Luận án Tiến sĩ Nghiên cứu tối ưu quy trình tạo chế phẩm giàu canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn Paracoccus carotinifaciens VTP20181 và bước đầu ứng dụng trong chăn nuôi cá hồi vân

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẶNG VIỆT ANH NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUY TRÌNH TẠO CHẾ PHẨM GIÀU CANTHAXANTHIN TỪ VI KHUẨN ƯA MẶN Paracoccus carotinifaciens VTP20181 VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG CHĂN NUÔI CÁ HỒI VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC Hà Nội - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẶNG VIỆT ANH NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUY TRÌNH TẠO CHẾ PHẨM GIÀU CANTHAXANTHIN TỪ VI KHUẨN ƯA MẶN Paracoccus carotinifaciens VTP20181 VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG CHĂN NUÔI CÁ HỒI VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HĨA HỌC Chun ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số chuyên ngành: 9.52.03.01 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Phạm Quốc Long TS Phạm Hồng Hải Hà Nội - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học GS TS Phạm Quốc Long TS Phạm Hồng Hải Các kết số liệu thu luận án hoàn toàn trung thực, chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận án Đặng Việt Anh LỜI CẢM ƠN Luận án hoàn thành Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Với kính trọng, lịng biết ơn chân thành sâu sắc nhất, xin bày tỏ biết ơn tới GS.TS Phạm Quốc Long TS Phạm Hồng Hải người thầy hướng dẫn tận tình tạo điều kiện giúp đỡ thời gian thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn quan tâm giúp đỡ Ban lãnh đạo Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Học viện Khoa học Công nghệ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn tới tập thể cán Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Sản phẩm thiên nhiên, phịng Cơng nghệ thiết bị hóa học - Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Bộ môn Công nghệ Enzyme Protein - Viện công nghiệp thực phẩm, Trung tâm công nghệ sinh học - Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản giúp đỡ suốt thời gian thực luận án Cuối cùng, tơi xin gửi lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè ln quan tâm, giúp đỡ, khích lệ tạo điều kiện cho tơi q trình làm luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Tác giả luận án Đặng Việt Anh MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH 11 MỞ ĐẦU .13 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .14 1.1 Vài nét Carotenoid 14 1.2 Giới thiệu Canthaxanthin .14 1.2.1 Tính chất vật lý canthaxanthin 15 1.2.2 Tính chất hóa học canthaxanthin 15 1.2.3 Tính chất dược lý canthaxanthin động vật thủy sản 16 1.2.4 Ứng dụng canthaxanthin 16 1.3 Tổng quan trình sinh tổng hợp canthaxanthin 17 1.3.1 Giới thiệu chung chi Paracoccus 17 1.3.2 Cơ chế sinh tổng hợp canthaxanthin 18 1.3.3.1 Nhu cầu NaCl 19 1.3.3.2 Nguồn carbon nitơ .20 1.3.3.3 Nguyên tố vi lượng 20 1.3.4 Ảnh hưởng điều kiện lên men đến khả sinh tổng hợp canthaxanthin .21 1.3.4.1 Tỷ lệ giống .21 1.3.4.2 Nhiệt độ 21 1.3.4.3 Sự cung cấp oxy 21 1.3.4.4 Độ pH môi trường 22 1.3.4.5 Thời gian lên men 22 1.3.4.6 Phương pháp lên men 22 1.4 Thu hồi sản phẩm 24 1.4.1 Kỹ thuật tách sinh khối vi sinh vật 24 1.4.1.1 Phương pháp lọc 25 1.4.1.2 Phương pháp ly tâm 25 1.4.1.3 Phương pháp lắng 25 1.4.2 Sấy thu hồi sinh khối vi sinh vật 26 1.5 Các phương pháp trích ly tinh chế canthaxanthin .27 1.5.1 Các phương pháp phá hủy thành tế bào 27 1.5.1.1 Các phương pháp học gián đoạn 27 1.5.1.2 Các phương pháp học không gián đoạn 28 1.5.2 Nguyên lý hoạt động trình chiết xuất siêu âm 31 1.5.3 Ảnh hưởng thông số chiết siêu âm 31 1.5.3.1 Thông số vật lý 31 1.5.3.2 Thông số môi trường 33 1.6 Giới thiệu liposome ứng dụng liposome 35 1.6.1 Giới thiệu liposome 35 1.6.1.1 Lịch sử liposome 35 1.6.1.2 Cấu tạo liposome 35 1.6.1.3 Ứng dụng liposome 36 1.6.