(Luận án tiến sĩ) nghiên cứu tách, tinh chế và thủy phân glucomannan từ cây amorphophallus konjac k koch ở lâm đồng và định hướng ứng dụng hạ đường huyết

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - TRẦN THỊ NỮ NGHIÊN CỨU TÁCH, TINH CHẾ VÀ THỦY PHÂN GLUCOMANNAN TỪ CÂY AMORPHOPHALLUS KONJAC K KOCH Ở LÂM ĐỒNG VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội, 2020 luan an BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - TRẦN THỊ NỮ NGHIÊN CỨU TÁCH, TINH CHẾ VÀ THỦY PHÂN GLUCOMANNAN TỪ CÂY AMORPHOPHALLUS KONJAC K KOCH Ở LÂM ĐỒNG VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SỸ HĨA HỌC Chun ngành: Hóa hữu Mã số:9.44.01.14 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS ĐỖ TRƯỜNG THIỆN TS TRẦN THỊ Ý NHI Hà Nội, 2020 luan an LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn khoa học PSG.TS Đỗ Trường Thiện TS Trần Thị Ý Nhi Các số liệu, kết nêu tài liệu trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả Trần Thị Nữ luan an LỜI CẢM ƠN Lời em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.Đỗ Trường Thiện, TS Trần Thị Ý Nhi, người tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ, động viên em suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Đặc biệt em xin cảm ơn ban lãnh đạo Học viện Khoa học Cơng nghệ, phịng ban, thầy học viện Ban lãnh đạo viện Hóa học, tập thể thầy cô, anh chị bạn Viện Hóa học tận tình giảng dạy tạo điều kiện giúp đỡ em trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Nhân dịp em xin chân thành cảm ơn đến anh chị em, bạn bè đồng nghiệp phòng Polyme Thiên nhiên – Viện Hóa học giúp đỡ động viên tơi q trình nghiên cứu Cảm ơn bạn đồng nghiệp, bạn bè, gia đình động viên, khích lệ giúp đỡ em q trình học tập nghiên cứu khoa học Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2019 Tác giả Trần Thị Nữ luan an MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung glucomannan 1.1.1.Nguồn gốc, cấu trúc glucomannan 1.1.2 Tính chất vật lý glucomannan 1.1.3 Tính chất hóa học glucomannan 1.1.4 Hoạt tính sinh học tác dụng dược lý glucomannan 1.2 Cây nưa A.konjac K.Koch quy trình tách chiết glucomannang 1.2.1 Cây Nưa Amorphophallus Konjac K.Koch 1.2.2 Quy trình tách chiết glucomannan từ củ A.konjac 12 1.3 Phản ứng cắt mạch glucomannan 15 1.3.1 Cắt mạch phương pháp lý -hóa học 15 1.3.2 Thủy phân với xúc tác enzym 17 1.3.2.1 Đặc điểm xúc tác enzym 17 1.3.2.2.Các hệ enzym thủy phân mannan 19 1.3.2.3 Nghiên cứu thủy phân glucomannan enzym 26 1.3.2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng xúc tác enzym 28 1.3.2.5 Phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm xác định điều kiện phản ứng tối ưu 30 1.4 Enzym AMPK vai trị hạ đường huyết 31 1.4.1 Q trình chuyển hóa glucose thể 31 1.4.1.1 Quá trình hấp thu glucose 31 1.4.1.2 Q trình chuyển hóa glucose 32 luan an 1.4.2 Khái quát enzym Adenoidin 5'-monophosphat hoạt hóa protein kinase (AMPK) 34 1.4.3 Các phương pháp hoạt hóa AMPK 36 