NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN, CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU Ở VỊNH NHA TRANG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HĨA HỌC    PHẠM ĐỨC THỊNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN, CẤU TRÚC HĨA HỌC CỦA FUCOIDAN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU Ở VỊNH NHA TRANG Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 62.44.01.18 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hướng dẫn khoa học: PGS TS Bùi Minh Lý PGS TS Lê Lan Anh Hà Nội, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu nêu luận án trung thực Những kết luận khoa học luận án chưa công bố công trình khác Hà Nội, 2015 Tác giả Phạm Đức Thịnh LỜI CẢM ƠN Trong trình nghiên cứu hồn thành luận án này, tơi nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ quý báu thầy cô, nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực bạn bè đồng nghiệp Đầu tiên xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Bùi Minh Lý PGS.TS Lê Lan Anh tận tình hướng dẫn tạo điều kiện tốt giúp tơi hồn thành luận án Tiếp theo, xin chân thành cảm ơn Quỹ Nafosted (Đề tài nghiên cứu khoa học bản, mã số: 104.01.59.09) Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam (Đề tài hợp tác quốc tế, mã số: VAST.HTQT.NGA 06/13-14) hỗ trợ kinh phí cho việc thực Luận án Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện mặt cô chú, anh chị em phịng: - Phịng Hóa phân tích Triển khai cơng nghệ nói riêng Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang nói chung - Phịng Hóa phân tích, Trung tâm phương pháp phổ ứng dụng - Viện Hóa học Phịng thử nghiệm hoạt tính sinh học - Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên - Phịng Hóa enzym, Phịng cộng hưởng từ hạt nhân khối phổ- Viện Hóa sinh Hữu Thái Bình Dương, Viện Hàn lâm Khoa học Nga, Chi nhánh Viễn Đông, Liên Bang Nga Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hóa học, Phịng Quản lý Đào tạo sau Đai học - Viện Hóa học tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành học phần luận án thủ tục cần thiết Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè ln quan tâm, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hoàn thành luận án Hà Nội, ngày 20 tháng 04 năm 2015 Tác giả Luận án Phạm Đức Thịnh i MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ .viii DANH MỤC PHỤ LỤC ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.3 RONG BIỂN 1.1.1 Giới thiệu chung rong biển .3 1.1.2 Phân loại phân bố rong biển 1.1.3 Thành phần hóa học có rong biển .5 1.2 FUCOIDAN 1.2.1 Giới thiệu chung fucoidan 2.3.1 Thành phần fucoidan rong nâu 1.2.3 Đa dạng cấu trúc fucoidan 1.2.4 Các phương pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu 13 1.2.5 Hoạt tính sinh học ứng dụng fucoidan 15 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN 20 1.3.1 Phương pháp phân tích thành phần đường 20 1.3.2 Phương pháp phân tích liên kết .21 1.3.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) 22 1.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 23 ii 1.3.5 Phương pháp phổ khối lượng (MS) 26 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN .32 1.4.1 Tình hình nghiên cứu fucoidan giới .32 1.4.2 Tình hình nghiên cứu fucoidan Việt Nam 34 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 VÀ THỰC NGHIỆM 36 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .36 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .37 2.2.1 Phương pháp chiết tách phân đoạn fucoidan .37 2.2.2 Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate thành phần đường .38 2.2.3 Phương pháp phân tích hàm lượng sulfate .38 