Luận văn thạc sĩ HUS phân tích hoạt chất kích thích sinh trưởng axit giberillic trong rau xanh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - CAO THỊ HƯỜNG PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG AXIT GIBERILLIC TRONG RAU XANH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2011 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Cao Thị Hường PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG AXIT GIBERILLIC TRONG RAU XANH Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS TẠ THỊ THẢO Hà Nội – Năm MỤC LỤC LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ BẢNG CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .2 1.1 Khái niệm chất kích thích sinh trƣởng 1.2 Tổng quan axit giberillic(GA3) .4 1.2.1 Đặc điểm cấu tạo, tính chất hóa học .4 1.2.2 Vai trò GA3 với sinh trƣởng trồng .5 1.2.3 Độc tính 1.2.4 Dƣ lƣợng GA3 trồng .7 1.3 Phƣơng pháp xác định axit giberellic 1.3.1 Phƣơng pháp trắc quang UV-VIS 1.3.2 Phƣơng pháp sắc ký hiệu cao 1.3.3 Phƣơng pháp điện di mao quản động học mixen CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 11 2.1 Đối tƣợng, mục tiêu nội dung nghiên cứu 11 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 11 2.1.2 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 11 2.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 11 2.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn dung dịch chiết 11 2.2.2 Dụng cụ 12 2.2.3 Thiết bị 12 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 12 2.4 Điều kiện phân tích 14 2.4.1 Tiến trình phân tích .14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.4.2 Tính toán .14 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15 3.1 Nghiên cứu điều kiện tối ƣu xác định GA3 theo phổ UV-VIS 15 3.1.1 Phổ hấp phụ 15 3.1.2 Khảo sát ảnh hƣởng yếu tố đến phép đo 16 3.1.2.1 Ảnh hƣởng thể tích etanol 16 3.1.2.2 Ảnh hƣởng nồng độ HCl .17 3.1.2.3 Ảnh hƣởng thể tích nƣớc .18 3.1.3 Khảo sát điều kiện tối ƣu theo mặt mục tiêu 19 3.2 Đánh giá phƣơng pháp .23 3.2.1 Đƣờng chuẩn 23 3.2.1.1 Xây dựng đƣờng chuẩn 23 3.2.1.2 Giới hạn phát LOD .26 3.2.1.3 Giới hạn định lƣợng LOQ 27 3.2.2 Khảo sát điều kiện chiết giberillic rau xanh 27 3.2.3 Đánh giá độ xác phƣơng pháp 29 3.2.3.1 Độ chụm .29 3.2.3.2 Độ 32 3.3 Phân tích hàm lƣợng GA3 phân bón 32 3.4 Phân tích dƣ lƣợng GA3 mẫu rau 33 KẾT LUẬN .39 TÀI LIỆU THAM KHẢO .40 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 : Công thức thí nghiệm khảo nghiệm thuốc KTST Bảng 3.1 : Độ hấp thụ quang GA3 thay đổi thể tích etanol Bảng 3.2 : Độ hấp thụ quang GA3 thay đổi nồng độ HCl Bảng 3.3 : Độ hấp thụ quang thay đổi thể tích nƣớc Bảng 3.4 : Bảng qui hoạch thực nghiệm xác định điều kiện tối ƣu Bảng 3.5 : Kết thực nghiệm thiết kế thực nghiệm Bảng3.6 : Các hệ số hồi quy thu đƣợc từ thực nghiệm Bảng 3.7 : Độ hấp thụ quang nồng độ xây dựng đƣờng chuẩn Bảng 3.8 : Bảng giá trị b„ nồng độ Bảng 3.9 : Bảng giá trị SS S2 