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất liposome 37 1.6.2 Nghiên cứu ứng dụng liposome nuôi cá hồi vân 38 1.7 Giới thiệu phương pháp bề mặt đáp ứng sử dụng tối ưu hóa 38 1.8 Giới thiệu cá hồi vân nghề nuôi cá hồi nước lạnh 40 1.8.1 Phân loại 40 1.8.2 Tình hình ni cá hồi giới Việt Nam 40 1.8.2.1 Tình hình ni cá hồi vân giới 40 1.8.2.2 Tình hình ni cá hồi vân Việt Nam 40 1.8.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến chăn nuôi cá hồi 41 1.8.3.1 Nhiệt độ 41 1.8.3.2 Nồng độ oxy hoà tan, muối, pH 41 1.8.3.3 Nhu cầu dinh dưỡng thức ăn cá hồi vân 42 1.8.3.4 Nhu cầu protein 42 1.8.3.5 Nhu cầu lipid acid béo 42 1.8.3.6 Nhu cầu vitamin khoáng chất 43 1.8.3.7 Nhu cầu carotenoids 44 1.8.3.8 Phát triển thức ăn cho cá hồi Việt Nam 44 1.8.4 Nghiên cứu bổ sung canthaxanthin vào thức ăn thủy sản Việt Nam 45 CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .46 2.1 Nguyên vật liệu .46 2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn 46 2.1.2 Nguyên vật liệu nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men 46 2.1.3 Nguyên vật liệu nghiên cứu tổng hợp liposome 46 2.2 Thiết bị máy móc 46 2.2.1 Thiết bị nghiên cứu lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn 46 2.2.2 Thiết bị nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men 47 2.2.3 Thiết bị nghiên cứu tổng hợp liposome 47 2.3 Phương pháp nghiên cứu .47 2.3.1 Phương pháp lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn 47 2.3.1.1 Phương pháp định lượng sinh khối vi sinh vật 47 2.3.1.2 Phương pháp xác định hàm lượng canthaxanthin 47 2.3.1.3 Phương pháp xác định sản lượng canthanxanthin 49 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men 49 2.3.2.1 Xác định hàm lượng tổng carotenoid 49 2.3.2.2 Xác định hàm lượng canthaxanthin sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 50 2.3.2.3 Phương pháp sắc kí lớp mỏng 50 2.3.2.4 Phương pháp sắc kí cột 50 2.4 Phương pháp nghiên cứu tạo sản phẩm thức ăn cho cá hồi chứa canthaxanthin 51 2.4.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp bổ sung chế phẩm canthaxanthin 51 2.4.2 Phương pháp xác định liều lượng bổ sung canthaxanthin vào thức ăn cá hồi 51 2.5 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa q trình cơng nghệ .52 2.6 Phân tích thống kê 54 CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM .55 3.1 Lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn .55 3.1.1 Lựa chọn thành phần môi trường 55 3.1.2 Khảo sát tìm tâm thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin 57 3.1.3 Sàng lọc điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin 57 3.1.4 Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin 58 3.1.5 Lựa chọn mơ hình lên men sinh tổng hợp canthaxanthin 59 3.1.6 Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men 60 3.2 Xây dựng quy trình chiết xuất canthaxanthin 61 3.2.1 Định lượng canthaxanthin phương pháp sắc ký lỏng cao áp 61 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố cơng nghệ đến hiệu suất q trình chiết xuất canthaxanthin 62 3.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình chiết 62 3.