2.2.4 Phương pháp khử sulfate 38 2.2.5 Phương pháp phân tích hàm lượng uronic axít 38 2.2.6 Phương pháp phân tích liên kết methyl hóa .38 2.2.7 Phương pháp thủy phân tạo oligosacarit 39 2.2.8 Phương pháp phổ hồng ngoại IR 39 2.2.9 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 39 2.2.10 Phương pháp phổ khối lượng MS .39 2.2.11 Phương pháp thử hoạt tính sinh học xử lý số liệu 39 2.3 THỰC NGHIỆM 40 2.3.1 Chiết tách phân đoạn tinh chế fucoidan từ rong nâu 40 2.3.2 Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate thành phần đường .41 2.3.3 Phân tích hàm lượng sulfate .41 2.3.4 Phân tích hàm lượng uronic axít .42 2.3.5 Khử sulfate .42 2.3.6 Phương pháp phân tích liên kết methyl hóa .42 iii 2.3.7 Thủy phân tạo fucoidan oligosacarit 43 2.3.8 Phổ khối MALDI-TOF/MS ESI-MS fucoidan oligosacarit 43 2.3.9 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào fucoidan 44 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .47 3.1 CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU 47 3.2 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA FUCOIDAN 48 3.3 TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN 51 3.4 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN 62 3.4.1 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư fucoidan .62 3.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn fucoidan phân lập từ rong Sargassum swartzii Sargassum mcclurei 64 3.5 ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN .69 3.5.1 Các đặc trưng cấu trúc thu từ phổ IR 69 3.5.2 Các đặc trưng cấu trúc thu từ phổ NMR 72 3.6 PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN SmF3 ĐƯỢC CHIẾT TÁCH TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI 77 3.7 ĐÁNH GIÁ MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN 97 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .99 MỞ ĐẦU Trong đa dạng vô tận thảm thực vật đại dương, rong nâu số lồi thực vật biển tự tái tạo đáng lưu ý mà người phát Rong nâu chứa nhiều polysacarit sinh học quí alginate, laminaran, fucoidan với khả ứng dụng rộng lớn [29,103] Trong số fucoidan hợp chất đặc biệt quan tâm nghiên cứu có nhiều hoạt tính sinh học q như: hoạt tính chống đơng tụ máu chống huyết khối, chống virus, chống ung thư điều biến miễn dịch, chống viêm, giảm lipid máu, chống oxy hóa đặc tính chống bổ thể (anticomplementary), chống lại bệnh gan, đường tiết niệu (uropathy renalpathy), tác dụng bảo vệ dày khả điều trị phẫu thuật [69,88] Fucoidan sulfate polysacarit có cấu trúc hóa học phức tạp tính đa dạng liên kết glycoside khả phân nhánh với vị trí nhóm sulfate xếp khơng theo quy luật mạch polymer Thành phần bao gồm nhiều loại đường, chủ yếu fucose số gốc đường khác galactose, glucose, manose, xylose , đơi cịn có axít uronic [23,36,69,71] Mặc dù có nhiều cơng trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc chi tiết fucoidan, kết nghiên cứu phát tính quy luật cấu trúc chúng trật tự liên kết gốc đường, phân nhánh vị trí gốc sulfate hạn chế [23,34,35,36,48] Mặt khác, mối quan hệ cấu trúc hoạt tính sinh học fucoidan thực tế chưa sáng tỏ [88,36,38,48,69] Để giúp cho việc nghiên cứu chế tác dụng fucoidan lên tế bào sinh vật tiến tới sử dụng fucoidan để làm dược liệu việc xác định xác thành phần cấu trúc hóa học fucoidan điều tiên thu hút ý nhiều nhà khoa học giới Nước ta có 3.200 km bờ biển trải dài từ Bắc xuống Nam, với diện tích mặt nước rộng 1.000.000 km2 thiên nhiên ban tặng cho nguồn tài nguyên rong nâu đa dạng phong phú, có khoảng 147 lồi rong nâu phân loại [1,8], lồi rong thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn với 60 loài sản lượng ước tính đạt