Luận án nghiên cứu phát hiện các biến thể ở một số bệnh nhân tự kỷ việt nam bằng phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (exome

LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Huy Hồng GS.TS Phan Văn Chi tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập, nghiên cứu thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn giúp đỡ, ủng hộ tham gia nhiệt tình cán bộ, đồng nghiệp phịng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen, bác sĩ khoa Tâm bệnh, Bệnh viện Nhi Trung Ương, Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo, phòng Quản lý tổng hợp, ThS Bùi Hải Hà, Viện Cơng nghệ sinh học nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi mặt, hỗ trợ thực thủ tục cần thiết để hồn thành chương trình học tập nghiên cứu nghiên cứu sinh Tơi muốn bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình người thân bên tơi chăm sóc, động viên, giúp tơi yên tâm học tập nghiên cứu Luận án thực khuôn khổ đề tài thuộc hướng KHCN ưu tiên cấp Viện Hàn lâm KHCNVN “Giải trình tự tồn vùng mã hóa (exome) bệnh nhân tự kỷ Việt Nam” VAST02.02/15-16 Tôi xin chân thành cảm ơn hỗ trợ quý báu Viện Hàn lâm KHCNVN Tác giả luận án Nguyễn Thu Hiền i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Nguyễn Thu Hiền ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH x MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh tự kỷ 1.1.1 Giới thiệu bệnh tự kỷ 1.1.2 Thực trạng bệnh tự kỷ 1.2 Phân biệt, chẩn đoán hội chứng tự kỷ 1.2.1 Hội chứng Asperger 10 1.2.2 Hội chứng Rett 11 1.2.3 Rối loạn tan rã thời thơ ấu 12 1.2.4 Rối loạn phát triển lan toả không xác định 12 1.2.5 Phương pháp chẩn đoán điều trị 12 1.3 Các yếu tố di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ 15 1.3.1 Các hội chứng di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ 15 1.3.2 Những yếu tố gây bệnh cấp độ di truyền học 17 1.4 Các tiến nghiên cứu di truyền rối lo n phổ tự kỷ giải tr nh tự gen hệ 23 1.4.1 Phương pháp giải trình tự gen hệ 23 iii 1.4.2 Giải trình tự tồn vùng gen mã hóa nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ 26 1.4.3 Giải trình tự tồn hệ gen nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ 32 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 33 2.2 Hóa chất trang thiết bị 33 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 35 2.3.1 Tách chiết DNA tổng số 35 2.3.2 Tạo thư viện DNA 36 2.3.3 Giải trình tự gen máy Illumina 38 2.3.4 Tiền xử lý số liệu phân tích liệu 38 2.3.5 Nhân gen kĩ thuật PCR 43 2.3.6 Giải trình tự gen tự động máy Sanger 43 2.3.7 Phân tích gen mối tương tác 44 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46 3.1 Tách chiết DNA tổng số 46 3.2 Giải tr nh tự tồn vùng mã hóa 47 3.2.1 Kết tạo thư viện DNA 47 3.2.2 Kết giải trình tự gen máy Illumina 47 3.3 Xác định biến thể di truyền bệnh nhân tự kỷ 51 3.3.1 Xác định giải biến thể 51 3.3.2 Biến thể di truyền bệnh nhân T01 53 3.3.3 Biến thể di truyền bệnh nhân T02 56 iv 3.3.4 Biến thể di truyền bệnh nhân T03 62 3.3.5 Biến thể di truyền bệnh nhân T06 65 3.3.6 Biến thể di truyền bệnh nhân T07 73 3.3.7 Biến thể di truyền bệnh nhân T08 79 3.3.8 Biến thể