Nghiên cứu biểu hiện gen trehalase tái tổ hợp ở e coli và xác định các tính chất của enzyme

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở MỞ ĐẦU Ngày nay, công nghệ sinh học phân tử phát triển nhanh chóng, đạt thành tựu to lớn lý thuyết thực tiễn Sự phát triển không ngừng sinh học phân tử giúp cho người hiểu biết sở khoa học số bệnh nan y, tìm loại thuốc giúp cho người chống lại bênh tật nâng cao sức khỏe đời sống Thành tựu công nghệ sinh học phân tử ngày ứng dụng rộng rãi công nghiệp, nông nghiệp đặc biệt sản phẩm chức Xã hội ngày phát triển nên vấn đề sức khỏe người ngày quan tâm Do sản phẩm chức khơng ngừng cải tiến nâng cao chất lượng Và thành tựu y học, hóa sinh học, sinh lý học dinh dưỡng học cải tiến thực phẩm chức năng, thực phẩm điều trị bệnh sản xuất nhiều Ngày nay, thực phẩm chức người đặc biệt quan tâm thực phẩm có giá trị dinh dưỡng mức lượng thấp có chứa nhiều tác dụng Trong nhóm thực phẩm người ta quan tâm nhiều đến đường chức Có nhiều loại đường chức như: đường Maltitol, đường Fructooligosaccharide, đường Sorbitol, đường Trehalose…Trong số đường Trehalose loại đường có nhiều cơng dụng sống người, đặc biệt người béo phì, người mắc bệnh tiểu đường, sâu răng,… Cùng với phát triển đường chức năng, loại enzyme ứng dụng lĩnh vực ngày quan tâm nghiên cứu ứng dụng Trehalase enzyme sử dụng để sản xuất Trehalose nhân tố điều chỉnh q trình đơng lạnh, ngăn ngừa q trình kết tinh, cung cấp giá trị dinh dưỡng Do nghiên cứu sản xuất Trehalase enzyme sử dụng để sản xuất Trehalose nhu cầu cần thiết Đặc biệt thị trường Việt Nam chủ yếu nhập chế phẩm từ nước nên giá thành tương đối cao Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất enzyme Trehalase khơng có ý nghĩa khoa học mà cịn có giá trị kinh tế xã hội Từ lý thực đề tài nghiên cứu sau: “Nghiên cứu biểu gen Trehalase tái tổ hợp E.coli xác định tính chất enzyme” Mục tiêu đề tài: Biểu gen Trehalase tái tổ hợp E.coli Tách tinh chế enzyme Xác định đặc tính enzyme Ứng dụng enzyme để tổng hợp Trehalose Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở PHẦN 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Công nghệ DNA tái tổ hợp Kỹ thuật di truyền thuật ngữ chung cho nhiều kỹ thuật nghiên cứu di truyền phân tử Thuật ngữ kỹ thuật gen cịn gọi cơng nghệ gen hay kỹ thuật gen vấn đề cốt lõi sinh học đại Năm 1983 Rudleg Sediel: kỹ thuật di truyền kỹ thuật dẫn đến khả biến đổi định hướng gen, tần số kiểu gen quần thể, làm tăng khả sinh sản số cá thể để nâng cao vốn gen tăng số lượng hợp tử quần thể Kỹ thuật gen bắt đầu năm 1977, bao gồm thao tác kỹ thuật gen, nhằm điều chỉnh biến đổi gen tạo gen từ tạo cá thể Kỹ thuật gen bao gồm số kỹ thuật kỹ thuật DNA tái tổ hợp, phân lập gen, chuyển ghép gen, dung hợp gen vi thao tác gen DNA tái tổ hợp DNA tạo từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác Phân tử DNA gép nối từ đoạn DNA cá thể khác loài, loài khác gọi DNA tái tổ hợp Nguyên tắc chung công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm số bước sau Trước hết genome mục tiêu DNA chuyển tải (vector) tinh chế cắt thành đoạn nhờ loại Enzyme hạn chế Trong nhiều trường hợp (đặc biệt sinh vật bậc cao) DNA gen nome thay DNA tương bù (cDNA) củ mRNA thành thục DNA tổng hợp từ khuôn RNA thông tin nhờ xúc tác enzyme chép ngược (reverse transcriptase, rna-dependent DNA-polymerase) DNA vector plasmid phage (nếu vật mang dịng hóa gen vi khuẩn), plasmid Ti vi khuẩn Agrobacterrium tumefaciens (nếu vật mang dịng hóa gen tế bào thực vật), Vius (retrovirus andovirus không gây bệnh, vật mang dịng hóa gen tế bào động vật) Bước thứ hai chuyển vận DNA tái tổ hợp vào thể vật mang, dịng hóa bước tiếp sau ni cấy vật mang, sản xuất (chiết suất tinh chế) sản phẩm mục