tới 10.000 rong khơ/năm [58] Tuy nhiên nước ta chưa có cơng trình nghiên cứu có tính hệ thống thành phần hóa học, cấu trúc hoạt tính sinh học fucoidan rong nâu Việt Nam Do vậy, chọn đề tài: “Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học fucoidan có hoạt tính sinh học từ số loài rong nâu vịnh Nha Trang” nhằm hoàn chỉnh thêm nghiên cứu fucoidan rong nâu Việt Nam theo định hướng tìm kiếm nguồn dược liệu phục vụ sức khỏe cộng đồng phát triển kinh tế xã hội Mục tiêu luận án: Chiết tách phân đoạn fucoidan từ số lồi rong nâu Việt Nam Phân tích thành phần, xác định đặc điểm cấu trúc mối quan hệ cấu trúc với hoạt tính sinh học fucoidan Để đạt mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu luận án bao gồm: - Thu thập lồi rong nâu có trữ lượng lớn vùng biển vịnh Nha Trang - Tách chiết phân đoạn fucoidan từ lồi rong thu - Phân tích thành phần hóa học thăm dị hoạt tính sinh học fucoidan phân đoạn chúng - Xác định cấu trúc fucoidan có hoạt tính quan tâm - Đánh giá mối tương quan hoạt tính sinh học với đặc trưng cấu trúc fucoidan CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.3 RONG BIỂN 1.1.1 Giới thiệu chung rong biển Hàng năm đại dương cung cấp cho trái đất khoảng 200 tỷ rong biển Nhiều nhà khoa học cho 90% cacbon trái đất tổng hợp nhờ quang hợp, 20% có nguồn ngốc từ rong biển [83,97] Việc tiêu thụ sản phẩm từ rong biển (tảo đa bào biển) trải qua thời kì lịch sử lâu dài Các dấu vết khảo cổ học cho thấy, người Nhật dùng rong biển từ 10.000 năm trước Trong văn hoá Trung Quốc cổ đại, rong biển coi đặc sản dùng ăn triều đình hồng tộc hay khách hồng thân, quốc thích thưởng thức Dù rong biển coi ăn đặc trưng châu Á, thực tế quốc gia có bờ biển giới Scotland, Ireland, Newzealand, quần đảo nam Thái Bình Dương nước Nam Mỹ ven biển sử dụng rong biển từ lâu Rong biển sử dụng nhiều lĩnh vực khác Chúng nguồn nguyên liệu tự nhiên cho công nghiệp thực phẩm (Cải biển Ulva lactuca, bột rong biển, chất tạo gel E400, E401 Alginate–Agar E406, E407, Carrageenan ), mỹ phẩm (chất tạo kết cấu hoạt hóa), cơng nghiệp (Phycocolloids, hydrocolloids tạo độ sánh, gel chất ổn định), thức ăn gia súc, nông nghiệp Qua tài liệu tham khảo lịch sử thời gian sử dụng lâu dài, khơng có nguy gây hại sức khỏe đề cập đến rong biển Vì vậy, rong biển xếp vào loại thực phẩm chức ngày sử dụng rộng rãi giới Hiện nay, Nhật Bản, Trung Quốc Hàn Quốc nước tiêu thụ rong biển thực phẩm lớn nhu cầu họ sở nghề nuôi trồng thủy sản với sản lượng năm toàn giới khoảng triệu rong tươi, trị giá lên đến tỉ USD [97] Các nước lãnh thổ cung cấp rong biển thực phẩm Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc Đài Loan Các nước cung cấp rong biển cho cơng nghiệp Đan Mạch, Pháp, Na Uy, Tây Ban Nha, Mỹ Nhật 4 1.1.2 Phân loại phân bố rong biển * Phân loại phân bố rong biển giới Dựa vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái màu sắc, rong biển chia thành ngành rong [30]: Ngành rong nâu (Phaeophyta) Ngành rong đỏ (Rhodophyta) Ngành rong lục (Chlorophyta) Trong số 03 ngành rong trên, rong nâu ngành rong có trữu lượng lớn phân bố đa dạng với 1800 loài phân loại Trên giới riêng loài rong thuộc họ Sargassaseae, Fucales phân loại khoảng 400 loài [1, 8] Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều Nhật Bản, Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, Chile, Achentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha Trong Fucales, đối tượng phổ biến kinh tế rong nâu đại diện họ Sargassaceae với hai loài Sargassum Turbinaria phân bố chủ yếu vùng cận nhiệt đới Sản lượng rong nâu lớn giới tập trung Trung Quốc với 667.000 khô, với chi Laminaria, Udaria, Ascophyllum