Luận văn thạc sĩ HUS xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid trong nụ và lá vối

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN QUỐC TUẤN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG FLAVONOID TRONG NỤ VÀ LÁ VỐI LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN QUỐC TUẤN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG FLAVONOID TRONG NỤ VÀ LÁ VỐI Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC CÁN BỘ HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHƢƠNG THIỆN THƢƠNG Hà Nội – 2012 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Mục lục Trang MỞ ĐẦU………………………….……….…………… …………………….…1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN………… …………….……………………….… 1.1 Tổng quan vối………………………….….…………………………… 1.1.1 Tên gọi …………………………… ……………………………………3 1.1.2 Đặc điểm thực vật……………………………………………… ………3 1.1.3 Phân bố, sinh thái………………………………………………….…… 1.1.4 Thu hái chế biến………………………………………… ………….4 1.1.5 Thành phần hóa học…………………………………………… ……….5 1.1.6 Flavonoid vối………………………………………………….7 1.1.7 Tác dụng sinh học……………………………… …………………….13 1.1.8 Ứng dụng………………………………………… ………………… 16 1.2 Các phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid …………………… …17 1.2.1 Phƣơng pháp định tính………………………………………….………17 1.2.2 Phƣơng pháp định lƣợng……………………………….……………….20 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………………………………………………………26 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu…………………………………… ……………….26 2.2 Nội dung nghiên cứu ………………………………………… ………… 27 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………… …………….27 2.3.1 Chiết xuất, phân lập flavonoid chính………….……………………… 27 2.3.2 Xác định cấu trúc chất phân lập………………………………….…… 28 2.4 Xây dựng phƣơng pháp định tính nụ vối………………… … 28 2.4.1 Định tính phƣơng pháp hóa học…………………….…………….28 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.4.2 Định tính phƣơng pháp sắc ký……………………… ………… 28 2.5 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid nụ vối…….…….30 2.5.1 Định lƣợng flavonoid toàn phần phƣơng pháp trắc quang…….…30 2.5.2 Định lƣợng flavonoid phƣơng pháp HPLC……….… 30 2.6 Một số đặc trƣng thống kê để xử lý đánh giá kết quả…… ……………31 2.7 Thiết bị, dụng cụ hóa chất, dung mơi……………………………………32 2.7.1 Thiết bị, dụng cụ……………………………………………………… 32 2.7.2 Hóa chất, dung mơi…………………………………………………… 32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………………… 33 3.1 Chiết xuất phân lập flavonoid từ nụ vối……………… 33 3.1.1 Chiết xuất dƣợc liệu phân đoạn… ………………………………….33 3.1.2 Phân lập flavonoid cao phân đoạn ethyl acetat…………….34 3.1.3 Xác định cấu trúc chất phân lập……………… ………………………37 3.2 Xây dựng phƣơng pháp định tính flavonoid nụ vối…… …… 41 3.2.1 Định tính phản ứng hóa học……………………… …………….41 3.2.2 Định tính TLC……………………………………… ………… 42 3.2.3 Định tính HPLC…………………………………………… ……46 3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid nụ vối………… 48 3.3.1 Xây dựng phƣơng pháp trắc quang……………… …………… 48 3.3.2 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng CO-1 HPLC……… ………61 KẾT LUẬN……………………………….