Hướng dẫn cho người mới bắt đầu về RT PCR, qPCR và RT qPCR Hình 1 Sơ đồ so sánh RT PCR, qPCR và RT qPCR (A) Quy trình hoạt động của RT PCR RNA được phân lập và cDNA được tạo ra thông qua quá trình phi.
Hướng dẫn cho người bắt đầu RT-PCR, qPCR RT-qPCR Hình Sơ đồ so sánh RT-PCR, qPCR RT-qPCR (A) Quy trình hoạt động RT-PCR RNA phân lập cDNA tạo thông qua trình phiên mã ngược - reverse transcription (RT); sau phản ứng PCR thực để khuếch đại gene mục tiêu (B) quy trình qPCR DNA phân lập khuếch đại; khuếch đại định lượng cách sử dụng đầu dò phát huỳnh quang xen vào mạch đổi sợi DNA tạo thành (C) trình RT-qPCR RNA phân lập tạo thành cDNA trước bắt đầu quy trình qPCR Tổng quan qPCR RT-qPCR PCR định lượng (qPCR), sử dụng rộng rãi phịng thí nghiệm sinh học phân tử cách mạng hóa cho cách thức tiến hành thí nghiệm đo lường tính đơn giản (Hình 2) Hình Quy trình làm việc thí nghiệm qPCR RT-qPCR tiêu chuẩn Sau phân lập mẫu, mẫu tinh trước tạo cDNA bắt đầu trình qPCR cách sử dụng thuốc nhuộm xen kẽ đầu dò thủy phân Sự phát huỳnh quang phát suốt chu kỳ PCR sử dụng để tạo đường cong khuếch đại sử dụng để định lượng mẫu mục tiêu q trình phân tích liệu Ưu điểm qPCR so với PCR tiêu chuẩn bao gồm khả mô tả phản ứng hoạt động thời gian thực mà khơng cần gel agarose Nó cho phép phân tích định lượng Một cách sử dụng phổ biến qPCR xác định số lượng chuỗi DNA quan tâm Sử dụng định lượng tuyệt đối, người dùng xác định số mục tiêu đường cong tiêu chuẩn nồng độ xác định cách xác hết Mặt khác, RT-qPCR cho phép điều tra thay đổi biểu gen xử lý hệ thống mơ hình chất ức chế, chất kích thích, RNA can thiệp nhỏ (siRNA) mơ hình loại trực tiếp, v.v Kỹ thuật sử dụng thường xuyên để phát thay đổi biểu trước (như kiểm soát chất lượng) sau (xác nhận thay đổi) thí nghiệm RNA-Seq Chuẩn bị mẫu Bước quan trọng đường ống qPCR RT-qPCR cho cách ly mẫu Cho dù thiết kế xét nghiệm bạn có tốt đến đâu, nguyên liệu ban đầu bị nhiễm bẩn xuống cấp, bạn khơng nhận kết xác Một mẫu chất lượng tốt khối khởi đầu liệu chất lượng tốt Khi phân lập DNA cho qPCR, điều quan trọng khơng có chất gây ô nhiễm ức chế phản ứng Thông thường, việc khai thác thực cách sử dụng dụng cụ bán sẵn, có ưu điểm thân thiện với người dùng, đơn giản nhanh chóng, đặc biệt tích hợp với hệ thống robot Loại chiết xuất RNA thực phụ thuộc vào loại RNA yêu cầu Phương pháp chiết xuất phổ biến sử dụng với dụng cụ chiết xuất RNA tổng số Điều phân lập RNA thơng tin (mRNA; tiền chất q trình tổng hợp protein), RNA chuyển (tRNA; giải mã mRNA trình dịch mã với ribosome) RNA ribosome (rRNA; đọc thứ tự axit amin trình dịch mã liên kết chúng với ribosome), thường (không phải lúc nào) không phân lập RNA nhỏ RNA khơng mã hóa (ncRNA; RNA chức phiên mã từ DNA, không dịch mã thành