Bảng 3.10 : Ảnh hƣởng nồng độ axit HCl đến hiệu suất thu hồi Bảng 3.11 : Hàm lƣợng hoạt chất GA3 mẫu điều tra Bảng 3.12 : Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn Bảng 3.13 : Hàm lƣợng GA3 mẫu phân bón Bảng 3.14 : Kết xác định dƣ lƣợng thuốc KTST rau cải theo thời gian Bảng 3.15: Kết xác định dƣ lƣợng thuốc KTST rau diếp cá theo thời gian Bảng 3.16: Kết xác định dƣ lƣợng thuốc KTST rau muống theo thời gian LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 : Cơng thức cấu tạo GA3 Hình 1.2 : GA3 phân hủy kìm hãm sinh trƣởng DELL Hình 3.1 : Phổ GA3 Hình 3.2 : Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng GA3 khoảng tuyến tính Hình 3.3: Ảnh hƣởng nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi Hinh 3.4 : Diễn biến dƣ lƣợng thuốc kích thích sinh trƣởng rau cải Hình 3.5 : Diễn biến dƣ lƣợng thuốc kích thích sinh trƣởng rau diếp cá Hình 3.6 : Diễn biến dƣ lƣợng thuốc kích thích sinh trƣởng rau muống Hình 3.7 : Các đồ thị thể mối quan hệ nồng độ chất kích thích sinh trƣởng với thời gian mẫu khảo nghiệm rau cải Hình 3.8 : Các đồ thị thể mối quan hệ nồng độ chất kích thích sinh trƣởng với thời gian mẫu khảo nghiệm rau diếp cá Hình 3.9 : Các đồ thể mối quan hệ nồng độ chất kích thích sinh trƣởng với thời gian mẫu khảo nghiệm rau muống LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu BVTV B¶o vƯ thùc vËt KTST KÝch thÝch sinh tr-ëng LOD Giíi h¹n phát LOQ Giới hạn định lng MRL Mức d- l-ợng tối đa cho phép ( mg/kg) Chỳ thíc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỞ ĐẦU Hiện nay, vệ sinh an toàn thực phẩm vấn đề đáng báo động với ngƣời dân cấp quản lý Nhiều vụ việc nhƣ sử dụng hố chất cấm ni trồng, chế biến nơng thủy sản, thực phẩm, sản phẩm chất lƣợng lƣu hành thị trƣờng gây ảnh hƣởng xấu đến xuất tiêu dùng, vụ ngộ độc thực phẩm ngày gia tăng, có ngộ độc thuốc bảo vệ thực vật (BVTV), làm bùng lên lo âu ngƣời tiêu dùng Một nhiều ngun nhân gây thực trạng nhiễm hóa chất BVTV nơng sản chi phí phân tích cao, đầu tƣ thiết bị phân tích lớn, q trình phân tích sử dụng nhiều dung mơi hữu độc hại, quy trình phân tích phức tạp…Vì việc phát triển phƣơng pháp phân tích theo hƣớng thân thiện với mơi trƣờng, chi phí thấp, cách làm đơn giản phƣơng án cần trọng Trƣớc tình trạng chạy theo lợi nhuận lạm dụng thuốc kích thích sinh trƣởng rau vùng sản suất rau Hà Nội, Hà Tây nên việc điều tra thống kê, tiến hành khảo nghiệm loại thuốc kích thích sinh trƣởng sử dụng cần thiết để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho ngƣời tiêu dùng, để làm sở cho công tác quản lý Trên sở điều tra luận văn tập trung vào loại thuốc KTST dùng phổ biến Phƣơng pháp phân tích đƣợc xây dựng theo hƣớng hóa học xanh sử dụng dung môi hữu cơ, dùng chất vô khơng độc hại, quy trình phân tích đơn giản LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Khái niệm chất kích thích sinh trƣởng Trong trình sinh trƣởng phát triển bình thƣờng, trồng