tiêu Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Nhờ cắt loại enzyme hạn chế (thường enzyme đầu dính) đoạn DNA mục tiêu đoạn DNA vector (chỉ cắt điểm mạch vòng xoắn kép) ngẫu nhiên hình thành liên kết hidro tương bù đầu dính, ligase hàn gắn đầu khác Kết hỗn hợp hình thành thể tái tổ hợp vector với mảnh DNA genome mục tiêu (bên cạnh sản phẩm không mong muốn vector tự khép vòng, vector tự tái tổ hợp với mảnh DNA không tái tổ hợp tự tái tổ hợp) Tất sản phẩm hỗn hợp trộn với vật mang tạo dòng, sau vật mang ni cấy mơi trường dinh dưỡng có yếu tố chọn lọc (chất kháng sinh vi khuẩn, hóa chất gây chết tế bào động vật thực vật) Trong điều kiện đó, tế bào vật mang vector sống sót Hơn nữa, plasmid bị enzyme hạn chế cắt tháo vịng vị trí xác định gen điều khiển thuộc tính nhận biết khác, plasmid tái tổ hợp khả tạo tính trạng vật mang (chẳng hạn, khả tổng hợp Beta-galactosidase), nên vật mang sống sót khơng biểu tính trạng chọn ni cấy tạo dịng Bước chọn dịng tính trạng gen mục tiêu dịng gen mục tiêu (nhờ lai phân tử: phương pháp thử nghiệm miễn dịch ELISA, Westerm blot anlysis, Northern blot anlysis với dò DNA RNA – southern blot anlysis, Norther blot anlysis), PCR Nuôi cấy tạo dòng cá thể vật mang thỏa mãn bước thử nghiệm giúp tạo dòng sinh vật mang sản xuất sản phẩm mục tiêu Thực chất công nghệ DNA tái tổ hợp tập hợp nhiều kỹ thuật gen, cải biến cấu trúc gen, gen tạo gen gen Công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm bước sau - Tách chiết DNA, RNA (phân lập gen) - Tạo vector tái tổ hợp (bao gồm chuẩn bị vector tách dòng) - Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ nhân dịng Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở - Sàng lọc, theo dõi hoạt động biểu gen Cho đến nay, kỹ thuật di truyền đạt bước tiến vượt bậc Nhiều sản phẩm có ích sản xuất từ vi sinh vật tái tổ hợp hay vi sinh vật biến đổi gen (gentically modified organisms – GMO) giống ngũ cốc đậu tương, hạt có dầu, bơng,… mang gen chống sâu bệnh kháng thuốc chống cỏ dại có chất lượng sản phẩm nâng cao khoai tây chứa nhiều Protein, lúa nhiều vitamin A sắt,… Tạo vacxin tái tổ hợp dễ sản xuất (dễ nuôi cấy lứa cấy tế bào hay phôi gà) dễ sử dụng cho ăn uống, động vật tái tổ hợp sản sinh sản phẩm hữu ích thuốc chữa bệnh, chí tạo đàn lợn mang kháng nguyên người, hy vọng vật cho tim nội tạng khác để điều trị trường hợp người bệnh cần thay nội quan,… Tuy nhiên, kỹ thuật di truyền đặt lồi người vào tình trạng phải đương đầu với đe dọa liên quan tới sức khỏe người sinh thái – môi trường Chưa thể chứng minh tính vơ hại GMO thực phẩm người, chưa phủ nhận khả lan truyền gen kháng thuốc (của Plasmid vector) tập đoàn vi khuẩn tự nhiên thể (ví dụ đường ruột) người động vật Chăm sóc loại trồng đề kháng thuốc diệt cỏ thuốc diệt sâu bệnh dẫn đến lạm dụng nơng dược thối hóa trở thành cỏ dại thực vật kháng thuốc kháng sâu bệnh nguy nông nghiệp Tương tự, nguy sinh vật GMO lấn át sinh vật tự nhiên cao dẫn đến tuyệt diệt nhiều lồi sinh vật có gây hậu nghiêm trọng đến môi trường sinh thái… I.2 Đại cương vi khuẩn E.coli Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1973); Nguyễn Lân Dũng (1976), trực khuẩn Escherchia Coli có tên khoa học Bacterium Coli Comunis bình thường E.coli cư trú phần sau ruột (ruột già phần cuối ruột non), có dày hay phía trước ruột non động vật (Nguyễn Vĩnh Phước,1978) Tỉ lệ E.coli kết tràng 58.3%, trực tràng 55.3%, manh tràng Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở 39.3% E.coli xuất sinh sống động vật vài sau sinh tồn đến vật chết Loài ăn tạp ăn thịt thải nhiều E.coli loài ăn cỏ Theo Kefman chủng E.coli thường gặp huyết chia thành Serotype riêng Trong số số serotype đóng vai trị quan trọng việc gây bệnh cho người động vật I.2.1 Đặc điểm hình thái E.coli lồi trực