Luận án nghiên cứu thành phần dinh dưỡng và hợp chất có hoạt tính sinh học từ một số loài nấm lớn ở vùng bắc trung bộ

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH DANH SÁCH SƠ ĐỒ MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Đối tượng nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu .3 Những đóng góp luận án .3 Cấu trúc luận án Chương 1: TỔNG QUAN .5 1.1 Nấm lớn 1.2 Thành phần dinh dưỡng nấm .5 1.2.1 Hàm lượng chất khô 1.2.2 Protein acid amin 1.2.3 Carbohydrate 1.2.4 Lipid .9 1.2.5 Vitamin 1.2.6 Khoáng chất 10 1.3 Chi Daldinia 11 1.3.1 Đặc điểm chung hình thái .11 1.3.2 Thành phần hóa học 11 1.4 Nấm than (Daldinia concentrica) 13 1.4.1 Đặc điểm hình thái phân bố 13 1.4.2 Thành phần hóa học hoạt tính sinh học 13 1.5 Chi linh chi (Ganoderma) 15 1.5.1 Đặc điểm hình thái .15 1.5.2 Thành phần hóa học hoạt tính sinh học 15 1.6 Nấm cổ linh chi (Ganoderma applanatum) 27 1.6.1 Đặc điểm hình thái phân bố 27 1.6.2 Thành phần hóa học 28 1.6.3 Hoạt tính sinh học 29 Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 30 2.1 Đối tượng phương pháp nghiên cứu 30 2.1.1 Thu mẫu .30 2.1.2 Các phương pháp xử lý mẫu chiết 30 2.1.3 Các phương pháp phân tích, phân tách hỗn hợp phân lập hợp chất 30 2.1.4 Phương pháp khảo sát cấu trúc hợp chất .30 2.2 Hoá chất, dụng cụ thiết bị 30 2.2.1 Hoá chất .30 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 31 2.3 Nghiên cứu thành phần chất dinh dưỡng có lồi nấm lớn vùng Bắc Trung Bộ 32 2.3.1 Xác định thành phần khoáng nguyên tố vi lượng .32 2.3.2 Xác định hàm lượng acid amin 34 2.3.3 Xác định hàm lượng vitamin A E 36 2.4 Xác định hàm lượng ergosterol ergosterol peroxide 37 2.4.1 Chất chuẩn 37 2.4.2 Chiết sterol 37 2.4.3 Phân tích sắc ký (HPLC) 37 2.5 Nghiên cứu hợp chất từ loài nấm than (D concentrica) 38 2.5.1 Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc hợp chất phân lập 38 2.5.2 Các liệu vật lý 39 2.6 Nghiên cứu hợp chất từ nấm cổ linh chi (Ganoderma applanatum) .43 2.6.1 Chiết xuất phân lập hợp chất 43 2.6.2 Các kiện vật lý phổ 43 2.7 Phương pháp thử hoạt tính .47 2.7.1 Gây độc tế bào .47 2.7.2 Kháng viêm 48 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 3.1 Kết xác định hàm lượng chất dinh dưỡng số loài nấm 51 3.1.1 Thành phần khoáng nguyên tố vi lượng 51 3.1.2 Hàm lượng acid amin mẫu nấm 53 3.1.3 Hàm lượng vitamin mẫu nấm 60 3.2 Hàm lượng ergosterol ergosterol peroxide 62 3.2.1 Xây dựng đường chuẩn ergosterol ergosterol peroxide 62 3.2.2 Kết phân tích 64 3.3 Nấm than (D concentrica) .64 3.3.1 Kết phân lập hợp chất 64 3.3.2 Xác định cấu trúc 65 3.3.3 Kết thử hoạt tính sinh học .97 3.4 Nấm linh chi (Ganoderma applanatum (Pers.) Pat ) 98 3.4.1 Phân lập số hợp chất .98 3.4.2 Xác định cấu trúc 98 KẾT LUẬN 106 DANH MỤC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .108 TÀI LIỆU THAM KHẢO .109 PHỤ LỤC 121 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Từ viết tắt AOCA Tiếng anh Tiếng việt Association of official analytical chemists Hiệp hội nhà hố phân tích thức Gas Chromatography-Mass Spectrometry Sắc ký khí-khối phổ CC Column Chromatography Sắc kí cột FC Flash Chromatography Sắc ký cột nhanh Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại MS Mass Spectroscopy Phổ khối lượng EI-MS Electron Impact-Mass Spectroscopy Phổ khối va chạm electron ESI-MS Electron Spray Ionzation-Mass Spectroscopy Phổ khối lượng phun mù electron HR-ESIMS High Relution-Electron