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung mơi/ngun liệu đến q trình chiết 63 3.2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến trình chiết 63 3.2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng cơng suất siêu âm đến q trình chiết 63 3.2.3 Xây dựng mơ hình nghiên cứu ma trận kế hoạch thực nghiệm 64 3.3 Đặc điểm trình tổng hợp liposome 66 3.3.1 Quá trình tổng hợp liposome 66 3.3.2 Kích thước hạt 66 3.3.3 Quá trình đưa canthaxanthin lên liposome 67 3.3.4 Thử nghiệm giải phóng thuốc 67 3.3.5 Thí nghiệm phối trộn liposome vào thức ăn cho cá hồi vân 67 3.3.5.1 Cá chế độ ăn 67 3.3.5.2 Tiến hành đo khối lượng 69 3.3.5.3 Xác định thành phần canthaxanthin cá hồi 69 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 70 4.1 Tối ưu trình lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn .70 4.1.1 Khảo sát thành phần môi trường sinh tổng hợp canthaxanthin 70 4.1.2 Nghiên cứu tối ưu điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin 78 4.1.2.1 Sàng lọc mức ảnh hưởng điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin 78 4.1.2.2 Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin mơ hình RSMCCD 81 4.1.3 Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men 90 4.1.4 Quy trình cơng nghệ lên men sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn quy mô 80-100 lít/mẻ 91 4.2 Kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố công nghệ đến hiệu suất chiết xuất 95 4.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình chiết 95 4.2.2 Ảnh hưởng tỷ lệ dung mơi/ngun liệu tới q trình chiết 96 4.2.3 Ảnh hưởng thời gian tới trình chiết 97 4.2.4 Ảnh hưởng cơng suất siêu âm tới q trình chiết 98 4.2.5 Kết quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa thơng số cơng nghệ q trình chiết xuất .99 4.2.6 Kiểm tra tương hợp mơ hình 100 4.2.7 Tối ưu hóa q trình chiết xuất 105 4.2.8 Kết chiết xuất, phân lập canthaxanthin 107 4.3.2 Quy trình tổng hợp liposome có chứa canthaxanthin α-tocopherol 112 4.3.3 Sự tăng trưởng cá với chế độ ăn có bổ sung chế phẩm canthaxanthin .113 4.3.3 Màu sắc cá hồi 115 KẾT LUẬN 119 KIẾN NGHỊ .121 NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN 121 CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 122 BÀI BÁO QUỐC TẾ 122 BÀI BÁO TRONG NƯỚC 122 SÁNG CHẾ 122 TÀI LIỆU THAM KHẢO 123 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu Diễn giải Tiếng Anh ANOVA Phân tích phương sai Analysis of Variance CMS Chất hoạt động bề mặt Glycerol monostearate CS Cộng DL Tải lượng thuốc Drug loading DMAPP Dimethylallyl pyrophosphate Dimethylallyl pyrophosphate EE Hiệu suất đóng gói Encapsulation Efficiency GGPP Geranylgeranyl pyrophosphate Geranylgeranyl pyrophosphate HMG-CoA 3-hydroxy-3-methyl glutaryl CoA 3-hydroxy-3-methyl glutaryl CoA HPCL Sắc ký lỏng cao áp High-performance chromatography liquid IC Nồng độ ban đầu Initial concentration MeOH CH3OH Methanol PBS Dụng dịch đệm phosphate Phosphate-buffered saline PDI Chỉ số phân tán Polydispersity Index ppm Phần triệu Parts per million RSM Phương pháp bề mặt đáp ứng Response surface methodology SD Độ lệch chuẩn Standard deviation SKK Sinh khối khô STT Số thứ tự TCA Hợp chất trung gian Tricarboxylic acid THF Tetra hydro furan Tetrahydrofuran TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography TLTK Tài liệu tham khảo Reference TPC Hàm lượng phenolic tổng Total phenolic content UI Cường độ siêu âm Ultrasound intensity UV Tia cực tím Ultraviolet Chế độ X (IC=0.5%) Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin αtocopherol liposomes (IC=1%) 20.44 ± 1.13 26.89 ± 0.80 29.33 ± 1.10 30.22 ± 1.39 Giá trị màu sắc cho ba nhà nghiên cứu thống Các số liệu kết phép đo ba lần trình bày dạng giá trị trung bình ± SE Chế độ I Chế độ II Chế độ III Chế độ IV Chế độ V Chế độ VI Chế độ VII Chế độ VIII Chế độ IX Chế độ X Hình 4.3.5 Màu sắc cá kết thúc thí nghiệm Hàm lượng canthaxathin tích lũy cá thí nghiệm khác sau 90 ngày nuôi thể Hình 4.3.5 Sau 90 ngày ni, cá ăn chế độ khác cho thấy hàm lượng canthaxanthin tích lũy khác (p