………………………………… …74 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… 76 PHỤ LỤC LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các thành phần tinh dầu vối ……………………… Bảng 1.2 Thành phần flavonoid nụ vối……………………………… Bảng 1.3 Một số hệ dung mơi khai triển để phân tích flavonoid TLC 19 Bảng 2.1 Bảng chi tiết mẫu nụ vối…………………………………… 26 Bảng 3.1 Kết định tính sơ flavonoid cao H cao E…………… 35 Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất CO-1………… 40 Bảng 3.3 Kết SKLM cao phân đoạn ETOAC………………………… 46 Bảng 3.4 Kết độ lặp lại phƣơng pháp trắc quang………………… 49 Bảng 3.5 Kết xây dựng đƣờng chuẩn theo chất đối chiếu CO-1……… 50 Bảng 3.6 Kết xây dựng đƣờng chuẩn theo chất Catechin……………… 51 Bảng 3.7 Kết xác định độ lệch chuẩn mẫu trắng…………… 52 Bảng 3.8 Kết xác định nồng độ giới hạn LOL chất chuẩn CO-1… 53 Bảng 3.9 Kết xác định nồng độ giới hạn LOL chất Catechin…… 53 Bảng 3.10 Kết xác định độ phƣơng pháp………………… 54 Bảng 3.11A Kết đánh giá độ ổn định phƣơng pháp theo cách 1… 55 Bảng 3.11B Kết đánh giá độ ổn định phƣơng pháp theoc cách 56 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 3.12 Kết xác định flavonoid toàn…………………………….… 58 Bảng 3.13 Kết khảo sát pha động …………………………………… 62 Bảng 3.14 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống……………… … 63 Bảng 3.15 Kết khảo sát khoảng tuyến tính…………………………… 64 Bảng 3.16 Giá trị hệ số bi …………………………………………… …… 65 Bảng 3.17 Các đại lƣợng thống kê……………………………………….… 65 Bảng 3.18A Kết khảo sát độ lặp lại phƣơng pháp mẫu CO-1 66 Bảng 3.18B Kết khảo sát độ lặp lại phƣơng pháp mẫu thực… 66 Bảng 3.19 Kết khảo sát độ đứng phƣơng pháp…………………… 67 Bảng 3.20 Kết xác định nồng độ giới hạn LOD……………………… 69 Bảng 3.21 Kết xác định nồng độ giới hạn LOL……………………… 69 Bảng 3.22 Kết đánh giá sai số phƣơng pháp……………………… 71 Bảng 3.23 Kết định lƣợng hoạt chất số mẫu nụ vối… 72 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ Hình 1.1 Hình ảnh vối……………………… ………………………… Hình 1.2 Sắc ký đồ hai chất thơng số đặc trƣng…………….……….23 Hình 3.1 Hình ảnh SKLM chất CO-1 phân lập từ nụ vối……………… 37 Hình 3.2 Sắc ký đồ HPLC chất CO-1………………………………… … 37 Hình 3.3 Phổ tử ngoại UV chất CO-1……………………………………….38 Hình 3.4 Cơng thức cấu tạo chất CO-1………………………………….… 41 Hình 3.5A Sắc ký đồ định tính flavonoid nụ vối…………….….44 Hình 3.5B Sắc ký đồ định tính flavonoid cao ETOAC……………….45 Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu đối chiếu CO-1 nụ, vối………………….48 Hình 3.7 Đƣờng chuẩn xác định flavonoid tồn phần theo CO-1……… …50 Hình 3.8 Đƣờng chuẩn xác định flavonoid tồn phần theo Catechin……….51 Hình 3.9 Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL CO-1…………… …53 Hình 3.10 Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL Catechin………… 54 Hình 3.11 Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng CO-1 nụ vối…… 64 Hình 3.12 Chiều cao tín hiệu phát LOD…………………………… 69 Hình 3.13 Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL………………………….70 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết xuất phân đoạn cao nụ vối……………………… 34 Sơ đồ 3.2: Quy trình định lƣợng flavonoid toàn phần ……………………….57 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CTPT : Công thức phân tử EtOAC : Ethyl acetat EtOH : Ethanol KLPT : Khối lƣợng phân tử MeOH : Methanol SKLM : Sắc ký lớp mỏng Rf : Hệ số lƣu UV : Ultra violet IR : Infrared Spectroscopy MS : Mass Spectroscopy NMR : Cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) TLC Sắc lớp mỏng : (Thin Layer Chromatography) HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao : (High Performance Liquid Chromatography) SD : Độ lệch chuẩn (Standard deviation) RSD : Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative standard devition) LOD Giới hạn phát : (Limit of Detection) LOQ : Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantitation) LOL : Giới hạn tuyến tính (Limit of Linearity) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỞ ĐẦU Cây Vối, loại quen thuộc làng quê tỉnh Đồng Bằng bắc bộ, có tên khoa học Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry thuộc họ Sim (Myrtaceae) Từ lâu nhân dân ta biết dùng nụ vối với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay hãm lấy nƣớc uống hàng ngày vừa có tác dụng nhiệt vừa có tác dụng kiện tỳ, tiêu thực Đến có nhiều nghiên cứu Vối Thành phần hóa học nụ Vối gồm tinh dầu, triterpenoid flavonoid Theo Trung học dƣợc từ hải I (1993), tinh dầu vối có 27 thành phần Vỏ chứa chất triterpen nhóm ursan đƣợc nhận dạng acid ursolic Nụ vối có nhiều thành phần hóa học đƣợc phân lập xác định cấu trúc hóa học, chủ yếu flavonoid Thành phần hóa học nụ vối flavonoid, với khoảng 20 flavonoid khác Flavonoid nhóm hợp chất lớn có cấu trúc hóa học C6-C3-C6, thƣờng gặp nhiều thực vật Đến nay, số lƣợng flavonoid từ thực vật đƣợc tìm thấy lên tới 8150 flavonoid khác Các flavonoid có nhiều tác dụng sinh học quý nhƣ chống ung thƣ, chống dị ứng, chống co giật, giảm đau, nghẽn mạch, nghẽn phế quản, lợi mật, diệt nấm Do đó, chúng đƣợc dùng nhiều ngành công nghiệp dƣợc phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm, phục vụ lợi ích ngƣời Các flavonoid nụ vối đƣợc chứng minh có nhiều tác dụng sinh học quan trọng nhƣ chống oxy hóa, chống ung thƣ, ức chế số enzym (xanthin oxydase, α-glucosidase, maltase, acetylcholinesterase butyrylcholinesterase) Đặc biệt, số chất hợp chất có tác dụng ung thƣ nhƣ 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone, trihydroxy-6,7,4'-trimethoxy flavon; 3,5',3'- 3,3'-dihydroxy-5,6,7,4'-tetramethoxy LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com flavon Do đƣợc sử dụng nhiều để làm trà uống làm thuốc y học dân gian nên cần thiết phải có tiêu chuẩn cho nguyên liệu nụ vối Trong dự thảo Dƣợc Điển Việt Nam V (dự kiến xuất năm 2013-2014) có chuyên luận nụ vối Tuy nhiên, chuyên luận chƣa có tiêu chí định tính định lƣợng flavonoid nụ vối, flavonoid thành phần có nhiều tác dụng quan sinh học trọng Với thực trạng trên, đề xuất thực đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid nụ vối” Kết đề tài sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu nụ vối phục vụ việc quản lý chất lƣợng dƣợc liệu thị trƣờng Các mục tiêu đề tài gồm có: • Phân lập đƣợc flavonoid nụ vối dùng làm chất đối chiếu việc định tính, định lƣợng flavonoid • Xây dựng đƣợc quy trình định tính định lƣợng flavonoid dƣợc liệu nụ vối 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng3.18 B: Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp mẫu thực Tên mẫu thử Số mẫu định lƣợng Hàm lƣợng tìm thấy % Các số liệu thống kê Nụ vối Hƣng Yên 1,86 SD = 0,0346 ; RSD = 1,696% 3.3.2.4 Độ phƣơng pháp Độ phƣơng pháp đƣợc xác định phƣơng pháp thêm chất đối chiếu CO-1 Thêm vào mẫu thử (nụ vối Hƣng Yên) đƣợc xác định hàm lƣợng lƣợng xác chất chuẩn cho tổng nồng độ chúng nằm khoảng tuyến tính khảo sát Độ phƣơng pháp đƣợc xác định từ tỉ lệ thu hồi chất đối chiếu thu đƣợc từ kết định lƣợng so với lƣợng chất chuẩn thêm vào - Dung dịch chuẩn : Tiến hành pha dung dịch nhƣ mục 3.3.2 đƣợc dung dịch chuẩn có nồng độ 0,044 mg/ml - Mẫu thử : Cân xác 1,0007g nụ vối Hƣng Yên, chiết siêu âm với 50ml MeOH, vòng 30 phút, sau bổ xung lƣợng MeOH Rồi lọc lấy dịch lọc, hút xác 1ml dịch lọc + 1ml dung dịch chuẩn đem pha loãng MeOH thành 10ml bình định mức Hiệu suất thu hồi đƣợc tính theo cơng thức sau : H(%) = 100%.