cần chất nhƣ nƣớc, cacbon dioxit, chất khoáng, chất dinh dƣỡng…Sự phát triển trồng cịn phụ thuộc vào số yếu tố bên ngồi ( ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm …) yếu tố bên ( hoạt động phản ứng sinh hóa, có tham gia số hóa chất)[14] Ở thực vật nhƣ động vật, điều tiết q trình chuyển hóa, sinh trƣởng, phát triển… phụ thuộc vào tín hiệu hóa học, gọi hormon ( bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp horman kích thích ) Các hormon giữ vị trí quan trọng việc điều tiết trình sinh trƣởng phát triển Các chất điều tiết sinh trƣởng thực vật chia thành hai nhóm : chất kích thích sinh trƣởng chất ức chế sinh trƣởng Sự cân hai nhóm định đến q trình sinh trƣởng phát triển Các hormon thực vật ( planthormon ) chất hữu có chất hóa học khác nhau, đƣợc tổng hợp với lƣợng nhỏ quan phận định từ chuyển đến quan phận khác Chúng tham gia điều tiết trình sinh trƣởng, phát triển cây, trì mối quan hệ quan, phận Tùy thuộc vào loại chất điều hịa sinh trƣởng mà chúng tham gia vào trình nhƣ [5]: - Điều khiển trình lá, phát triển chồi, tăng trƣởng chiều cao đƣờng kính thân - Điều khiển trình hoa, đậu vụ trái vụ - Điều khiển q trình rễ cho cây, cành giâm cành chiết - Điều khiển trình bảo quản hoa, kho - Điều khiển trình già phận LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Để nghiên cứu ảnh hƣởng chất, ngƣời ta phun trực tiếp lên phận trồng chất riêng biệt nồng độ khác Hiện có ba đƣờng thu nhận chất điều hòa sinh trƣởng: Chiết xuất từ thực vật, đƣờng lên men vi sinh vật, đƣờng tổng hợp hóa học + Con đƣờng chiết xuất từ thực vật: Các chất điều hịa sinh trƣởng có mặt phận trồng, nhƣng chúng nồng độ thấp, đƣờng chiết xuất thực vật hiệu suất thu hồi thấp, dẫn tới giá thành cao Vì vậy, thực tế chất thu nhận đƣợc đƣờng hóa học vi sinh vật khơng thu nhận phƣơng pháp chiết xuất từ thực vật + Thu nhận đƣờng lên men vi sinh vật: Chất điều hòa sinh trƣởng tiếng mang lại nhiều ứng dụng gibberellin đƣợc thu nhận đƣờng Bằng kỹ thuật lên men, nhà khoa học nuôi cấy nấm Fusarium moniliforme Trong trình phát triển nấm Fusarium moniliforme tổng hợp đƣợc chất kích thích sinh trƣởng gibberellin tiết vào môi trƣờng lên men Bằng kỹ thuật tách chiết, gibberellin đƣợc tách khỏi nuôi cấy kết tinh dƣới dạng tinh thể màu trắng Ở Việt Nam, gibberellin đƣợc thu nhận đƣợc đƣờng lên men vi sinh vật ứng dụng rộng Việt Nam + Thu nhận đƣờng hóa học: Có nhiều chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc sản xuất đƣờng hóa học nhƣ nhóm chất auxin, etilen… Đây đƣờng sản xuất kinh tế Hiện nƣớc ta thu nhận chất nhƣ auxin, etylen đƣờng hóa học đƣợc tiến hành phổ biến số Viện Trung tâm hóa học Chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc đƣa vào trồng dƣới hình thức: phun lên cây; ngâm củ, cành vào dung dịch; bôi lên cây; tiêm trực tiếp lên Tuỳ theo mục đích yêu cầu mà ngƣời ứng dụng chất điều hịa sinh trƣởng sử dụng trong phƣơng pháp trên, sử dụng vài phƣơng