1.4.3.1 hoạt hóa AMPK vận động 36 1.4.3.2 hoạt hóa AMPK hoạt chất 38 1.5 Tính hình nghiên cứu glucomannan từ nưa A.konjac Việt Nam 40 Chương THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 43 2.1.1 Nguyên liệu hóa chất 43 2.1.2 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 44 2.2 Thực nghiệm .45 2.2.1 Tách, tinh chế xác định cấu trúc, tính chất glucomannan từ A.konjac 45 2.2.1.1 Tách glucomannan từ A.konjac K.Koch 45 2.2.1.2 Xác định hàm lượng glucomannan bột konjac glucomannan 47 2.2.1.3 Xác định cấu trúc đặc trưng glucomannan .49 2.2.2 Thủy phân glucomannan 52 2.2.2.1 Thủy phân axit 52 2.2.2.2 Thủy phân konjac glucomannan enzym .53 2.2.3 Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK LKGM-E in vitro 57 2.2.4 Nghiên cứu hoạt tính hạ đường huyết LKGM-E mơ hình in vivo.59 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 61 3.1 Nghiên cứu tách, tinh chế đặc điểm cấu trúc, tính chất glucomannan củ nưa A.konjac 61 3.1.1 Tách tinh chế glucomannan từ củ Nưa A.konjac 61 3.1.1.1 Hàm lượng glucomannan củ Nưa A.konjac 61 3.1.1.2.Tách glucomannan từ củ Nưa A.konjac .63 3.1.1.3 Tinh chế glucomannan 65 3.1.2 Đặc trưng cấu trúc, tính chất glucomannan từ củ A.konjac 65 3.1.2.1 Phổ IR glucomannan 65 3.1.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân .66 luan an 3.1.2.3 Tính chất nhiệt KGM 72 3.1.2.4 Độ kết tinh 73 3.1.2.5 Khối lượng phân tử KGM .73 3.1.2.6 Hàm lượng tro kim loại nặng bột KGM .75 3.2 Thủy phân glucomannan xúc tác axit HCl 76 3.2.1 Nghiên cứu điều kiện thích hợp phản ứng thủy phân xúc tác axit 76 3.2.2 Cấu trúc tính chất sản phẩm thủy phân 82 3.2.2.1 Độ tan hiệu suất thu hồi LKGM-1 82 3.2.2.2 Phổ IR LKGM-1 83 3.2.2.3 Phổ NMR LKGM-1 .84 3.2.2.4 Tính chất nhiệt LKGM-1 87 3.2.2.5 Khối lượng trung bình LKGM-1 88 3.3 Thủy phân konjac glucomannan enzym 89 3.3.1 Định tính khả phân huỷ glucomannan enzym từ vi khuẩn 89 3.3.2 Xác định điều kiện tối ưu phản ứng phương pháp bề mặt đáp ứng90 3.3.2.1 Kết theo mơ hình thực nghiệm 90 3.3.2.2 Phân tích thống kê .92 3.3.2.3 Tìm chế độ thủy phân tối ưu 96 3.3.3 Đặc điểm cấu trúc tính chất LKGM-E 97 3.3.3.1 Phổ IR LKGM-E 97 3.3.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân LKGM-E 99 3.3.3.3 Tính chất nhiệt LKGM-E 102 3.3.3.4 Khối lượng phân tử trung bình sản phẩm thủy phân 103 3.3.3.5 Độ tan hiệu suất thu hồi LKGM-E 104 3.4 Hoạt tính hạ đường huyết LKGM-E 106 3.4.1 Hoạt tính hạ đường huyết LKGM-E mơ hình in vitro .106 3.4.2 Tác dụng ức chế dung nạp glucose huyết LKGM-E mơ hình in vivo109 KẾT LUẬN CHUNG 114 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO 117 luan an DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT A konjac Amorphophallus konjac K Koch ADP Adenosine diphotphat AMP Adenosine monophotphat AMPK Adenoidin 5'-monophosphat hoạt hóa protein kinase ATP Adenosine triphotphat DA Độ axetyl hóa DMF Dimetyl Fomamide DMSO Dimethyl sulfoxit DMEM Môi trường nuôi cấy tế bào DLS Thiết