(Ccó thêm chuẩn - Cnền)/Cchuẩn đƣợc thêm vào kết thu đƣợc ghi bảng 3.19 75 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 3.19: Kết khảo sát độ phương pháp Tên mẫu thử Số lần định lƣợng Lƣợng thêm vào (mg) Lƣợng tìm lại đƣợc trung bình % tìm lại đƣơc trung bình Số liệu thống kê Mẫu nụ vối Hƣng Yên 0,044 0,043 97,73 RSD = 2,16 % Qua bảng cho thấy, phƣơng pháp phân tích định lƣợng HPLC có khả thu hồi lại cao 90% chấp nhận đƣợc Nhƣ phƣơng pháp có độ cao 3.3.2.5 Giới hạn phƣơng pháp Giới hạn phát (LOD): Là nồng độ thấp chất phân tích mà hệ thống phân tích cịn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu [19] Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ thấp chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu [19] Để xác định LOD, ta phân tích mẫu chuẩn nồng độ cịn xuất tín hiệu chất phân tích xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đƣờng (S/N) [19] Phân tích mẫu chuẩn nồng độ 44 μg/ml, sau pha lỗng dần đến dung dịch chuẩn khơng cịn xuất tín hiệu chất phân tích Tiến hành phân tích theo điều kiện lựa chọn, nồn độ 0,031 μg/ml đƣợc coi giới hạn phát (LOD) phƣơng pháp (Bảng 3.20) thể qua việc tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đƣờng (S/N) đạt khoảng 2-3 [19] 76 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Ta có S/N = 2.0, 2H = =3 0, h Trong đó: S chiều cao tín hiệu chất phân tích N nhiễu đƣờng Bảng 3.20: Kết xác định nồng độ giới hạn LOD Nồng độ (μg/ml) Diện tích pic 44 4,4 0,489 0,244 0,061 0,031 0,0015 1814600 229743 74145 64267 57010 55780 Khơng có tín hiệu Hình 3.12: Chiều cao tín hiệu phát LOD Qua bảng 3.20 hình 3.12 xác định đƣợc giới hạn phát (LOD) phƣơng pháp xác định CO-1 0,031 μg/ml Nhƣ suy giới hạn định lƣợng LOQ = 3,3 × LOD = 0,1023 μg/ml Xác định giới hạn LOL: Xác định cách nới rộng điểm đƣờng chuẩn tƣơng quan nồng độ diện tích píc khơng cịn tuyến tính 77 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 3.21: Kết xác định nồng độ giới hạn LOL Nồng Độ 0,11 0,1375 4575033 7119423 0,22 0,275 0,367 0,55 (mg/ml) Diện tích Píc 12105281 14809513 16490167 20791750 Giới hạn LOL 25000000 Diện tích pic 20000000 15000000 10000000 5000000 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Nồng độ CO-1 (mg/ml) Hình 3.13: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL Từ kết (Bảng 3.21 Hình 3.13) cho thấy nồng độ giới hạn LOL 0,275 mg/ml, nồng độ trở đồ thị cho thấy diện tích píc nồng độ khơng cịn tuyến tính Nhƣ vậy, khoảng nồng độ tuyến tính CO-1 để định lƣợng cho kết tốt đƣợc xác định nằm khoảng 0,1-275 μg/ml 3.3.2.6 Đánh giá sai số độ lặp phƣơng pháp Để đánh giá sai số độ lặp lại phƣơng pháp ta dựng đƣờng chuẩn, pha mẫu có nồng độ điểm đầu, điểm điểm cuối khoảng tuyến tính Thực đo mẫu lần điều kiện nhƣ đƣợc chọn 78 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sai số tính theo cơng thức: %X = ( Si  St ) St 100 Trong đó: %X: Sai số phần trăm tƣơng đối Si: Diện tích pic thu đƣợc St: Diện tích thu đƣợc theo đƣờng chuẩn Độ lặp lại phƣơng pháp đƣợc xác định theo đại lƣợng S2 %RSD Các đại lƣợng đƣợc tính theo cơng thức nhƣ mục 2.6 Bảng 3.22: Bảng kết đánh giá sai số phương pháp Mẫu CC.01(mg/ml) 0,0055 0,0275 0,11 Spic 274600 1154600 4454600 Lần đo Si %X Si %X Si %X 269653 1,80 1138335 1,41 4475033 0,46 269534 1,84 