khuẩn hình gậy gắn, hai đầu trịn, có lơng, di động được, khơng hình thành nha bào, giáp mô, bắt màu Gram âm, thường thẫm hai đầu nhạt, kích thước vi khuẩn 2-3 uM x 0.4-0.6 um.Trong thể gia súc, vi khuẩn có hình cầu, đứng riêng lẻ, đơi xếp thành chuỗi ngắn I.2.2 Đặc tính ni cấy E.coli vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy tiện, dễ ni cấy, sinh trưởng phát triển thích hợp 37oC, pH thích hợp 7.2-7.4 Tuy nhiên chúng phát triển mơi trường có pH = 5.5-8.0 Môi trường nước thịt: E.coli phát triển nhanh, mơi trường đục đều, có lắng cặn xuống đáy màu tro nhạt, mặt hình thành màng mỏng màu ghi nhạt dính vào thành ống nghiệm, canh trùng có mùi phân thối Mơi trường thịt thường: ni cấy 37oC 24h hình thành khuẩn lạc trịn, ướt hới lối, khơng suốt, màu tro nhạt, đường kính khuẩn lạc khoảng 2-3mm Mơi trường Endo: hình thành khuẩn lạc có ánh kim Mơi trướng SS: mơi trường sau 24h ni cấy hình thành khuẩn lạc màu hồng nhạt màu đỏ cánh sen Môi trường EMB: E.coli có khuẩn lạc màu tím đen Mơi trường Macconkey: E.coli hình thành khuẩn lạc màu đỏ Mơi trường Billiant –Green–agar: khuẩn lạc E.coli có dạng S, màu vàng chanh Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở I.2.3.Đặc tính sinh hóa Các chủng E.coli lên men sinh mạnh loại đường Glucose, Galactose, Lactose, Mannitol… E.coli lên men không sinh loại đường Saccarose, Ramnose, Xalixin, Valin, Glyxeron Các phản ứng sinh hóa khác: Phản ứng indol (+), phản ứng VP (=), phản ứng MR (+), phản ứng H2S (+), hoàn nguyên Nitrat thành Nitrit, Urease (-), Gelatin (-) I.2.4 Sức đề kháng E.coli E.coli bị tiêu diệt nhiệt độ 55oC giờ, 60oC 30 phút (Willon Miles, 1995), (Nguyễn vĩnh Phước, 1973) Các chất sát trùng như: Axit phenic, Clorua thủy ngân, Formol tiêu diệt E.coli phút I.3 Tình hình sản xuất ứng dụng enzyme giới Việt Nam I.3.1 Tình hình sản xuất ứng dụng enzyme giới Enzyme có vai trị vơ quan trọng, khơng xúc tác cho phản ứng hóa học xảy hệ thống sống mà sau tách khỏi hệ thống sống chúng xúc tác cho phản ứng ngồi tế bào (intro) Bởi vậy, cơng nghệ enzyme ngày phát triển Những thành tựu enzyme sở để phát triển nghiên cứu ứng dụng enzyme thực tiễn Enzyme thường sử dụng theo hai cách: không tách enzyme khỏi nguyên liệu mà tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động số enzyme có sẵn nguyên liệu để chúng chuyển hóa chất có nguyên liệu theo hướng mong muốn Hoặc tách enzyme khỏi nguyên liệu dạng chế phẩm cần thiết Enzyme hoạt động sinh học tách từ quan sống Ví dụ enzyme thương mại sản xuất từ Acitinoplanes tới Zymomonas Từ rau chân vịt (spinach) đến nọc độc rắn Do tận dụng nguồn nguyên liệu giàu enzyme để tách enzyme, dùng enzyme để chế biến loại nguyên liệu khác sử dụng vào mục đích khác Hàng trăm enzyme thương mại sản xuất ra, Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở nửa từ nấm mốc nấm men, 1/3 từ vi khuẩn, lại 8% từ động vật, 4% từ thực vật Vi sinh vật nguồn nguyên liệu tốt công nghệ enzyme chúng có tốc độ sinh trưởng nhanh mơi trường dinh dưỡng khơng đắt tiền, khơng địi hỏi thiết bị đắt tiền, tự động hóa điều khiển, suất cao…Hơn nữa, ta chủ động điều khiển trình sinh tổng hợp enzyme, nâng cao hàm lượng enzyme tế bào vi sinh vật dễ dàng tế bào thực vật động vật Hàng năm, hàng trăm chế phẩm enzyme sản xuất phục vụ cho ngành công nghiệp y học Năm 1980, giới sản xuất 530 protease từ vi khuẩn, 350 glucoamylase, 320  – Amylase, 70 glucoisomerase, tất trị giá 150 triệu USD Hiện thị trường có khoảng 12 hãng sản xuất enzyme với 60 nhà cung cấp lớn Hai hãng sản xuất enzyme lớn Novo Nordisk (Đan Mạch) Gist Brocades chiếm 60% lượng enzyme thị trường Tiếp Mỹ 15%, 2/3 sử dụng nội địa chủ yếu dùng để sản xuất cồn đường nghịch đảo Năm 1993, thị trường Mỹ tiêu thụ 50 triệu USD renin, 27 triệu