pháp cho đối tƣợng nghiên cứu sản xuất [5] LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hoạt chất GA3 đƣợc chiết khỏi mẫu Etylaxetat môi trƣờng axit Chúng tiến hành khảo sát dung dịch chiết mẫu với dung dịch HCl nồng độ khác nhau, làm thí nghiệm lặp lại lần (n=3) Mẫu khảo sát mẫu rau cải đối chứng đƣợc thêm chuẩn Tiến hành khảo sát ảnh hƣởng nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi Cân 10g mẫu đối chứng rau cải, thêm 0,2ml chuẩn GA3 500µg/ml sau thêm 5ml HCl có nồng độ khác Xử lý mẫu với quy trình chiết mang đo phổ hấp thụ quang Nồng độ mẫu đƣợc thêm chuẩn thu đƣợc tính theo đƣờng chuẩn Ta thu đƣợc bảng kết ảnh hƣởng nồng độ axit HCl đến hiệu suất thu hồi (bảng 3.10) Bảng 3.10 Ảnh hƣởng nồng độ axit đến hiệu suất thu hồi Khối STT lƣợng CHCl(M) mẫu (g) Nồng độ GA3 Nồng độ GA3 Thêm 0,2 ml có mẫu thu đƣợc 500µg/ml GA3 (µg/ml) (µg/ml) chuẩn Hiệu suất (%) 200 0,01 9,739 17,181 10 79,12 200 0,05 9,761 17,663 10 84,67 200 0,1 11,98 20,447 10 85,4 200 0,5 12,051 20,591 10 71,02 200 1,0 9,541 16,059 10 65,18 200 1,5 9,361 15,807 10 64,46 28 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi Từ số liệu ta thấy với HCl có nồng độ khoảng từ 0,1-0,05M hiệu suất thu hồi đạt giá trị cực đại 3.2.3 Độ xác phƣơng pháp Độ xác phƣơng pháp (accuracy) đƣợc đánh giá theo độ (truness) độ chụm (precision) Trong độ đƣợc đánh giá qua độ chệch – Bias (tƣơng đƣơng với hiệu suất thu hồi) Với độ chụm đánh giá qua độ lệch chuẩn lặp lại 3.2.3.1 Độ chụm Độ chụm đại lƣợng dùng để mức độ gần giá trị riêng lẻ xi phép đo lặp lại Nói cách khác độ chụm đƣợc dùng để sai khác giá trị xi so với giá trị trung bình x , đại lƣợng đặc trƣng cho độ chụm độ lệch chuẩn tƣơng đối %RSD ( hay gọi hệ số biến thiên CV) đƣợc tính theo cơng thức sau: RSD (%)  SD 100 Stb 29 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trong đó: SD độ lệch chuẩn Stb độ hấp thụ quang trung bình Độ chụm đƣợc tính tốn dựa việc làm thí nghiệm lặp lại nhiều mẫu với điều kiện hóa chất, thuốc thử thiết bị nhƣ để đánh giá độ chụm phƣơng pháp phân tích Chúng tơi tiến phân tích ba mẫu rau diếp cá, rau cải rau muống, sử dụng phƣơng pháp thêm chuẩn Tại mức thêm chuẩn, làm lặp mẫu,tính độ lệch chuẩn lặp lại, độ chụm phƣơng pháp phân tích Bảng 3.11: Chuẩn bị mẫu spike Số ml hoạt chất Nồng độ GA3 GA3 thêm vào (µg/ml) Mẫu rau cải 0,2 ml 100 µg/ml 200 Mẫu rau cải 0,2 ml 200 µg/ml 200 Mẫu rau diếp 0,2 ml 100 µg/ml 200 Mẫu rau diếp 0,2 ml 200 µg/ml 200 Mẫu rau muống 0,2 ml 200 µg/ml 200 Mẫu rau muống 0,2ml 200 µg/ml m (g) Mô tả 200 Thực lặp lại lần, tính nồng độ theo đƣờng chuẩn ta thu đƣợc độ chụm hai nồng độ nhƣ sau bảng 3.12: 30 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 3.12: Độ chụm phân tích GA3 rau cải, rau diếp cá rau muống nồng độ 10µg/ml 20µg/ml Nền mẫu Nồng độ (µg/ml) %CV 10 2,26 20 0,612 10 3,46 20 0,789 10 3,79 20 0,97 Rau cải Rau diếp cá Rau muống Theo kết ta thấy mẫu rau cải