protein) RNA vi mô (miRNA; điều chỉnh biểu gen cách ức chế dịch mã mRNA) Với bùng nổ quan tâm đến RNA tăng cường (eRNA; RNA nhỏ phiên mã từ chất tăng cường) thay đổi độ dài đáng kể, điều quan trọng phương pháp chiết xuất xem xét cẩn thận để đảm bảo phân lập RNA quan tâm Ngoài cân nhắc chiết xuất, điều cần thiết RNA khơng nhiễm DNA, điều phân biệt với cDNA phản ứng qPCR Để khắc phục điều này, hầu hết giao thức dựa vào việc sử dụng phương pháp xử lý DNase I để tiêu hóa DNA Trong trình phân lập, ln có khả xảy phân hủy mẫu Theo đó, đường ống dẫn tốt liên quan đến bước kiểm soát chất lượng để đánh giá tính tồn vẹn mẫu Điều thực nhanh chóng cách đánh giá tỷ lệ A260 / 280 (so sánh độ hấp thụ 260 so với 280 nm, phép đo độ nhiễm bẩn protein) tỷ lệ A260 / 230 (260 so với 230 nm, dấu hiệu diện chất bẩn hữu cơ) mẫu; nhiên, điều khơng xác bị ảnh hưởng số yếu tố Một biện pháp xác sử dụng hệ thống điện di gel ảo Máy phân tích sinh học thông minh Hệ thống hoạt động cách sử dụng chip phân tách RNA dựa kích thước phát RNA thuốc nhuộm huỳnh quang Điều sau dịch sang máy tính, sử dụng thuật tốn, Bước cuối trình chuẩn bị mẫu cho RTqPCR tạo cDNA cDNA sử dụng RT-PCR (Hình 1) để tạo cDNA từ khuôn mẫu RNA cách sử dụng enzym phiên mã ngược Điều thực cách sử dụng mồi oligo (dT), ủ với đuôi polyA RNA, sử dụng hexamers ngẫu nhiên (các đoạn mồi dài từ sáu đến chín bazơ, ủ nhiều điểm dọc theo RNA) Nói chung, kết hợp hai đoạn mồi cho tốt cho phép khuếch đại RNA polyA (chủ yếu mRNA) RNA không chứa polyA (tRNA, rRNA, v.v.) Ngoài việc xem xét mồi, việc tạo cDNA phần qPCR thử nghiệm (được gọi RT-qPCR bước) tạo riêng biệt với qPCR (hai bước RT-qPCR), hiển thị Hình Ưu điểm RT-qPCR bước có biến thể thử nghiệm rủi ro nhiễm bẩn hơn, cho phép sàng lọc thông lượng cao; đó, tùy chọn thường sử dụng để kiểm tra lâm sàng Tuy nhiên, điều có nghĩa mẫu sử dụng số lần giới hạn, RT-qPCR hai bước cho phép nhiều phản ứng mẫu tùy chọn mồi linh hoạt thường tùy chọn ưu tiên để phân tích biểu gen quy mô rộng, yêu cầu nhiều tối ưu hóa Hình RT-qPCR bước so với hai bước RT-qPCR bước liên quan đến việc tạo cDNA thông qua phiên mã ngược khuếch đại qPCR trình tự đích phản ứng RT-qPCR hai bước tách biệt hai bước (RT-PCR qPCR), cho phép nhiều chuỗi đích phân tích phản ứng qPCR Phương pháp phát Hình So sánh thuốc nhuộm xen kẽ phát đầu dị dựa thủy phân (MỘT) SYBR® Phát màu xanh cây: Sau biến tính cDNA, mồi ủ kéo dài Trong trình mở rộng, SYBR Green liên kết với DNA sợi đôi (dsDNA), phát tín hiệu huỳnh quang phát thiết bị qPCR (B) TaqMan® thăm dị phát hiện: Các đầu dò TaqMan liên kết hạ nguồn mồi với cDNA sợi đơn Trong trình kéo dài, polymerase phá vỡ đầu dị, cho phép phát tín hiệu huỳnh quang vị trí gần với gốc dập tắt (NS) Đồ thị đường cong