di truyền bệnh nhân T09 83 3.4 Các gen nh y cảm với ASD có liên quan đến kênh ion 86 3.5 SNP RS7725785 gen HTR4 88 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ 89 4.1 Xác định giải biến thể 89 4.2 Các gen liên quan đến biểu bệnh đặc trƣng ASD 91 4.3 Các gen nh y cảm với ASD có liên quan đến kênh ion 97 4.4 Gen RYR2, RYR3 101 4.5 Gen MUC16 103 4.6 Đa h nh rs7725785 gen HTR4 106 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 110 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 112 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 113 TÀI LIỆU THAM KHẢO 120 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ADI-R: The Autism Diagnostic Interview - Bảng vấn chẩn đốn Revised tự kỷ có điều chỉnh ADOS The Autism Diagnostic Observation Bảng quan sát chẩn đoán tự Schedule kỷ ASD Autism Spectrum Disorders Rối loạn phổ tự kỷ BWA Burrows - Wheeler Alignment Tool Công cụ gióng Burrows-Wheeler CARS Childhood Autism Rating Scale Thang chẩn đốn tự kỷ tuổi ấu thơ CDC Centers For Disease Control Trung tâm kiểm soát dịch bệnh CHAT Check - list for Autism in Toddlers Bảng kiểm tra sàng lọc tự kỷ trẻ nhỏ chập chững biết CNVs Copy number variants Biến thể đa hình số lượng Cowden syndrome Hội chứng Cowden CS hàng DBC-P Developmental Behavior Checklist for Bảng câu hỏi phát triển hành Parent vi cho bố mẹ dbSNP The Single Nucleotide Polymorphism Ngân hàng liệu đa hình Database đơn nucleotide DSM Cẩm nang chẩn đoán Diagnostic and Statistical Manual of thống kê chứng rối loạn Mental Disorder tâm thần FXS Fragile X Hội chứng X dễ gãy Gilliam Autism Rating Scale Thang đánh Gilliam GARS vi giá tự kỷ GATK Genome Analysis Toolkit Cơng cụ phân tích hệ gen HDAC1 Histone deacetylase Dữ liệu đột biến gen người ICD International Classification of Diseases Phân loại quốc tế bệnh tật IGV Integrated Genomics Viewer Công cụ xem hệ gen hợp Intellectual disability Khuyết tật trí tuệ ID M-CHAT Modifier Check-list Autism in Toddlers MECP2 NCBI NHGRI Chromatin architecture genes National Center Information for Bảng sàng lọc tự kỷ trẻ nhỏ chập chững biết có sửa đổi Các gen cấu trúc chromatin Biotechnology Trung tâm thông tin Công nghệ sinh học National Human Genome Research Viện Nghiên cứu quốc gia Institute gen người NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự hệ PDDNOS Pervasive Developmental Disorder Not Rối loạn phát triển lan tỏa Otherwise Specified không xác định PDD Pervasive developmental disorders Rối loạn phát triển lan tỏa PLADOS The Pre - linguistic Autism Diagnostic Bảng quan sát chẩn đoán tự Observation Schedule kỷ dành cho trẻ chưa biết nói SAM Sequence Alignment / Map Sắp xếp/gióng hàng trình tự SBL sequencing by ligation Giải trình tự ghép nối SBS sequencing by synthesis Giải trình tự tổng hợp Tuberous Sclerosis Bệnh xơ cứng não củ WES Whole exome sequencing Giải trình tự tồn hệ gen mã hóa WGS Whole Genome Sequencing Giải trình tự toàn hệ gen TS vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thông tin mẫu bệnh nhân gia đình nghiên cứu 33 Bảng 2.2 Trình tự đoạn oligonuleotide 34 Bảng 3.1 Chất lượng DNA tổng số 46 Bảng 3.2 Bảng thông tin chất lượng