USD glucoAmylase, 23 triệu USD glucoisomerase… Khoảng 50 loại enzyme khác bán thị trường Mỹ Nhật chiếm 12-15% thị trường tiêu thụ với sản phẩm đa dạng Trung Quốc Nga hai thị trường sản xuất chủ yếu để phục vụ nước Đến người ta biết phân loại khoảng 3500 loại enzyme, khoảng vài trăm loại sản xuất quy mô công nghiệp chủ yếu enzyme Amylase, Protease Lipase… - Amylosidase: sản xuất với sản lượng /năm sử dụng để tách Lacid amin khỏi hỗn hợp DL axit amin (250 L axit amin năm) - Amyloglucosidase: sản lượng /năm, sản xuất 3000 glucose từ tinh bột/năm Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở - Glucoisomerase: sử dụng để sản xuất xiroglucose – fructose 42% (2.150.000 /năm) xiroglucose- fructose 55% (1.450.000 tấn/ năm) Phần lớn enzyme sử dụng mức độ công nghiệp thuộc loại enzyme đơn cấu tử xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 70% chế phẩm enzyme thủy phân sử dụng để thủy phân chất tự nhiên Các protease enzyme sử dụng nhiều dùng trình đơng tụ sữa sản xuất fomat, làm mềm thịt, sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da Tiếp đến enzyme nhóm Hydaratcacbonat Amylase, Cellulose, Pectinase… Sử dụng nhiều chế biến thực phẩm, thức ăn gia súc, công nghiệp dệt, công nghiệp sản xuất giấy bột giấy Trong công nghiệp thực phẩm chế phẩm enzyme sử dụng với mục đích chính: - Điều chỉnh khiếm khuyết nguyên liệu Nguyên liệu công nghiệp thực phẩm sản phẩm phức tạp có nguồn gốc từ động vật thực vật hình thành qua nhiều giai đoạn tổng hợp sinh học Do đó, thành phần nguyên liệu phụ thuộc vào yếu tố bên giống loài yếu tố bên ngồi điều kiện canh tác khí hậu Các yếu tố làm thay đổi thành phần nguyên liệu chuyển hóa Trong trường hợp chế phẩm enzyme sử dụng phụ gia lấp đầy thiếu hụt Trong công nghiệp chế biến đường, tinh bột, bánh mỳ, bia… người ta bổ sung Amylase để bù hoạt lực enzym yếu nguyên liệu ngũ cốc Trong sản xuất fomat, enzyme lipase protease sử dụng thay enzyme từ nguyên liệu sữa bị vô hoạt để trùng - Tham gia chuyển hóa, ứng dụng nhiều sản xuất bánh bisque, fomat, nước uống … protease cho phép cải thiện tính lọc bia tính ổn định nhiệt độ thấp Amylase, pectinase, hemicellulase tạo điều kiện cho việc tách chiết lọc nước Protease trung tính làm mềm dẻo khung gluten cải thiện độ nở bột nhào độ giòn bisque Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở - Tăng giá trị nguyên liệu tự nhiên Enzyme tham gia vào việc đa dạng hóa sản phẩm nhận từ nguyên liệu tự nhiên Sự phát triển công nghệ enzyme cho đời loạt chế phẩm enzyme cho phép tạo nhiều sản phẩm: chất làm đặc, chất thơm, chất tạo ngọt, chất tạo chua… việc cải thiện đặc tính enzyme tính đặc hiệu tính chịu nhiệt sở để sản xuất chế phẩm enzyme thích hợp mơi trường đặc hiệu - Cải thiện chất lượng sản phẩm: enzyme sử dụng để loại bỏ chất tự nhiên có ảnh hưởng xấu tới tính chất cảm quan thực phẩm Chế phẩm enzyme cho phép tạo hương vị, màu sắc sản phẩm lipase sản xuất fomat, lactase sản xuất sữa Trong công nghiệp thực phẩm, protease dùng để làm mềm thịt, công nghiệp bánh mỳ, enzym dịch vị chủ yếu chimosin thu từ dày bò sử dụng để sản xuất fomat, papain từ nhựa đu đủ để làm mềm thịt Enzyme công nghiệp thực phẩm chủ yếu sử dụng để sản xuất đường tinh bột Đầu tiên người ta sử dụng hai enzyme - Amylase Amylase để sản xuất mật từ tinh bột, sản phẩm chứa dextrin, glucose maltose dùng nhiều công nghiệp bánh kẹo Glucose sản xuất nhờ - Amylase - Amylase, nhiên glucose dùng thực phẩm có nhược điểm độ thấp vào khoảng 0.8 lần đường kính dùng chủ yếu cho y dược Năm 1970, người ta sản xuất Fructose xirogluco – fructose cao loại đường có độ gấp 1.73 lần so với đường kính giá thành cao nhiều Năm 1998, tổng lượng đường tiêu thụ giới 10 triệu riêng Mỹ tiêu thụ 4.2 Fructose (bao gồm xirogluco – fructose), Nhật 800.000 tấn, EU triệu tấn, Canada 300000 tấn, Đông Âu 200000 tấn, nước phát triển 500000 Sau công nghiệp thực phẩm chế phẩm enzyme sử dụng công nghiệp, nông nghiệp, dược phẩm, y tế, chế biến thức ăn gia súc Đặc Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Từ gel thấy Trehalase tinh Bằng phương pháp trên, thu tinh Trehalase từ tế bào vi khuẩn E.coli tái tổ hợp Lượng enzyme xác định đặc tính hoạt lực enzyme III.5 Xác định số tính chất Trehalase Mỗi enzyme có nhiệt độ, pH dung dịch đệm tối ưu điều kiện mà enzyme thể hoạt tính mạnh Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng việc làm thiếu bước để khám phá tính chất enzyme, ứng dụng enzyme III.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt lực enzyme Nhiệt độ yếu tố tác động mạnh mẽ tới hoạt động enzyme có vùng nhiệt độ hoạt động khác Để xác định nhiệt độ tối ưu ta tiến hành phản ứng enzyme với Trehalose 0.5% đem ủ dải nhiệt độ khác (35-80oC) bước nhiệt độ 5oC Sau thực phản ứng DNS đo OD bước sóng 575nm Giá trị tương ứng với nhiệt độ mà phản ứng giá trị cao ta coi giá trị độ hoạt động tương đối cực đại (100%), nhiệt độ tối ưu enzyme Ta có bảng sau: Nhiệt độ (oC) OD/575nm 37 40 45 50 55 60 65 70 80 Kết thể hình sau: Hoạt lực Khoa Cơng Nghệ Sinh Học 0.654 0.707 0.737 0.963 1.147 1.273 1.636 1.055 0.436 Tỷ lệ phần trăm (%) 40 43.22 45.05 58.86 70.11 77.81 100 64.48 26.65 Vũ Thị Hằng - 0604 Trehalase ơng đối (%) Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Nhiệt độ Hình 13: Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt động Trehalase Từ đồ thị ta thấy: thay đổi nhiệt độ có ảnh hưởng rõ rệt đến q trình thủy phân enzyme chất đường Trehalose Hoạt tính enzyme tăng dần nhiệt độ thí nghiệm tăng lên từ 37oC đến 60oC đạt giá trị cực đại 65oC Ở nhiệt độ 65oC enzyme bị biến tính mạnh hoạt tính giảm nhanh nhiệt độ 70oC 80oC Từ kết thí nghiệm ta kết luận nhiệt độ tối ưu cho hoạt động enzyme Trehalase 65oC Ở nhiệt độ enzyme cho hoạt độ cao III.5.2 Ảnh hưởng pH dung dịch đệm lên hoạt động Enzyme Theo nhà nghiên cứu enzyme, pH ảnh hưởng tới trung tâm hoạt động enzyme, pH thay đổi khả ion hóa nhóm chức thay đổi, ảnh hưởng đến kết hợp enzyme chất Mặt khác, pH có ảnh hưởng lớn đến vận tốc phản ứng enzyme, enzyme hoạt động dải pH khác Giá trị tương ứng với pH mà enzyme hoạt động mạnh ta coi giá trị độ hoạt động tương đối cực đại (100%), pH tối ưu enzyme Thực phản ứng enzyme với chất Trehalose 0.5% pha dung dịch đệm với pH khác (dải pH từ 4-11),Các dung dịch đệm 50mM natri acetate ( pH 4-6.5), 50mM natri phosphate (pH 6.5-8.5) 50mM Tris-HCl (pH 8.5-10.5), đem ủ 65oC Sau thực phản ứng DNS đo OD bước sóng 575nm.Ta có bảng số liệu sau: pH Natri acetate 0.93 4.5 1.04 1.16 5.5 1.37 Khoa Công Nghệ Sinh Học Phosphate Tris HCl Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở 1.64 6.5 1.47 1.38 1.21 7.5 1.17 1.03 8.5 0.98 0.95 0.84 9.5 0.61 10 0.56 10.5 0.36 Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hoạt độ Enzyme Kết bảng biểu diễn đồ thị sau: Hình 14: Ảnh hưởng pH lên hoạt tính Trehalase Qua hình 20 ta nhận thấy enzyme hoạt động khoảng pH axit yếu kiềm yếu (pH4.5-6) Trong khoảng pH axit, hoạt độ enzyme thủy phân Trehalose thấp, thời gian thủy phân lâu, pH 4.5 hoạt độ enzyme thủy phân khoảng 63.4%, pH 5.0 hoạt độ enzyme thủy phân khoảng 70.7% Ở pH kiềm (pH=8-10) hoạt độ enzyme thấp nghịch đảo với độ pH, pH cao hoạt độ enzyme giảm Ở pH 9.0 hoạt độ enzyme thủy phân khoảng 51.2%, pH 10.0 hoạt độ thủy phân khoảng 34.1% Qua hình ta thấy giá trị pH tối ưu enzyme Trehalase giá trị pH 6.0 Ở pH enzyme cho hoạt lực cao Như vậy, enzyme thích hợp môi trường axit yếu III.5.3 Khả chịu nhiệt Trehalase Để ứng dụng enzyme vào sản xuất cần phải khảo sát kỹ khả ổn định enzyme nhiệt độ 60, 70, 80 90 oC Ở nhiệt độ 60oC enzyme chịu nhiệt hoạt tính giảm nhanh Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hình 15: Biểu diễn khả chịu nhiệt Trehalose III.6 Ảnh hưởng ion kim loại dung môi kim loại lên hoạt độ enzyme III.6.1 Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt độ enzyme Trong phản ứng enzyme, có mặt số ion kim loại hóa chất khác thường có ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng Đối với enzyme định số ion kim loại có tác dụng thúc đẩy, ngược lại có số khác lại có tác dụng ức chế Xác định ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt động enzyme giúp tăng cường hiệu suất phản ứng cách điều tiết chất suốt trình phản ứng Để xác định ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt động enzyme, tiến hành bổ sung muối chứa ion kim loại khác Thí nghiệm tiến hành cách ngâm enzyme Trehalose 1% bổ sung dung dịch đệm có chứa ion: Ca2+, Mg2+, Mn2+ (CaCl2, MgCl2, MnCl2) với nồng độ 5mM Sau thực phản ứng enzyme 3h 65 oC, thực phản ứng DNS đo OD/575nm tiến hành xác định hoạt lực tương đối enzyme Đa số kim loại thử nghiệm có tác động xấu lên tính hoạt động enzyme.Ion kim loại kẽm ức chế gần hoàn toàn hoạt động Trehalase Trong Mg2+ làm tăng độ hoạt động enzyme 17,61% so với Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở độ hoạt động ban đầu Mg2+ có tác động làm tăng khả thủy phân tinh bột enzyme Mn2+, Ca2+ độ hoạt động enzyme giảm 18-65% III.6.2 Ảnh hưởng dung môi hữu lên hoạt độ enzyme Ảnh hưởng dung môi hữu thử nghiệm 10% dung môi hữu EtOH, MeOH, DMF, DMSO Enzyme bị ức chế dung môi hữu như: DMSO, DMF, Ethanol Methanol từ 10-63% Phân tử protein dung dịch chứa nước tạo vỏ hydrat hóa, bao gồm phân tử nước bấm vào phân tử protein để bảo vệ làm cho tan mơi trường nước có diện dung mơi hữu cơ, có khuynh hướng thay phân tử nước vỏ hydrat hóa bên cấu trúc protein Do mà làm sai lệch chất protein (Bachar et.al.1999) Vì kết cho thấy thay đổi cấu trúc protein dung mơi hữu gây ảnh hưởng dến việc hoạt tính enzyme Ta có bảng sau: Ion kim loại dung môi hữu OD/ Hoạt lực (%) 575nm Đối chứng 1,425 100 Ca2+ 0.928 65.12 Mg2+ 1.676 117.61 Mn2+ 0.261 18.31 EDTA 1.403 98.46 EtOH 0.76 53.33 MeOH 0.906 63.60 DMF 0.295 20.7 DMSO 0.153 10.74 Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Từ kết bảng ta biểu diễn đồ thi đây: Hoạt lực tương đối (%) Hình 16: Ảnh hưởng ion kim loại dung mơi hữu lên hoạt tính enzyme Từ kết nghiên cứu thấy hầu hết ion kim loại dung môi thử nghiệm ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme loại trừ ion kẽm có ảnh hưởng tốt đến hoạt tính enzyme làm cho hoạt tính tăng lên khoảng 17% so với đối chứng III.7 Xác định sản phẩm sinh tổng hợp trehalose enzyme tái tổ hợp (Thin layer chromatography – TLC) Trehalase thủy phân Trehalose thành phân tử glucose điều kiện định ngồi enzyme thực phản ứng ngược, nghĩa có khả kết hợp phân tử Glucose thành Trehalose Theo số tài liệu trình tổng hợp xẩy nhiều hai phân tử chất gắn với UDP, ADP hay CDP (Uracine Diphosphate, Adenosin Diphosphate, Cytosin Diphophate) Thí nghiệm tiến hành với chất sau: Glucose, Fructose, Galactose Mannose nồng độ 0,5% 50 mM natri axetat (pH 6.0), 65 oC 12 Sau phản ứng dừng nhiệt 100oC 10 phút sản phẩm phản ứng phân tích TLC Điều cho ta thấy việc tổng hợp đường Trehalose thu kết tốt chất glucose, chất khác phản ứng Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở khơng xẩy xẩy Manose tạo sản phẩm đồng dạng Hình 17: Sắc ký mỏng tổng hợp Trehalose Trehalose tương tự enzyme với glucose UDP-G thời gian khác Hình 18: Sắc ký mỏng tổng hợp Trehalose enzyme với glucose ADP-G 12h ADP-G + Glucose ADP-G + Fructose ADP-G + Glucose với enzyme 12h ADP-G + Fructose với enzyme 12h ADP-G + Galactose ADP-G + Mannose ADP-G + Galactose với enzyme 12h ADP-G + Mannose với enzyme 12h Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hình 19: Sắc ký mỏng tổng hợp Trehalose enzyme với glucose CDP-G 12h CDP-G + Glucose CDP-G + Galactose CDP-G + Glucose với enzyme 12h CDP-G + Galactose với enzyme 12h CDP-G + Fructose CDP-G + Mannose CDP-G + Fructose với enzyme 12h CDP-G + Mannose với enzyme 12h Kết cho thấy: Trehalose tổng hợp enzyme với glucose chất có diện UDP, ADP, CDP Ngoài ra, nguồn chất Fructose Mannose dùng để tổng hợp đường Trehalose tương tự Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở KẾT LUẬN Sau trình tiến hành thí nghiệm, chúng tơi thu nhận kết sau: Plasmid mang gen Trehalase biến nạp vào E.coli DH5-alpha biểu tốt vi khuẩn mức độ DNA protein Có thể tinh enzyme sắc ký cột Ni-NTA Đã xác định tính chất hóa lý enzyme Trehalase yếu tố ảnh hưởng đến khả xúc tác enzyme: nhiệt độ tối ưu 65oC, pH tối ưu 6.0, Trehalase enzyme bền nhiệt Các ion kim loại số dung mơi hữu có ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính enzyme, ngoại trừ ion kẽm Trehalase tái tổ hợp sử dụng để tổng hợp Trehalose với có mặt UDP, ADP, CDP Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Van Dao Nguyen, Mutagenesis Studides on the Quaternary Structure and Physicochemical Properties of Maltogenic Amylase from Thermus strain Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, công nghệ enzyme, nhà xuất (NXB) Nông Nghiệp, 1998 Nguyễn Hữu Chấn, Enzyme xúc tác sinh học, NXB Y học, 1996 Khuất Hữu Thanh, sở di truyền vi sinh vật công nghệ gen, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội, 2001 Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Công Nghệ Enzyme, NXB Khoa học kỹ thuật Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Xn Sâm, Tơ Kim Anh, Thí Nghiệm Hóa Sinh Cơng Nghiệp, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội Lê Ngọc Tú cộng sự, Hóa sinh công nghiệp, NXB khoa học kỹ thuật, 2000 Nguyễn Thị Hương, molecular cloning and characterization of Trehalose synthesizing Glycosyltransferase Enzyme from Thermotoga maritime, The Graduate School Yonsei University, Department of Food and Nutrition Vũ Thị Thanh Phương, Biểu Baciluss sterothermophiluss Maltogenic Amylase vi khuẩn E.coli DH5- Alpha, khóa luận tốt nghiệp, 2009 10 Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning, Second Edition Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN BẢNG CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT MỞ ĐẦU PHẦN 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Công nghệ DNA tái tổ hợp .3 I.2 Đại cương vi khuẩn E.coli I.2.1 Đặc điểm hình thái I.2.2 Đặc tính ni cấy I.2.3 Đặc tính sinh hóa I.2.4 Sức đề kháng E.coli I.3 Tình hình sản xuất ứng dụng enzyme giới Việt Nam .7 I.3.1 Tình hình sản xuất ứng dụng enzyme giới I.3.2 Tình hình sản xuất ứng dụng enzyme Việt Nam 13 I.4 Trehalase .14 I.4.1 Giới thiệu enzyme Trehalase 14 I.4.2 Trehalase vi khuẩn 14 I.4.3 Trehalase thực vật 15 I.4.4 Trehalase nấm men 15 I.4.5 Thủy phân Trehalose 15 I.5 Tổng quan đường chức Trehalose 16 I.5.1 Trehalose 16 I.5.2 Ảnh hưởng Trehalose lên thể sống 19 I.5.2.1 Ảnh hưởng Trehalose đến chuyển hóa hydratcacbon 19 I.5.2.2 Vai trị thúc đẩy trình hấp thụ canxi Trehalose 19 I.5.2.3 Ảnh hưởng Trehalose đến hệ vi sinh vật khoang miệng .20 I.5.2.4 Tính kháng khuẩn Trehalose 21 I.5.2.5 Tính an tồn Trehalose .21 I.6 Ứng dụng Trehalose .22 I.7 Tình hình nghiên cứu sản xuất Trehalose giới 24 I.8 Tình hình nghiên cứu sản xuất Trehalose Việt Nam 25 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 II.1 Nguyên vật liệu hóa chất 26 II.1.1 Giống vi sinh vật 26 II.1.2 Plasmid: 26 II.1.3 Hóa chất 26 Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở II.1.4 Máy móc