cho đối tượng này Sau tuần trồng, hành tăng trưởng, bắt đầu đẻ nhánh Khả đẻ chồi hành cao so với tỏi khả tăng chiều cao ngược lại Sự sai khác đặc điểm vốn có hai giống nghiên cứu Hình 20 Cây hành bệnh tái sinh từ meristem bị bệnh ngồi vườn ươm 71 Hình 21 Cây tỏi bệnh tái sinh từ meristem bị bệnh vườn ươm Cây hành, tỏi bệnh tái sinh từ meristem trồng so sánh với hành, tỏi có triệu chứng bệnh virus điển hình (cây thấp tụt, có sọc vàng) Kết thí nghiệm thể bảng 25 Kết thí nghiệm cho thấy có khác biệt rõ ràng kích thước suất cá thể (khối lượng củ tươi) bệnh khỏe Đối với tỏi, sau tháng trồng chiều cao khỏe 1.4 lần so với bệnh thời gian trồng Về tiêu số lá, khối lượng cõy, cõy khỏe gần gấp đôi so với bệnh Đặc biệt, tiêu khối lượng củ tươi (thể suất cá thể) khỏe gấp 3.36 lần so với bệnh Điều chứng tỏ ảnh hưởng bệnh virus tỏi nặng nề, có ảnh hưởng lớn đến suất chất lượng củ tỏi sau thu hái Bảng 25 Khả sinh trưởng, phát triển hành, tỏi bệnh khỏe (sau trồng tháng) Chỉ tiêu Loại Tỏi Khỏe Bệnh Hành Khỏe Bệnh Chiều cao (cm) Số (lá/cõy) Khối lượng (g/cây) Khối lượng củ tươi (g/củ) Số nhánh (nhánh/cõy) 65,09 ± 7,19 6,2 ± 0,92 62,25 ± 13,43 25,01 ± 5,99 - 46,42 ± 4,54 3,2 ± 1,03 15,85 ± 4,38 7,429 ± 2,56 - 36,2 ± 2,30 4,6 ± 0,84 5,33 ± 1,18 - 1,8 ± 0,42 21,94 ± 1,81 3,8 ± 1,03 1,04 ± 0,26 - 1,9 ± 0,57 Trên đối tượng hành Đẻ, tiêu số lá, số nhánh khỏe bệnh không sai khác lớn (số khỏe 1.2 lần bệnh, số nhánh khỏe 0.95 lần bệnh) Nhưng chiều cao khỏe lớn 1.6 lần so với bệnh Tuy nhiên, bệnh virus lại ảnh hưởng mạnh mẽ đến khối lượng và sự khác biờ́t vờ̀ chỉ tiêu này là rất lớn (cây khỏe có khối lượng gần lần so với bệnh) Trên thực tế tiêu quan trọng vì định chủ yếu đến suất hành Đẻ (do hành Đẻ thu hoạch bán theo kg) Tương tự vậy, tỏi sạch bệnh có khối lượng cao gấp lần và khối lượng củ cao gấp 3,3 lần so với cõy bợ̀nh và cũng chính là chỉ tiêu để cấu thành suất tỏi sản xuất 72 Như vậy, qua thí nghiệm cho thấy bệnh virus có ảnh hưởng đến nhiều tiêu sinh trưởng, phát triển hành tỏi Đặc biệt, bệnh ảnh hưởng mạnh mẽ đến khối lượng củ tỏi khối lượng hành, tiêu quan trọng định đến suất đồng ruộng hành tỏi Thơng qua thí nghiệm thấy vai trò cần thiết giống hành Đẻ tỏi ta bệnh thực tế sản xuất 73 PHẦN III KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 3.1 Kết luận Từ kết đạt trình thực đề tài, rút số kết luận sau: 3.1.1.Về nội dung khoa học đề tài: - Vấn đề nhiễm bệnh virus hành tỏi cao có chiều hướng gia tăng Tỷ lệ bệnh cao xã Đặng Xá 1,48%, xã Cổ Bi 3,75%, Đại Phúc, Bắc Ninh tỷ lệ bệnh 15,6%; Tây Tựu, Từ Liêm, Hà Nội tỷ lệ bệnh 9,2% - Mơi trường thích hợp để tái sinh chồi tỏi từ đỉnh sinh trưởng môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA Đối với hành, môi trường MSo bổ sung 0,75mg/l BA 0,5mg/l IAA Mơi trường thích hợp để tái sinh gián tiếp chồi từ meristem thông qua hình thành callus là: MS + g/l manitol + 10 g/l glucose + 15 