Spray Impact Mass Spectroscopy Phổ khối lượng phân giải cao phun mù electron Proton Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 Distortionless Enhancement by Phổ DEPT GC-MS TLC HPLC H-NMR 13 C-NMR DEPT HSQC HMBC Polarisation Transfer Heteronuclear Single Quantum Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân trực tiếp H→C Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết H→C NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy ICP-MS Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry Phổ khối lượng plasma cao tần cảm ứng Atomic Absorption spectrosopy Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử Flame -Atomic Absorption spectrosopy Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử dùng kỹ thuật nguyên tử hóa dùng lửa AAS F-AAS Graphite - Atomic Ábsorption spectrosopy hấp thụ nguyên tử dùng kỹ GF-AAS HG-AAS IC50 HIV Phương pháp quang phổ thuật ngun tử hóa lị graphit Hydride Generation - Atomic Ábsorption Phương pháp quang phổ spectrosopy hấp thụ nguyên tử dùng kỹ thuật hyđrua hóa Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm Human Immuno-deficiency Virus Vi rút gây suy giảm miễn dịch người CTPT Molecular formula Công thức phân tử ACN Acetonitrile Axetonitrile Đ.n.c Melting point Điểm nóng chảy LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng ppb parts per billion Một phần tỷ (ng/ml) ppm parts per million Một phần triệu ( g/ml) DMSO DiMethylSulfoxide DiMethylSulfoxit MeOH Methanol Metanol Tetramethylsilan Tetramethylsilan Retention time Thời gian lưu Effective concentration 50% Giá trị 50% tế bào gốc tự bị chết tạo TMS RT EC50 DPPH trung hòa δC Carbon chemical shift Độ chuyển dịch hóa học carbon Carbon chemical shift Độ chuyển dịch hóa học carbon theo tài liệu tham khảo Proton chemical shift Độ chuyển dịch hóa học proton Proton chemical shift Độ chuyển dịch hóa học δ*C δH δ*H proton theo tài liệu tham khảo Singlet vân đơn broad singlet Singlet tù t triplet triplet d doublet vân đôi dd dublet duplet doublet doublet dt dublet triplet doublet triplet m multiplet multiplet dm dry mass Khối lượng khô s br s DANH SÁCH BẢNG Bảng 1.1 Hàm lượng chất khơ số lồi nấm (%) .6 Bảng 1.2 Thành phần acid amin thiết yếu số lồi nấm (mg/kg chất khơ) Bảng 1.3 Thành phần acid amin không thiết yếu số lồi nấm (mg /kg chất khơ) Bảng 1.4 Hàm lượng nguyên tố thiết yếu số loài nấm (mg /kg chất khơ) 10 Bảng 2.1 Chương trình vơ hóa mẫu lị vi sóng 32 Bảng 2.2 Các điều kiện thông số máy tối ưu để định lượng Ge Na, K, Ca, Mg 33 Bảng 2.3 Các điều kiện thông số máy tối ưu để định lượng Se Fe, Cu, Zn .33 Bảng 3.1 Phương trình đường chuẩn, 51 Bảng 3.2 Kết xác định hàm lượng Ge, Na, K, Ca, Mg 08 mẫu nấm lớn .52 Bảng 3.3 Kết xác định Se, Fe, Cu, Zn trong 08 mẫu nấm lớn 52 Bảng 3.4 Sự phụ thuộc diện tích peak sắc ký vào nồng độ (pmol/ l ) acid amin .54 Bảng 3.5 Hàm lượng acid amin thủy phân nấm nghiên cứu (μg/g) 58 Bảng 3.6 Hiệu suất thu hồi acid amin nấm cổ linh chi (G applanatum) .59 Bảng 3.7 Diện tích peak vitamin A tương ứng với nồng độ chuẩn 60 Bảng 3.8 Kết phân tích hàm lượng vitamin A nấm .61 Bảng 3.9 Diện tích peak vitamin E tương ứng với nồng độ chuẩn .61 Bảng 3.10 Kết phân tích hàm lượng vitamin E nấm 62 Bảng 3.11 Diện tích peak ergosterol ergosterol peroxide ứng với nồng độ chuẩn 63 Bảng 3.12 Hàm lượng ergosterol mẫu nấm (μg/kg) 64 Bảng 3.13 Các hợp chất tách từ nấm than (D concentrica) 65 Bảng 3.14 Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR DEPT hợp chất DCM1 67 Bảng 3.15 Dữ liệu phổ NMR hợp chất DCM2 .79 Bảng 3.16 Dữ liệu phổ 13C- NMR hợp chất DCM4 85 Bảng 3.17 Dữ liệu phổ NMR hợp chất DCM8 (ergosterol) 94 Bảng 3.18 Dữ liệu phổ NMR hợp chất DCM9 96 Bảng 3.19 Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư 97 Bảng 3.20 Kết thử nghiệm hoạt tính ức chế nitric oxide (NOs INHIBITION) .98 Bảng 3.21 Các hợp chất tách từ nấm linh chi (G applanatum) 98 Bảng 3.22 Dữ liệu phổ NMR hợp chất GAM4 100 Bảng 3.23 Dữ liệu phổ 13C-NMR DEPT hợp chất GAM5 .102 DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1 Nấm Daldinia concentrica 13 Hình 1.2 Bề mặt thể Ganoderma applanatum 28 Hình 3.1 Đường chuẩn định lượng Asp .54 Hình 3.2 Đường chuẩn định lượng His 55 Hình 3.3 Đường chuẩn định lượng Thr 55 Hình 3.4 Đường chuẩn định lượng Tyr 55 Hình 3.5 Đường chuẩn định lượng Ile 55 Hình 3.6 Đường chuẩn định lượng Glu 55 Hình 3.7 Đường chuẩn định lượng Ser 55 Hình 3.8 Đường chuẩn định lượng Gly 56 Hình 3.9 Đường chuẩn định lượng Ala 56 Hình 3.10 Đường chuẩn định lượng Arg 56 Hình 3.11 Đường chuẩn định lượng Leu 56 Hình 3.12 Đường chuẩn định lượng Cys – SS – Cys 56 Hình 3.13 Đường chuẩn định lượng Val 56 Hình 3.14 Đường chuẩn định lượng Met .57 Hình 3.15 Đường chuẩn định lượng Phe 57 Hình 3.16 Đường chuẩn định lượng Lys 57 Hình 3.17 Đường chuẩn định lượng Pro 57 Hình 3.18 Đường chuẩn định lượng vitamin A 60 Hình 3.19 Đường chuẩn định lượng vitamin E 62 Hình 3.20 Đường chuẩn định lượng ergosterol 63 Hình 3.21 Đường chuẩn định lượng ergosterol peroxide .63 Hình 3.22 Hợp chất DCM1 66 Hình 3.23 Phổ hợp chất hợp chất DCM1 68 Hình 3.24 Phổ IR hợp chất hợp chất DCM1 68 Hình 3.25 Phổ khối lượng hợp chất DCM1 69 Hình 3.26 Phổ 1H-NMR hợp chất DCM1 69 Hình 3.27 Phổ 1H-NMR hợp chất DCM1 70 Hình 3.28 Phổ 13C-NMR hợp chất DCM1 70 Hình 3.29 Phổ 13C-NMR hợp chất DCM1 71 Hình 3.30 Phổ DEPT hợp chất DCM1 71 Hình 3.31 Phổ DEPT hợp chất DCM1 72 Hình 3.32 Phổ DEPT hợp chất DCM1 72 Hình 3.33 Phổ HSQC hợp chất DCM1 73 Hình 3.34 Phổ HSQC hợp chất DCM1 73 Hình 3.35 Phổ HSQC hợp chất DCM1 74 Hình 3.36 Phổ HMBC hợp chất DCM1 .74 Hình 3.37 Phổ HMBC hợp chất DCM1 .75 Hình 3.38 Phổ HMBC hợp chất DCM1 .75 Hình 3.39 Phổ HMBC hợp chất DCM1 .76 Hình 3.41 Phổ 13C-NMR hợp chất DCM2 77 Hình 3.42 Phổ DEPT hợp chất DCM2 78 Hình 3.43 Phổ HMBC hợp chất DCM2 .78 Hình 3.44 Phổ 1H-NMR hợp chất DCM3 81 Hình 3.45 Phổ 13C - NMR hợp chất DCM3 81 Hình 3.46 Phổ DEPT hợp chất DCM3 82 Hình 3.47 Phổ HMBC hợp chất DCM3 .82 Hình 3.48 Phổ HSQC hợp chất DCM3 83 Hình 3.49 Phổ 1H-NMR hợp chất DCM4 84 Hình 3.50 Phổ 13C-NMR hợp chất DCM4 84 Hình 3.51 Phổ DEPT hợp chất DCM4 85 Hình 3.52 Phổ HMBC hợp chất DCM4 .86 Hình 3.53 Phổ HSQC hợp chất DCM4 87 Hình 3.54 Phổ 1H-NMR hợp chất DCM5 88 Hình 3.55 Phổ 13C-NMR hợp chất DCM5 88 Hình 3.56 Phổ DEPT hợp chất DCM5 89 Hình 3.57 Phổ HMBC hợp chất DCM5 .89 Hình 3.58 Phổ HSQC hợp chất DCM5 90 Hình 3.59 Phổ 1H-NMR hợp chất DCM6 91 Hình 3.60 Phổ 1H-NMR hợp chất DCM7 92 Hình 3.61 Phổ 13C-NMR hợp chất DCM7 92 Hình 3.62 Phổ DEPT hợp chất DCM7 93 DANH SÁCH SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình xử lý mẫu phân tích acid amin .34 Sơ đồ 2.2 Quy trình xử lý mẫu định hàm lượng vitamin A E 36 Sơ đồ 2.3 Phân lập hợp chất từ nấm than (D concentrica) 40 Sơ đồ 2.4 Phân lập hợp chất từ thể nấm linh chi (G applanatum) 46 144 Phụ lục 47 Phổ DEPT hợp