nóng chảy cho tính đặc hiệu mồi: Một đường cong tan chảy đo lường phân ly dsDNA nhiệt độ cao Một loài DNA đơn lẻ (được tạo từ cặp mồi cụ thể) tạo đỉnh (vạch đen), nhiều loài DNA cặp đoạn mồi tạo hai nhiều đỉnh (màu tím) đoạn mồi không đặc hiệu Quyết định quan trọng thiết kế đường ống thử nghiệm bạn chọn phương pháp phát Tất dựa phát huỳnh quang, hóa học đằng sau chúng khác Một phương pháp sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang liên kết khơng đặc hiệu với DNA nghi ngờ tạo SYBR® Màu xanh chất nhuộm xen kẽ phổ biến phát tín hiệu huỳnh quang xen kẽ với DNA tổng hợp Càng nhiều DNA tạo phản ứng qPCR, phát nhiều huỳnh quang (Hình 4A) Phương pháp phát thứ hai sử dụng đầu dị thủy phân TaqMan® đầu dị, phụ thuộc vào Truyền lượng cộng hưởng Förster (FRET) ngăn khơng cho gốc thuốc nhuộm phát tín hiệu qua dập tắt đầu dị cịn ngun vẹn (Hình 4B) Các đầu dị trình tự cụ thể thiết kế để liên kết với đoạn mồi qPCR 5′ cuối đầu dò dán nhãn chất phóng xạ huỳnh quang gốc carboxyfluorescein (FAM); 3′ cuối phân tử dập tắt ngăn cản phát xạ huỳnh quang gần máy phóng Như DNA polymerase mở rộng đoạn mồi, đầu dò bị phân cắt, tạo điều kiện cho phân tử phóng xạ phát tín hiệu huỳnh quang Vì đầu dị mục tiêu cụ thể, chúng vốn có độ đặc hiệu cao thuốc nhuộm xen kẽ Do đó, bạn phát tín hiệu đầu dị, bạn tin tưởng tín hiệu thực từ GOI bạn, u cầu đoạn mồi đầu dò liên kết chuỗi mục tiêu để phát tín hiệu Tuy nhiên, thuốc nhuộm xen kẽ khơng đặc hiệu, đó, cần phải phân tích sâu dạng đường cong nóng chảy để đảm bảo tín hiệu phát thực mục tiêu quan tâm (Hình 4C) Điều hỗ trợ cách sử dụng mồi thiết kế cẩn thận cách xác nhận tính cụ thể chúng, mà có nhiều ví dụ trực tuyến bao gồm ngân hàng mồi Harvard Gần hơn, thuốc nhuộm xen kẽ hệ EvaGreen® phát triển, có tiếng ồn thấp tín hiệu mạnh hơn, cho phép cải thiện phân tích đường cong tan chảy phát khuếch đại Bất chấp nhược điểm chúng, thuốc nhuộm xen kẽ rẻ đáng kể so với đầu dị, bạn sử dụng loại thuốc nhuộm cho nhiều cặp mồi khác (miễn phản ứng chạy riêng biệt) Vì đầu dị thủy phân trình tự cụ thể, GOI yêu cầu cặp mồi đầu dị riêng lẻ Do đó, phương pháp thường chọn người dùng muốn đo lường số mục tiêu quan tâm, chẳng hạn kiểm tra chẩn đoán Kể từ phát triển máy qPCR thương mại đầu tiên, thiết bị đo đạc có chặng đường dài độ tin cậy độ nhạy Từ máy đầu tiên, đo số lượng nhỏ mẫu, chúng tơi thực sàng lọc thông lượng cao cách sử dụng 96 384 giếng Sự tiến nâng cao thông qua phát triển hệ thống phát Việc phát nhiều phổ phát xạ nhiều máy cho phép ghép kênh lên đến năm sáu màu lúc, tạo điều kiện phân tích thơng lượng cao khoảng thời gian ngắn Định lượng phân tích liệu Hình Định lượng RT-qPCR qPCR (A) Đường cong khuếch đại tạo trình chạy phản ứng đo thời gian thực Do phát huỳnh