1136425 1,57 4475642 0,47 269763 1,76 1137653 1,47 4474832 0,45 269742 1,77 1136872 1,54 4476321 0,49 269364 1,91 1138356 1,41 4475086 0,46 269583 1,83 1137672 1,47 4473762 0,43 Stb 269607 1,82 1137552 1,48 4475113 0,46 SD 5,5.10-2 6,6.10-2 2.10-2 RSD (%) 3,02 4,46 4,35 Kết khảo sát cho thấy độ lệch chuẩn sai số tƣơng đối phƣơng pháp nhỏ nằm giới hạn cho phép (10%) Qua cho thấy phƣơng pháp phân tích ổn định, có độ lặp lại tốt, đồng thời có độ xác cao, phù hợp cho việc xác định hàm lƣợng CO-1 nụ vối 79 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.3.2.7 Kết định lƣợng flavonoid (CO-1) mẫu thực Áp dụng quy trình xây dựng đƣợc để định lƣợng số mẫu nụ vối thu hái miền bắc Việt Nam Các dung dịch mẫu chuẩn, mẫu thử đƣợc chuẩn bị nhƣ phần mục 3.3.3 Bảng 23: Kết định lượng hoạt chất số mẫu nụ vối STT Tên mẫu (nơi thu hái) Khối lƣợng cân (g) Độ ẩm (%) S Pic (A Hàm lƣợng chất CO-1 U.s) (mg/g) (% kl/kl) Các mẫu nụ vối Chợ Đồng Xuân (HN) 1,0709 12,62 1324731 16,81 ± 0,058 Hƣng Yên 1,0007 11,18 1377958 18,61 ± 0,184 Nam Định 1,0113 11,14 1022567 13,45 ± 0,160 Hải Dƣơng 1,0032 7,65 1143549 14,69 ± 0,093 1,68 1,86 1,35 1,47 Hà Đông (HN) 1,0057 6,77 1048407 13,24 ± 0,030 1,32 Hà Nam 1,0266 8,00 1066353 13,36 ± 0,125 Thái Nguyên 1,0003 7,85 1067456 13,74 ± 0,173 1,34 1,37 Các mẫu vối Bắc Giang 1,0020 9,30 3447931 4,661 ± 0,058 0,47 Bắc Ninh 1,0017 11,50 3158279 4,376 ± 0,053 0,44 10 Hà Đông (HN) 1,0028 11,10 3178280 4,377 ± 0,029 0,44 11 Hịa Bình 1,0180 15,10 3379762 4,792 ± 0,030 0,48 12 Phú Thọ 1,0066 8,70 3449983 4,625 ± 0,045 0,46 13 Quảng Ninh 1,0221 11,50 3312138 4,493 ± 0,023 0,49 14 Thái Bình 1,0380 10,90 3258986 4.327 ± 0,029 0,43 80 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết định lƣợng mẫu thu hái số địa phƣơng miền bắc Việt Nam cho biết hàm lƣợng CO-1 vối nằm khoảng 0,43 0,49%, thấp nhiều so với hàm lƣợng nụ vối khoảng 1,32 – 1,86% Kết nghiên cứu gợi ý cho việc xây dựng tiêu chuẩn cho dƣợc liệu nụ vối để kiểm nghiệm chất lƣợng dƣợc liệu vối sử dụng cho y học cổ truyền 81 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KẾT LUẬN Đã phân lập đƣợc flavonoid (2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'dimethylchalcone) nụ vối làm chất đối chiếu xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid Xác định đƣợc độ tinh khiết flavonoid HPLC (98,21%) Đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính flavonoid nụ vối phản ứng hóa học, sắc ký mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Đã đƣa phản ứng định tính flavonoid nụ vối gồm: phản ứng với thuốc thử NH3, NaOH, (Mg + HCl), FeCl3 Tìm đƣợc hệ dung mơi định tính flavonoid sắc ký mỏng (TLC) gồm: Hệ 1: n-Hexan : EtOAc : Acid formic = 6:3:0,1 (v:v:v ) hệ 2: Toluen : EtOAc : Acid formic = 6:4:1 (v:v:v) Định tính đƣợc flavonoid HPLC thông qua thời gian lƣu (tR = 9,3 phút) so sánh với chất đối chiếu CO-1 đƣợc tách từ nụ vối Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng flavonoid: a) Bằng phƣơng pháp trắc quang Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng flavonoid toàn phần theo chất đối chiếu CO-1 (đƣợc tách từ nụ vối) theo catechin Xác định đƣợc khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn xác định lƣợng flavonoid ; Giới hạn phát giới hạn định lƣợng phép đo nằm khoảng LOD = 0,77 mg/l, LOQ = 2,55 mg/l (theo chất đối chiếu CO-1) LOD = 1,05 mg/l, LOQ = 3,51 mg/l (theo chất chuẩn catechin) ; Độ đúng, độ ổn định phƣơng pháp phù hợp 82 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Đã xác định đƣợc hàm lƣợng flavonoid toàn phần 14 mẫu nụ vối thu hái tỉnh miền bắc Việt Nam Kết cho biết hàm lƣợng mẫu nụ 25,791 – 30,995 mg/g, mẫu 15,443 – 22,418 mg/g (tính theo chất đối chiếu CO-1) Tính theo chất chuẩn catechin : mẫu nụ 34,978 – 42,114 mg/g, mẫu 20,728 – 30,331 mg/g Kết đánh giá đƣợc hàm lƣợng flavonoid nụ vối cao vối có ý nghĩa thống kê b) Bằng sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Đƣa đƣợc điều kiện, dung môi phù hợp chạy sắc ký việc định lƣợng flavonoid nụ vối Xác định đƣợc khoảng tuyến tính (0,1 – 275 μg/ml) lập đƣờng chuẩn flavonoid Xác định đƣợc giới hạn phát (LOD = 0,031 μg/ml) giới hạn định lƣợng phép đo (LOQ = 0,1023 μg/ml) Đánh giá đƣợc sai số độ lặp lại phép đo Đã xác định đƣợc hàm lƣợng 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'dimethylchalcone số mẫu (4,3272 – 4,7924 mg/g) nụ vối (13,2437 – 18,6095 mg/g) thu hái tỉnh phía Bắc 83 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Tài liệu tham khảo I Tiếng việt Bộ Y tế (2005), Kiểm nghiệm thuốc, NXB Y học, Hà Nội tr 72-79 Bộ Y tế (2007), Hóa phân tích II, NXB Y học, Hà Nội tr.13-20 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn – Viện Dƣợc liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập II NXB Y học, tr 1065-1066 Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 1330 Dược điển Việt Nam 3, NXB Y học 2004 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, NXB Y Học Đào Thị Thanh Hiền (2000), “Góp phần nghiên cứu vối (Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry Myrtaceae)”, Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Dƣợc học, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Xuân Trung, Nguyễn Văn Ri (2003), Các phương pháp phân tích cơng cụ, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội Trần Hùng (2007), Giáo trình, Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đại học Y Dƣợc Tp HCM 10 Đỗ Tất Lợi (2001), Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Y học, Hà Nội, tr 423 11 Phạm Luận (2000), Giáo trình, Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu cao, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên-ĐHQGHN 12 Phạm Luận (2004), Cơ sở lý thuyết phương pháp phân tích phổ hấp thụ quang phân tử UV-VIS, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên-ĐHQGHN 84 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 13 Hoàng Thị Lý (2011), Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu nụ vối, khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ, Trƣờng đại học Dƣợc Hà nội 14 Trƣơng Thị Tuyết Mai, Nguyễn Thị Lâm, Nguyễn Công Khẩn, Nguyễn Văn Chuyển, Nagashima Fumie “Tác dụng chống oxy hóa nụ vối ống nghiệm chuột tiểu đường” Tạp chí Y học dự phịng, 2009, số (104) 15 Hồng Thị Tuyết Nhung (2012), Nghiên cứu chiết xuất tinh chế Conessin, Kaempferol, Nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu kiểm nghiệm thuốc, Luận án Tiến sỹ - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội 16 Nguyễn Văn Ri, giáo trình mơn học, Các phương pháp tách, Đại học Khoa học Tự Nhiên - ĐHQGHN 17 Ngô Văn Thu, Bài giảng dược liệu, tập 1, Bộ y tế Bộ giáo dục Hà Nội 18 Nguyễn Thị Kim Tuyến, Nguyễn Văn Thanh, Hồng Văn Lựu, Chu Đình Kính (2010) “Tách xác định cấu trúc số hợp chất từ nụ hoa vối (Cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry) Nghệ An” Tạp chí Dược học 405, tr 44-46 19 Tạ Thị Thảo, giáo trình mơn học, Thống kê hóa phân tích, Đại học Khoa học Tự Nhiên-ĐHQGHN 20 Trần Quang Vinh (2009), Sự thay đổi hàm lượng flavonoid chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) theo giai đoạn phát triển, Luận văn thạc sĩ Trƣờng Đại học hoa Khọc Tự Nhiên - ĐHQG HCM 21 Viện Dƣợc liệu (2008), Chiết xuất dược liệu, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội tr 11-29, 39-49, 66-76 22 Viện Dƣợc liệu – Sở Y tế tỉnh Nghệ an (2009), Cây thuốc Nghệ an, tr 606608 85 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 23 Viện Dƣợc liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 494 24 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, NXB khoa học kỹ thuật Hà nội II Tiếng anh 25 Arvouet A., B Vennat, A Pourrat and Legret (1994), “Sandardisation of an extract of Propolis and identification of the major compounds”, J Pharm Belgg., Vol 49 pp 462-468 26 Brás H de Oliveira , Tomoe Nakashima ,José D de Souza Filho and Fabiano L Frehse (2001), “HPLC Analysis of Flavonoids in Eupatorium littorale” J Braz Chem Soc., Vol 12, No 2, pp 243-246 27 Byung-Sun Min, To Dao Cuong, Joo-Sang Lee, Beom-Soo Shin, Mi Hee Woo, Tran Manh Hung (2010), “Cholinesterase Inhibitors from Cleistocalyx operculatus Buds”, Archives of Pharmacal Research 33(10), pp 1665-1670 28 Byung Sun Min, To Dao Cuong, Joo-Sang Lee, Mi Hee Woo, and Tran Manh Hung (2010), “Flavonoids from Cleistocalyx operculatus Buds and their Cytotoxic Activity” Bull Korean Chem Soc., Vol.31, No.8 pp 2392-2394 29 Chun-Lin Ye ,Jian-Wen Liu , Dong-Zhi Wei Yan-Hua Lu , Feng Qian (2005), “In vivo antitumor activity by 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'dimethylchalcone in a solid human carcinoma xenograft model”, Cancer Chemotherapy and Pharmacology 56(1), pp 70-74 30 Chun-Lin Ye, Jian-Wen Liu, Dong-Zhi Wei, Yan-Hua Lu, Feng Qian (2004), “In vitro anti-tumor activity of 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'dimethylchalcone against six established human cancer cell lines”, Pharmacological Research 50(5), pp 505-510 86 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 31 Chun-Lin Ye, Yan-Hua Lu, Dong-Zhi Wei (2004), “Flavonoids from Cleistocalyx operculatus”, Phytochemistry 65(4), pp 445–447 32 C-L Ye, Y-H Lu, X-D Li, D-Z Wei (2005), “HPLC analysis of a bioactive Chalcone and tritecpence in the buds of Cleistocalys operculatus” South African Journal of Botany, 71 (3&4) pp 312-315 33 Dao Trong Tuan et al (2010), “C-Methylated flavonoids from Cleistocalyx operculatus and their inhibitory effects on novel influenza A (H1N1) neuraminidase” Journal of Natural Products 73, pp 1636-1642 34 Elisabetta Campeol, Serena Catalano, Roberto Cremon Ini and Ivano Morell (2000), “Flavonoids analysis of Vicia species of Narbonensis complex: V kalakhensis Khatt Maxt & Bisby and V.eristalioides Maxt” Caryologia Vol 53, No.1, pp 63-68 35 Feng Quian, Chun-Lin Ye, Dong-Zhi Wei, Yan-Hua Lu, Song-Lin Yang (2005), “In vitro and in vivo reversal of cancer cell multidrug resistance by 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone”, Journal of Chemotherapy 17(3), pp 309-314 36 Han-Yao Huang, Jian-Lei Niu, Yan-Hua Lu (2012), “Multidrug resistance reversal effect of DMC derived from buds of Cleistocalyx operculatus in human hepatocellular tumor xenograft model”, Journal of the science of food