bị phân tích kích thước hạt DRS Tổng hàm lượng đường khử DSC Phân tích nhiệt quét vi sai E Enzym EC 3.2.1.21 β- glucosidase EC 3.2.1.22 α-galactosidase EC 3.2.1.25 exo-β- mannosidase EC 3.2.1.78 endo-β-mannanase FBS Huyết thai bò GH họ enzym glycosyl hydrolase GM Glucomannan HPGPC Sắc kí thẩm thấu gel hiệu cao HRP Enzym Horseradish peroxidase HS Huyết ngựa KGM Konjac glucomannan IR Phổ hồng ngoại LDK Sản phẩm thủy phân luan an LKGM-1 Konjac glucomannan thủy phân axit LKGM-E Konjac glucomannan thủy phân enzym NAD Nicotinamid adenin dinucleotid NADH Hidro nicotinamid adenin dinucleotid NADP Nicotinamid adenin dinucleotid photphat NADPH Hidro nicotinamid adenin dinucleotid photphat NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân OGTT Xét nghiệm dung nạp glucose qua đường uống PPAR Peroxisom proliferator S Cơ chất (Substrate) SDS Sodium dodecyl sulfat TCA tricarbocylic acid TBS-T Tri Buffer saline T Ween 20 TZD Thiazolidinedion UV Phổ tử ngoại XRD Quang phổ nhiễu xạ tia X luan an DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hệ sinh vật phân huỷ mannan 21 Bảng 1.2 Đặc điểm β-mannanase sinh từ số vi sinh vật 25 Bảng 1.3 Số thí nghiệm kế hoạch bậc hai Box – Behnken 30 Bảng 2.1 Các mức yếu tố ảnh hưởng 55 Bảng 2.2 Ma trận kế hoạch bậc Box – Behnken cho trường hợp k = 56 Bảng 3.1 Hàm lượng nước củ Nưa A.konjac 61 Bảng 3.2 Phương trình hồi quy hệ số tương quan đường chuẩn glucose 62 Bảng 3.3 Hàm lượng glucomannan củ nưa A.konjac khô .63 Bảng 3.4 Hàm lượng glucomannan củ nưa A konjac 64 Bảng 3.5 Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) proton (1H) KGM 69 Bảng 3.6 Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) cacbon (13C) KGM 70 Bảng 3.7 Kết phân tích TGA KGM 72 Bảng 3.8 Kết đo áp suất thẩm thấu KGM 74 Bảng 3.9 Hàm lượng tro kim loại nặng bột KGM 75 Bảng 3.10 Tổng hợp đặc điểm cấu trúc, tính chất glucomannnan từ củ A.konjac76 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nồng độ axit đến hiệu suất độ nhớt sản phẩm 76 Bảng 3.12 Ảnh hưởng tỉ lệ KGM/dd axít đến độ nhớt hỗn hợp phản ứng độ thu hồi sản phẩm 81 Bảng 3.13 Độ tan hiệu suất thu hồi sản phẩm 82 Bảng 3.14 Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) proton (1H) LKGM-1 85 Bảng 3.15 Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) cacbon (13C) LKGM-1 .85 Bảng 3.16 Kết phân tích TGA LKGM-1 87 Bảng 3.17 Áp suất thẩm thấu dung dịch sau thủy phân .88 luan an Bảng 3.29 Glucose huyết ban đầu sau uống glucose Thời điểm sau uống glucose Tên lô Lô (ĐC) Lô2 LKGM-E (3g/kg) Lô3 LKGM-E (6g/kg) Lô Glucomannan (6g/kg) Lô Glyclazid (10 mg/kg) Ban đầu t=0 t = 30 phút t = 60 phút t = 120 phút 4,51 ± 0,51 3,98 ± 0,44 5,32 ± 0,14 5,02 ±0.25 4,12 ± 0,25 4,42 ± 0,51 3,53 ± 0,34 5,58 ± 0,24 5,17 ± 0,31 4,04 ± 0,41 p>0,05 p>0,05 P>0,05 P>0,05 4,28 ± 0,59 3,22 ± 0,43 5,35 ± 0,55 5,05 ± 0,43 4,18 ± 0,55 P0,05 P>0,05 P0,05 P>0,05 4,4 ± 0,62 3,17 ± 0,51 4,06 ± 0,11 3,74 ± 0,29 3,17 ± 0,66 P