chất ergosterol peoxit Phụ lục 48 Phổ HMBC hợp chất ergosterol peoxit 145 Phụ lục phổ hợp chất ergosta -7,22-dien-3β-ol (GAM3) Phụ lục 49: Phổ 1H-NMR hợp chất Ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3) Phụ lục 50: Phổ 1H-NMR hợp chất Ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3) 146 Phụ lục 51: Phổ 1H-NMR hợp chất Ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3) Phụ lục 52: Phổ 13C-NMR hợp chất Ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3) 147 Phụ lục 53: Phổ 13C-NMR hợp chất Ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3) Phụ lục 54: Phổ DEPT hợp chất Ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3) 148 Phụ lục 55: Phổ DEPT hợp chất Ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3) Phụ lục phổ hợp chất lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol (GAM4) Phụ lục 56: Phổ 1H-NMR hợp chất lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol (GAM4) 149 Phụ lục 57: Phổ 1H-NMR hợp chất lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol (GAM4) Phụ lục 58: Phổ 1H-NMR hợp chấtlanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol (GAM4) 150 Phụ lục 59 : Phổ 13C-NMR hợp chất lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol (GAM4) Phụ lục 60: Phổ 13C-NMR hợp chất lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol (GAM4) 151 Phụ lục 61: Phổ DEPT hợp chất Lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol (GAM4) Phụ lục 62: Phổ HSQC hợp chất lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol (GAM4) 152 Phụ lục phổ hợp chất 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5) Phụ lục 63: Phổ1H-NMR 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5) Phụ lục 64: Phổ 1H 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5) 153 Phụ lục 65: Phổ 1H 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5) Phụ lục 66: Phổ13C-NMR 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid 154 Phụ lục 67: Phổ 13C-NMR 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid Phụ lục 68: Phổ 13C-NMR 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid 155 Phụ lục 69: Phổ DEPT 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5) Phụ lục 70: Phổ DEPT 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5) 156 Phụ lục 71: Phổ HMBC 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5) Phụ lục 72: Phổ HMBC 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5) 157 Phụ lục 73: Phổ HMBC axit 3β -hydroxy- 5α-lanosta 7,9,24 (E)-trien-26-oic Phụ lục 74: Phổ HMBC 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5) 158 Phụ lục 75: Phổ HSQC 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5) Phụ lục 76: Phổ HSQC 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5) ... chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu thành phần dinh dưỡng hợp chất có hoạt tính sinh học từ số loài nấm lớn vùng Bắc Trung bộ? ?? Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu luận án dịch chiết loài nấm: Ganoderma... điều trị bệnh cho người Ngày nhà khoa học nghiên cứu dinh dưỡng, thành phần hóa học hoạt tính sinh học số loài nấm phát nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao tăng cường hệ miễn dịch, điều... 2012), chi có 25 lồi có giá trị dược liệu 1.3.2 Thành phần hóa học Đến có nhiều nghiên cứu nhà khoa học giới thành phần hóa học phát nhiều chất có hoạt tính sinh học từ loài nấm thuộc chi nấm [26,52,56,70,88,90,91,92,93,121]