and agriculture 92(1), pp 135-140 37 James M Harnly, Robert F Doherty, Gary R Beecher, Oanne M.Holden, David B Haytowitz, Seema Bhagwat, and Susan Gebhardt,(2006), “Flavonoid Content of U.S Fruits, Vegetables, and Nuts” J Agric Food Chem 54, pp 9966−9977 87 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 38 Lui Alberto Lira Soares, Valquíria Link Bassani, George González Ortega & Pedro Ros Petrovick (2003), “Total Flavonoid Determination for the Quality Control of Aqueous Extractives from Phyllanthus niruri L.” Lat Am J Pharm 22 (3), pp 203-207 39 L.-Tao, Z-T.Wang, E.-Y.Zhu, Y.-H.Lu, D.-Z.Wei (2006), “HPLC analysis of bioactive flavonoids from the rhizome of Alipinia officinarum” South African Journal of Botany 72 (2006), pp 163-166 40 Marica Medić-Šarić, Ivona Jasprica, Asja Smolčić-Bubalo and Ana Mornar (2004), “Optimization of chromatographic conditions in thin layer chromatography of flavonoids and phenolic acids” Croat Chem Acta 77(1-2), pp 361-366 41 Mudasir Sultana, Pawan Kumar Verma, Rajinder Raina, Shahid Prawez & M A Dar “Quantitative Analysis of Total Phenolic, flavonoids and Tannin Contents in Acetone and n-hexane Extracts of Ageratum conyzoides” International Journal of ChemTech Research CODEN( USA): IJCRGG ISSN : 0974-4290 Vol 4, No.3, pp 996-999 42 Nguyen Thi Dung , Jung Min Kim, Sun Chul Kang (2008), “Chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil and the ethanol extract of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry buds”, Food and Chemical Toxicology 46, pp 3632–3639 43 Tevini, M., Iwanzik, W., Teramura, A.H (1983), “Effects of UV-B radiation on plants during mild water stress-II Effects on growth, protein and flavonoid contcent”, Z Pflanzenphysiol 110, pp 459-467 88 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 44 T Sathishkumar, Baskar.R, Shanmugam.S, Rajasekaran.P, Sadasivam.S and Manikandan.V “Optimization of flavonoids extraction from the leaves of Tabernaemontana heyneana Wall using L16 Orthogonal design” Nature and Science, 6(3), 2008, ISSN: 1545-0740 45 Truong Tuyet Mai, Nguyen Van Chuyen (2007), “Anti-hyperglycemic activity of an aqueous extract from flower buds of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry”, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 71(1), pp 69-76 46 Truong Tuyet Mai, Nghiem Nguyet Thu, Pham Gia Tien, Nguyen Van Chuyen (2007), “Alpha-Glucosidase inhibitory and antioxidant activities of Vietnamese edible plants and their relationship with polyphenol contents”, Journal of Nutritional Science and Vitaminology 53(3), pp 267-276 47 Waksmundzka H M., Sherma J., Kowalska T (2008), “Thin layer Chromatography in Phytochemistry”, CRC Press, Florida pp 3-15 89 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... lập flavonoid từ nụ vối Tinh chế hoạt chất đạt độ tinh khiết cần thiết cho việc định tính, định lƣợng - Xây dựng phƣơng pháp định tính flavonoid từ nụ vối - Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid. .. 42 3.2.3 Định tính HPLC…………………………………………… ……46 3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid nụ vối? ??……… 48 3.3.1 Xây dựng phƣơng pháp trắc quang……………… …………… 48 3.3.2 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng... NGUYỄN QUỐC TUẤN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG FLAVONOID TRONG NỤ VÀ LÁ VỐI Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC CÁN BỘ HƢỚNG DẪN