đọc mẫu giải trình tự 49 Bảng 3.3 Kết gióng hàng mẫu giải trình tự với hệ gen tham chiếu 50 Bảng Kết xác định giải biến thể 51 Bảng 3.5 Số lượng biến thể sau bước lọc 07 bệnh nhân 52 Bảng 3.6 Các biến thể gen có liên quan đến bệnh tự kỷ bệnh nhân T01 53 Bảng thông kê biến thể gen bệnh nhân T01 55 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Các biến thể gen có liên quan đến bệnh tự kỷ bệnh nhân T02 Bảng 3.9 Thống kê biến thể gen bệnh nhân T02 59 Các biến thể gen có liên quan đến bệnh tự kỷ bệnh nhân T03 62 Bảng thông kê biến thể gen bệnh nhân T03 64 Bảng 3.10 Bảng 3.11 56 Bảng 3.12 Các biến thể gen có liên quan đến bệnh tự kỷ bệnh nhân T06 67 Bảng 3.13 Bảng thống kê biến thể bệnh nhân T06 68 Bảng 3.14 Các biến thể gen có liên quan đến bệnh tự kỷ bệnh nhân T07 74 Bảng 3.15 Bảng thông kê biến thể gen bệnh nhân T07 viii 76 Bảng 3.16 Các biến thể gen có liên quan đến bệnh tự kỷ bệnh nhân T08 Bảng 3.17 Bảng thống kê biến thể gen bệnh nhân T08 82 Các biến thể gen có liên quan đến bệnh tự kỷ bệnh nhân T09 83 Bảng thông kê biến thể gen bệnh nhân T09 85 Tổng kết gen liên quan đến bệnh tự kỷ 07 bệnh nhân 91 Một số đa hình liên quan đến ASD cơng bố giới 109 Bảng 3.18 Bảng 3.19 Bảng 4.1 Bảng 4.2 ix 80 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tỷ lệ bệnh tự kỷ số nước phát triển giới Hình 1.2 Tỷ lệ tự kỷ Việt Nam so với nước khu vực Châu Á Hình 1.3 Tình hình bệnh tự kỷ Việt Nam Hình 1.4 Lịch sử nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ từ năm 1975 đến năm 2015 25 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 36 Hình 2.2 Quy trình tạo thư viện DNA 37 Hình 2.3 Sơ đồ phân tích liệu giải trình phần mềm tin sinh chuyên sâu 39 Hình 3.1 Kết tách DNA tổng số từ mẫu máu tồn phần 46 Hình 3.2 Kết kiểm tra chất lượng thư viện DNA 47 Hình 3.3 Hình ảnh minh họa file kiểm định chất lượng 48 Hình 3.4 Chất lượng liệu FastQ mẫu 49 Hình 3.5 Sự tương tác gen bệnh nhân T01 54 Hình 3.6 Sự tương tác gen bệnh nhân T02 57 Hình 3.7 Kết giải trình tự phương pháp Sanger phát biến thể p.Ala2224Ser gen MUC16 bệnh nhân T02 61 Kết giải trình tự phương pháp Sanger phát biến thể p.Trp13569Cys bệnh nhân T02 61 Hình 3.9 Sự tương tác gen bệnh nhân T03 63 Hình 3.10 Kết giải trình tự phương pháp Sanger phát biến thể p.Val2430Ala gen MUC16 bệnh nhân T03 65 Sự tương tác gen bệnh nhân T06 67 Hình 3.8 Hình 3.11 x 27 28 Bệnh nhân T07 29 30 31 32 33 Bệnh nhân T08 34 35 36 37 38 39 40 41 ... lượng sống Mục tiêu đề tài Giải trình tự phân tích tồn vùng mã hóa (exome) số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam Xác định biến thể di truyền gen liên quan đến bệnh tự kỷ số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam Nội... nghiên cứu di truyền bệnh hạn chế Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài ? ?Nghiên cứu phát biến thể số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam phƣơng pháp giải tr nh tự toàn vùng mã hóa (exome) ” thực nhằm góp phần phát. .. dung nghiên cứu: Sàng lọc bệnh nhân tự kỷ Thu thập mẫu máu tách DNA tổng số từ mẫu máu bệnh nhân gia đình Giải trình tự tồn exome số bệnh nhân tự kỷ tự Việt Nam Phân tích số liệu tìm biến thể