g/l saccarose + 2,0 mg/l BA - Đới với tỏi, mơi trường thích hợp để nhân nhanh chồi đơn bệnh là: môi trường MS bổ sung 30g saccarose + 2,0mg BA/l + 0,5mg αNAA/l; mơi trường thích hợp để nhân nhanh chời bệnh từ callus là: MS + g/l manitol + 10 g/l glucose + 15 g/l saccarose + 2,0 mg/l BA Đối với hành môi trường MS bổ sung 1mg/lBA 0.5mg/l kinetin là môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi đơn sạch virus - Môi trường rễ thích hợp tỏi tái sinh môi trường MS + 0,5g THT + 0,5mg αNAA/l Đối với hành để tạo rễ cho chồi tái sinh môi trường MS không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng là phù hợp nhất - Ribavirin khơng có tác dụng tốt cho tái sinh meristem, tỷ lệ mẫu tái sinh thấp sinh trưởng phát triển Các mẫu meristem (0,7 -1,0mmm) tái sinh môi trường có bổ sung Ribavirin kiểm tra độ bệnh virus phương pháp lây nhiễm thị phương pháp RT-PCR có tỷ lệ virus cao Nồng độ sử dụng tối thiểu đờ̉ mõ̃u tỏi sạch virus 100% là 20mg Ribavirin/l.Còn với hành chỉ nên sử dụng nồng độ 5mg Ribavirin/l 74 - Cây bệnh tái sinh từ meristem sinh trưởng, phát triển tốt và có suất cá thể cao so với bị bệnh có kích thước tương đương có thời gian sinh trưởng phát triển điều kiện vườn cách ly - Đã sản xuất được 1000 cõy/củ hành tỏi in vitro sạch bệnh phục vụ cho các nghiên cứu của đề tài và các nghiên cứu tiếp theo 3.1.2.Về các kết quả khác - Việc thực đề tài kết hợp có hiệu với cơng tác nâng cao trình độ cán đào tạo đại học và sau đại học: đào tạo 04 kỹ sư và 01 thạc sỹ (trong thạc sĩ thành viên đề tài) - Kết nghiên cứu đề tài đánh giá, tổng kết để cơng bố trờn cỏc tạp chí khoa học chun ngành nước Có 02 bài báo đã được tạp chí “Khoa học và phát triờ̉n” chấp nhận đăng 3.1.3.Về tài chính - Tài chính của đề tài đã được chi theo đúng các hạng mục đã được phê duyệt và đã được quyết toán đúng thời hạn 3.2 Đề nghị - Có thể ứng dụng kết nêu để nuôi cấy đinh sinh trưởng (meristem) hành tỏi nhằm tạo nguồn bệnh virus phục vụ cho sản xuất cõy/củ giụ́ng chất lượng cao và các nghiên cưú tiếp theo - Cần lặp lại các đánh giá về sinh trưởng, phát triển và suất của sạch bệnh virus đã tạo được mùa vụ và điều kiện trồng thích hợp với số lượng lớn cá thể để có kết luận chính xác 75 ... tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu áp dụng phương pháp công nghệ sinh học việc làm virus nhằm phục tráng số giống hành tỏi Bắc Việt Nam? ?? III.MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 3.1 Mục tiêu chung Nghiên cứu phục tráng số. .. NGHIÊN CỨU Thông tin chung - Tên đề tài: Nghiên cứu áp dụng phương pháp công nghệ sinh học việc làm virus nhằm phục tráng số giống hành tỏi Bắc Việt Nam - Mã số: B2010-11-166 - Chủ nhiệm: PGS.TS.Nguyễn... Phương pháp nuôi cấy mô tế bào 21 5.3 Phương pháp tách đỉnh sinh trưởng 23 5.4 Phương pháp đánh giá độ virus tái sinh phương pháp lây nhiễm giới24 5.5 Phương pháp đánh giá độ virus tái sinh phương