ỨNG DỤNG của NUÔI cấy VIRUS TRONG PHÂN lập và ĐỊNH DANH

ỨNG DỤNG CỦA NUÔI CẤY VIRUS TRONG PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH GVHD: PSG.TS Trương Quốc Phong SVTH: Trần Thị Thảo Anh – 20190306 Nguyễn Thùy My – 20190360 Nguyễn Thị Sóng – 20190378 Trần Quang Đức – 20190320 Tơ Xuân Hiệp – 20190334 NỘI DUNG 01 NUÔI CẤY VIRUS 03 PHƯƠNG PHÁP NHẬN DIỆN VIRUS 02 PHÂN LẬP VIRUS 04 ỨNG DỤNG PHÂN LẬP SARS-CoV-2 01 NUÔI CẤY VIRUS 1.1 KHÁI NIỆM, GIỚI THIỆU VIRUS  Virus đại phân tử nucleoprotein, chứa vật liệu di truyền acid nucleic Virus khơng có cấu tạo tế bào, khơng có q trình trao đổi chất khơng tự sinh sản Virus nguyên nhân gây nhiều bệnh nguy hiểm (viêm gan B, ung thư cổ tử cung, sốt xuất huyết, ), gây nhiều đại dịch lớn (Ebola, MERS, SARS, )  1.2 ỨNG DỤNG  Nghiên cứu, phát triển sản xuất vaccine  Phân lập, định danh  Chẩn đoán bệnh  Kiểm định  Nghiên cứu virus: cấu tạo, đặc tính, chế gây bệnh  Nghiên cứu sản xuất kit sinh phẩm 1.3 CÁC KỸ THUẬT NUÔI CẤY VIRUS  Kỹ thuật nuôi cấy virus bacteriophage (thực khuẩn thể)  Kỹ thuật nuôi cấy virus tế bào thực vật  Kỹ thuật nuôi cấy virus tế bào động vật  Kỹ thuật nuôi cấy virus trứng có phơi  Kỹ thuật ni cấy virus tế bào động vật/người 02 PHÂN LẬP VIRUS PHÂN LẬP LÀ GÌ? 2.1 Ý NGHĨA, TÁC DỤNG • Xem xét đột biến vùng gây bệnh • Tạo kháng nguyên kháng thể - có ý nghĩa mặt tạo đáp ứng miễn dịch • Phát triển thuốc thử có ý nghĩa trình phát triển nghiên cứu tạo vaccine • Có ý nghĩa xét nghiệm chẩn đoán: chứng dương, sản xuất xét nghiệm sinh phẩm, 04 ỨNG DỤNG PHÂN LẬP SARS-CoV-2 4.1 Giới thiệu virus SARS-CoV-2 ●Virus SARS-CoV-2 thuộc virus Corona hệ B (Betacoronavirrus Lineage B, Sarbecovirus) ● Trình tự gen chủng virus SARSCoV-2 bao gồm chuỗi RNA đơn gồm 29,903 nucleotide, gen có kích thước lớn số virus RNA 4.1 Giới thiệu virus SARS-CoV-2 ● Về mặt tương đồng, genome SARS-CoV-2 có: o50% mã gen so với chủng virus MERS-CoV o79,5% mã gen so với chủng virus SARS-CoV o96% mã gen so với chủng virus Corona phát dơi, đặc biệt dơi móng ngựa o99% mã gen so với chủng virus Corona có lồi Tê tê CON ĐƯỜNG LÂY NHIỄM LÂY TRUYỀN TRỰC QUA KHƠNG KHÍ TIẾP KHI TIẾP XÚC VỚI NGƯỜI BỆNH KHI TIẾP XÚC VỚI CÁC BỀ MẶT NHIỄM BẨN QUA ĐƯỜNG PHÂN CƠ CHẾ XÂM NHIỄM 4.2 Các dịng tế bào thử nghiêm ni cấy ● Dịng tế bào người: Vero CCL81và Vero E6 o Các dòng tế bào sử dụng chứa nhiều thụ thể ACE2 oĐược nuôi ủ 37°C môi trường nuôi cấy, kiểm tra CPE hàng ngày, sau ngày kể từ cho kết so sánh rõ ràng → Kết cho thấy VeroE6 lựa chọn tốt để khuếch đại định lượng 4.2 Các dòng tế bào thử nghiêm ni cấy ●Dịng tế bào người: ○Dịng tế bào phổi (Calu3) dòng tế bào ruột (Caco2): hỗ trợ phát triển SARS-CoV-2 ○Dòng tế bào gan (Huh7), dòng tế bào thận (293T) dòng tế bào thần kinh (U251): Virus tăng trưởng chậm ○Tế bào biểu mô phổi (A549), tế bào cổ tử cung (HeLa) tế bào vân (RD): không hỗ trợ phát triển SARS-CoV-2 4.3 Quy trình ni cấy ●Bước 1: Lấy mẫu bệnh phẩm chứa Sars-CoV-2 4.3 Quy trình ni cấy Bước 2: Nuôi cấy tế bào oKhi phân lập, thực pha loãng mẫu lần (hạn chế pha loãng mẫu bệnh phẩm) oTế bào Vero trypsin hóa tái huyền phù DMEM + 10% FBS + 2X Penicillin-Streptomycin + 2X kháng sinh – kháng nấm + X amphotericin B 2,5 x 105 tế bào/ml o100μl huyền phù tế bào thêm trực tiếp vào dung dịch pha loãng mẫu bệnh phẩm trộn nhẹ nhàng pipet oCác mẫu cấy cấy nuôi cấy tủ ấm 37°C làm ẩm với 5% CO2 quan sát hiệu ứng tế bào học (CPE) hàng ngày 4.4 Quy trình phân lập định danh Kính hiển vi điện tử (Electron microscopy) o Các tế bào Vero bị nhiễm bệnh cạo khỏi bình, tạo viên cách ly tâm tốc độ thấp, rửa dung dịch đệm phốt phát 0,1M, tạo viên lại cố định trong glutaraldehyde đệm 2,5% o Các