quang, đường cong khuếch đại tạo (đường cong màu xanh lam) liên quan đến pha bắt đầu [mức huỳnh quang thấp, thường gọi đường sở (đường đen)] Một ngưỡng xác định (đường màu xanh cây) đường cong khuếch đại pha hàm mũ độ khuếch đại vượt qua đường xác định giá trị Cq / Ct sử dụng để định lượng liệu Các kiểm soát âm, tức kiểm soát nước, phải xung quanh giá trị sở (B) Việc pha lỗng nối tiếp chất chuẩn có nồng độ biết sử dụng để tạo đường cong khuếch đại, giá trị Cq vẽ dựa nồng độ log chúng tạo đường cong chuẩn Việc phát theo thời gian thực chu kỳ qPCR dẫn đến đường cong khuếch đại với pha bắt đầu, hàm mũ bình nguyên (Hình 5A) Đường cong sở định lượng Khi bắt đầu khuếch đại, mức huỳnh quang thấp sử dụng để đặt mức huỳnh quang Khi phản ứng tiến triển theo cấp số nhân, huỳnh quang đạt đến mức cao đáng kể so với mức bản; gọi mức ngưỡng Mức ngưỡng trung tâm định lượng, điểm mà mẫu bạn vượt qua ngưỡng ghi lại dạng giá trị Ct Cq Ngưỡng đặt pha lũy thừa, việc đọc khơng bị ảnh hưởng tình trạng thiếu thuốc thử, v.v pha bình nguyên Yếu tố quan trọng thứ hai việc định lượng việc sử dụng gen tham chiếu (RG), chất kiểm soát nội sinh có tất mẫu nồng độ quán không thay đổi theo điều kiện sinh học Thông thường, gen GAPDH β-actin sử dụng; nhiên, mức độ bảng điểm thay đổi số điều kiện định, Để phân tích liệu, có hai loại phương pháp định lượng để lựa chọn, tuyệt đối tương đối Định lượng tuyệt đối nghiêm ngặt mặt kiểm soát Mỗi phản ứng yêu cầu tiêu chuẩn nồng độ biết cho RG GOI, mà đường cong tiêu chuẩn tạo cách sử dụng nồng độ log giá trị Ct (Hình 5B) Đường chuẩn sau sử dụng để định lượng nồng độ mẫu thí nghiệm chưa biết thường sử dụng để xác định số DNA Cách tiếp cận thứ hai định lượng tương đối, cho phép bạn tính tốn tỷ lệ RG GOI Độ xác định lượng phụ thuộc vào RG; đó, điều quan trọng điều không thay đổi, để tránh kết sai lầm Phương pháp sử dụng để biểu thị tỷ số RG GOI gọi phương pháp delta delta Ct (2-ΔΔCq) Ct ( Hình 5A) RG xóa khỏi GOI Ct, để loại bỏ lỗi trình tải mẫu Điều tạo giá trị ΔCt cho tất mẫu, sau so sánh trở lại với mẫu đối chứng để tạo ΔΔCt Phương pháp thường sử dụng để so sánh mẫu khỏe mạnh bệnh tật, v.v ...Hình Quy trình làm việc thí nghiệm qPCR RT -qPCR tiêu chuẩn Sau phân lập mẫu, mẫu tinh trước tạo cDNA bắt đầu trình qPCR cách sử dụng thuốc nhuộm xen kẽ đầu dò thủy phân Sự phát huỳnh quang... đường ống qPCR RT -qPCR cho cách ly mẫu Cho dù thiết kế xét nghiệm bạn có tốt đến đâu, nguyên liệu ban đầu bị nhiễm bẩn xuống cấp, bạn khơng nhận kết xác Một mẫu chất lượng tốt khối khởi đầu liệu... đại qPCR trình tự đích phản ứng RT -qPCR hai bước tách biệt hai bước (RT-PCR qPCR) , cho phép nhiều chuỗi đích phân tích phản ứng qPCR Phương pháp phát Hình So sánh thuốc nhuộm xen kẽ phát đầu