có độ chụm tốt sau đến rau diếp cá cuối rau muống Phƣơng pháp cho độ chụm tốt %RSD=2,26-3,79 nồng độ thêm chuẩn 10µg/ml %RSD=0,612-0,97 nồng độ thêm chuẩn 20µg/ml Điều hợp lý quy trình đơn giản khơng phải làm giàu 3.2.3.2 Độ Để đánh giá độ phƣơng pháp ta dùng dung dịch chuẩn GA3 có nồng độ 10µg/ml 20µg/ml Đem đo lặp lại lần, dựa vào đƣờng chuẩn tính đƣợc nồng độ lần đo Nồng độ lần đo 9,98; 10,01; 10,02; 10,03, 9,98 (µg/ml) với nồng độ 10µg/ml 19,96; 19,98; 20,1; 20,06; 20,03 (µg/ml) Áp dụng Minitab 14 ta có kết nhƣ sau: 31 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Biến N C(µg/ml) Trung Độ lệch Độ sai bình chuẩn chuẩn Khoảng tin cậy t 10 10,006 0,0261 0,0117 (9,9736; 10,0384) 0,514 20 20,026 0,0573 0,0256 (19,9549; 20,097) 1,014 Ta có ttính = 0,514 1,014 < tbảng (0,95; 4) = 2,78 chứng tỏ giá trị trung bình giá trị thực sai khác không đáng kể tức phƣơng pháp có độ chấp nhận đƣợc 3.3 Phân tích hàm lƣợng GA3 phân bón Sau tìm hiểu xác định đƣợc loại thuốc kích thích sinh trƣởng đƣợc sử dụng phổ biến tiến hành xác định thành phần hàm lƣợng hoạt chất phƣơng pháp quang phổ UV – VIS máy quang phổ UV 1601 với chất chuẩn GA3 98% Để xác định thành phần hàm lƣợng hoạt chất ta cân 1g loại phân bón, sau hịa tan lƣợng phân bón 100ml etanol tuyệt đối Lấy 1ml mẫu cho vào bình định mức 10ml Thêm 1m etanol tuyệt đối, sau định mức dung dịch HCl 3,75M thu đƣợc 10ml mẫu Sau mang đo độ hấp thụ quang bƣớc sóng 254nm với dung dịch so sánh mẫu chứa mẫu HCl 3,75M etanol tuyệt đối Mỗi loại phân bón đo lập lại lần Xác định nồng độ GA3 phân bón dựa vào đƣờng chuẩn Dựa vào đƣờng chuẩn ta xác định đƣợc hàm lƣợng GA3 loại phân bón khảo nghiệm Do thu đƣợc giá trị nhƣ bảng 3.13: 32 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 3.13: Hàm lƣợng GA3 mẫu phân bón Tên thuốc Hàm lƣợng trung bình (%) Viên sủi Tăng phọt GA3 920 17,07 20,66 An khang 20WT 21,12 Megafarm 200WT 20,96 3.4 Phân tích dƣ lƣợng GA3 rau xanh Dƣ lƣợng lƣợng hoạt chất thuốc bảo vệ thực vật, dẫn xuất sản phẩm chuyển hóa thuốc bảo vệ thực vật có độc tính cịn lƣu lại nơng sản hàng hóa mơi trƣờng sau khu sử dụng thuốc bảo vệ thực vật Thời gian cách ly khoảng thời gian tối thiểu kể từ ngày sử dụng thuốc bảo vệ thực vật lần cuối đến ngày thu hoạch sản phẩm trình trồng trọt thời gian tối thiểu từ sử dụng thuốc bảo vệ thực vật lần cuối đến sử dụng sản phẩm trình bào quản Để khảo nghiệm thời gian cách ly lấy mẫu thời điểm sau xử lý 1, 2, 3, 4, ngày Trong trình xác định dƣ lƣợng chúng tơi tiến hành phân tích lặp lại lần lấy kết trung bình Chúng sử dụng đƣờng chuẩn để xác định nồng độ GA3 mẫu khảo nghiệm Kết phân tích dƣ lƣợng thuốc số thời điểm mẫu khảo nghiệm nhƣ bảng 3.14, 3.15 3.16: 33 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 3.14: Kết xác định dƣ lƣợng thuốc KTST rau cải theo thời gian Dƣ lƣợng GA3 sau xử lý (mg/kg) Thuốc KTST STT Tên Liều lƣợng ngày ngày Tăng phọt 920 10ml/mg/m2 0,05 0,03 0,01