mẫu cố định sau 1% osmium tetroxide, khối nhuộm 4% uranyl axetat, khử nước nhúng vào nhựa epoxy Các phần siêu mỏng cắt, nhuộm 4% uranyl axetat chì citrate, kiểm tra kính hiển vi điện tử Thermo Fisher/FEI Tecnai Spirit 4.4 Quy trình phân lập định danh Giải trình tự gen hệ (NGS) o Bước 1: Tạo thư viện: DNA cắt ngắn phù hợp theo phương pháp thường gắn đoạn nucleotide đầu o Bước 2: Giải trình tự phương pháp tổng hợp: Các thành phần cho phản ứng khuếch đại thêm vào xác định nucleotide theo nguyên lý phương pháp o Bước 3: Ghép nối đoạn DNA giải trình tự o Bước 4: Sử dụng phần mềm tin sinh phân tích liệu trình tự thu theo mục tiêu nghiên cứu 4.4 Quy trình phân lập định danh Giải trình tự gen hệ (NGS) Ứng dụng phát xác định chủng virus gây bệnh Covid-19 thiết bị giải trình tự gen hệ -NGS + Phương pháp lấy mẫu phân lập virus + Phương pháp tách chiết RNA virus chuyển thành cDNA + Giải trình tự NGS Ngồi ra, giúp nhà nghiên cứu có nhìn rõ ràng cấu trúc hệ gen, kiểm soát đột biến phát sinh, giúp phát triển phương pháp phát virus phương pháp sinh học phân tử khác thông qua mồi đoạn dị đặc hiệu 4.4 Quy trình phân lập định danh → Phương pháp giải trình tự gen hệ mới-NGS phần mềm tin sinh học nâng cao hiểu biết nguồn gốc chế truyền bệnh, giúp đẩy nhanh việc xác định mầm bệnh thúc đẩy chia sẻ liệu TÀI LIỆU THAM KHẢO Isolation and characterization of SARS-CoV-2 from the first US COVID-19 patient, Jennifer Harcourt, Azaibi Tamin, Xiaoyan Lu, Shifaq Kamili, Senthil Kumar, Sakthivel, Janna Murray, Krista Queen, Ying Tao, Clinton R Paden, Jing Zhang, Yan Li, Anna Uehara, Haibin Wang, Cynthia Goldsmith, Hannah A Bullock, Lijuan Wang, Brett Whitaker, Brian Lynch , Rashi Gautam, Craig Schindewolf, Kumari G Lokugamage, Dionna Scharton, Jessica A Plante, Divya Mirchandani, Steven G Widen, Krishna Narayanan, Shinji Makino, Thomas G Ksiazek, Kenneth S Plante, Scott C Weaver, Stephen Lindstrom, Suxiang Tong, Vineet D Menachery, Natalie J Thornburg, 3/7/2020, DOI: https://doi.org/10.1101/2020.03.02.972935 Virus isolation of severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV-2) for diagnostic and research purposes, Gregory J Walker, Anupriya Aggarwal, Sonia R Isaacs, Malinna Yeang, Zin Naing, Alberto Ospina Stella, Stuart G Turville, William D Rawlinson, 8/10/2020, DOI: https://doi.org/10.1016/j.pathol.2020.09.012 Comparative tropism, replication kinetics, and cell damage profiling of SARS-CoV-2 and SARS-CoV with implications for clinical manifestations, transmissibility, and laboratory studies of COVID-19: an observational study, Hin Chu, Jasper Fuk-Woo Chan, Terrence Tsz-Tai Yuen, Huiping Shuai, Shuofeng Yuan, Yixin Wang, Mphil, et al 21/4/2020, DOI: https://doi.org/10.1016/S2666-5247(20)30004-5 Quantifying the effect of trypsin and elastase on in vitro SARS-CoV infections, Thalia Rodriguez, Hana M Dobrovolny, 13/4/2021, DOI: https://doi.org/10.1016/j.virusres.2021.198423 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7239045/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7092802/ THANKS FOR LISTENING! ...NỘI DUNG 01 NUÔI CẤY VIRUS 03 PHƯƠNG PHÁP NHẬN DIỆN VIRUS 02 PHÂN LẬP VIRUS 04 ỨNG DỤNG PHÂN LẬP SARS-CoV-2 01 NUÔI CẤY VIRUS 1.1 KHÁI NIỆM, GIỚI THIỆU VIRUS  Virus đại phân tử nucleoprotein,... THUẬT NI CẤY VIRUS  Kỹ thuật ni cấy virus bacteriophage (thực khuẩn thể)  Kỹ thuật nuôi cấy virus tế bào thực vật  Kỹ thuật nuôi cấy virus tế bào động vật  Kỹ thuật ni cấy virus trứng có phơi... 4.4 Quy trình phân lập định danh Giải trình tự gen hệ (NGS) Ứng dụng phát xác định chủng virus gây bệnh Covid-19 thiết bị giải trình tự gen hệ -NGS + Phương pháp lấy mẫu phân lập virus + Phương