thiết bị .27 II.2 Phương pháp nghiên cứu .27 II.2.1 Biến nạp E.coli DH5 alpha phương pháp sốc nhiệt .27 II.2.2 Tách DNA plasmid 29 II.2.3 Xác định DNA biểu E.coli gel Agarose .31 II.2.4 Phương pháp phá vỡ tế bào 31 II.2.5 Xác định hàm lượng protein tổng phương pháp Bradford 33 II.2.6 Xác định hoạt tính enzyme phương pháp DNS (3.5 Dinitro – Salicylic) 34 II.2.7 Tách tinh chế enzyme sắc ký cột Ni – NTA 37 II.2.8 Phân tích protein điện di gel SDS – polyacrylamide (SDS-PAGE) 37 II.2.9 Xác định sản phẩm thủy phân phương pháp sắc ký mỏng (Thin layer chromatography – TLC) .40 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 III.1 Kết biến nạp gen Trehalase vào E.coli DH-5 alpha 42 III.2 Kết tách plasmid DNA điện di gel agarose .43 III.3 Xác định tính chất enzyme 43 III.4 Tinh chế Trehalase cột sắc kí Ni – NTA 44 III.5 Xác định số tính chất Trehalase 46 III.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt lực enzyme 46 III.5.2 Ảnh hưởng pH dung dịch đệm lên hoạt động Enzyme.47 III.5.3 Khả chịu nhiệt Trehalase .49 III.6 Ảnh hưởng ion kim loại dung môi hữu lên hoạt độ enzyme 50 III.6.1 Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt độ enzyme 50 III.6.2 Ảnh hưởng dung môi hữu lên hoạt độ enzyme 51 III.7 Xác định sản phẩm sinh tổng hợp trehalose enzyme tái tổ hợp (Thin layer chromatography – TLC) 52 KẾT LUẬN 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khố luận tốt nghiệp này, em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS NGUYỄN VĂN ĐẠO, phó chủ nhiệm khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở - Hà Nội, người thầy vạch phương hướng, phương pháp nghiên cứu hướng dẫn bảo em tận tình chu em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em chân thành cảm ơn tới thạc sỹ VŨ KIM THOA người tận tình bảo cho em thao tác kỹ thuật suốt q trình thực tập phịng thí nghiệm Được giúp đỡ tận tình thầy giáo khoa Công Nghệ Sinh Học - Viện Đại Học Mở Hà Nội sau thời gian học tập nghiên cứu khoa em đạt kết ngày hôm Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô khoa Công Nghệ Sinh học - Đại Học Mở Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện cho em thời gian học tập khoa Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè ln bên giúp đỡ động viên em trình học tập hồn thành khóa luận Một lần nữa, cho phép em cảm ơn tất giúp đỡ tận tình q báu Hà Nội, tháng năm 2010 Sinh viên Vũ Thị Hằng Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở BẢNG CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT Amp Ampicillin DNA Deoxyribonucleic acid ARN Axit Ribonucleic EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EtBr Ethydium Bromine Kb Kilo base LB Luria-Bertani (Môi trường LB) OD Optical density SDS Sodium Dodecyl Sulphate TAE Tris-Acetate-EDTA Taq Thermus aquaticus polymerase TE Tris-EDTA TLC Thin layer chromatography – TLC W/v Weight/Volume (khối lượng/thể tích) kDa Kilo Dalton UDP-G Uracine Diphosphate Glucose ADP-G Adenosin Diphosphate Glucose CDP-G Cytosin Diphophate Glucose DMF Dimethylamide Formic Acid Khoa Công Nghệ Sinh Học Vũ Thị Hằng - 0604 ... Trehalase tái tổ hợp E.coli xác định tính chất enzyme” Mục tiêu đề tài: Biểu gen Trehalase tái tổ hợp E.coli Tách tinh chế enzyme Xác định đặc tính enzyme Ứng dụng enzyme để tổng hợp Trehalose Khoa Công... Học Mở Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất enzyme Trehalase khơng có ý nghĩa khoa học mà cịn có giá trị kinh tế xã hội Từ lý thực đề tài nghiên cứu sau: ? ?Nghiên cứu biểu gen Trehalase tái tổ hợp E.coli. .. Thực chất công nghệ DNA tái tổ hợp tập hợp nhiều kỹ thuật gen, cải biến cấu trúc gen, gen tạo gen gen Công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm bước sau - Tách chiết DNA, RNA (phân lập gen) - Tạo vector tái