Hàn Quốc khoảng 96.000 với chi Udaria, Hizakia, Laminaria Nhật Bản khoảng 51.000 Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile khoảng 27.000 [5] * Phân loại phân bố loài rong nâu Việt Nam Ở Việt Nam đến có khoảng 147 lồi rong nâu phân loại, lồi rong thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn với khoảng 68 loài phân bố dọc ven biển Việt Nam sản lượng ước tính 10.000 khơ/năm [9] Theo điều tra tới năm 2011 có 39 lồi rong nâu thuộc chi Sargassum phân bố vùng biển Khánh Hòa, tập trung nhiều có trữ lượng lớn vịnh Nha Trang với 21 loài phổ biến sản lượng ước tính gần 4.800 khơ/năm [1] Rong nâu phân bố phổ biến vùng biển Đà Nẵng (chân đèo Hải Vân, bán đảo Sơn Trà), Quảng Nam (Cù Lao Chàm, Núi Thành), Quảng Ngãi (Bình Châu, đảo Lý Sơn, Sa Huỳnh), Bình Định (Phù Mỹ, Qui Nhơn), Phú Yên (vịnh Xuân Đài, Cù Mông), Khánh Hịa (vịnh Vân Phong, Hịn Khói, vịnh Nha Trang, vịnh Cam Ranh), Ninh Thuận (huyện Ninh Hải, Ninh Phước) Trong vùng bờ biển từ Bình Thuận đến Bà Rịa-Vũng Tàu khơng phát có mặt rong nâu Đoạn bờ biển Tây Nam Bộ thuộc tỉnh Kiên Giang từ Hịn Chơng, Hịn Trẹm (xã Bình An) đến thị xã Hà Tiên, Mỹ Đức, giáp biên giới Campuchia vùng biển có nhiều điều kiện thuận lợi cho rong nâu phát triển [1] Nhìn cách tổng quan hai khu vực ven biển phía Nam Việt Nam rong nâu phân bố tập trung vùng ven biển đảo từ Đà Nẵng đến Vũng Tàu huyện Hà Tiên (từ xã Bình An đến Mỹ Đức Hà Tiên) [8] 1.1.3 Thành phần hóa học có rong biển Rong biển có chứa đa dạng thành phần hố học, chúng thành phần có giá trị mặt dinh dưỡng dược liệu bao gồm: axít amin, axít béo nhiều nối đơi, vitamin khống chất, polyphenol, hợp chất chứa iốt, laminaran, alginat fucoidan (bảng 1.1) Trong số hợp chất polysacarit rong biển fucoidan hợp chất đặc biệt quan tâm nghiên cứu chúng sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị (kháng u, kháng đông tụ máu, kháng virus, kháng viêm, chống oxi hóa,…) với tiềm ứng dụng lớn để làm dược liệu [69, 132] Từ kết số liệu bảng 1.1, ta thấy fucoidan có thành phần ngành rong nâu mà khơng có thành phần hai ngành rong đỏ rong lục [5] Bảng 1.1: Thành phần hoá học (%) số loài rong biển Ascophyllum Laminaria Alaria Palmaria Porphyra Porphyra Ulva nodosum digitata esculenta palmata sp yezoensis sp Ngành rong Nâu Nâu Nâu Đỏ Đỏ Đỏ Lục Nước 70-85 73-90 73-86 79-88 86 Nd 78 Tro 15-25 73-90 73-86 15-30 8-16 7,8 13-22 Alginic axít 15-30 20-45 21-42 0 0 0 29-45 0 Xylan Laminaran 0-10 0-18 0-34 0 0 Mannitol 5-10 4-16 4-13 0 0 Fucoidan 4-10 2-4 nd 0 0 Floridosid 0 2-20 nd nd Protein 5-10 8-15 9-18 8-25 33-47 43,6 15-25 Chất béo 2-7 1-2 1-2 0,3-0,8 0,7 2,1 0,6-0,7 Tannin 2-10 0,1 0,5-6,0 nd nd nd nd Kali 2-3 1,3-3,8 nd 7-9 3,3 2,4 0,7 Natri 3-4 0,9-2,2 nd 2,0-2,5 Nd 0,6 3,3 Magie 0,5-0,9 0,5-0,8 nd 0,4-0,5 2,0 nd nd Iod 0,01-0,1 0,3-1,1 0,05 0,01-0,1 0,0005 nd nd 1.2 FUCOIDAN 1.2.1 Giới thiệu chung fucoidan Fucoidan anion polysacarit sulfate hóa nằm thành tế bào rong nâu, hợp chất phân lập mô tả lần Kylin vào năm 1913 [67], đặt tên “fucoidin” theo tên gọi gốc đường fucose thành phần cấu tạo nên polysacarits Nhưng theo danh pháp carbohydrate nghiêm ngặt, thuật ngữ khơng xác, polysacarit tạo nên fucose sulfate đặt tên sulfate fucan Các polysacarit thực tế có mặt ngành Da gai, cụ thể cầu gai hải sâm [125] Ngược lại, thành phần cấu trúc polysacarit rong nâu phức tạp nhiều Ngoài hai thành phần fucose sulfate, phân tử fucoidan cịn chứa thêm đường đơn khác như: galactose, xylose, manose, glucuronic axít , đồng thời bị acetyl hóa phần Cấu trúc hóa học chi tiết polyme sinh học phức tạp nhiều trường hợp cịn chưa biết đến Chính vậy, tên gọi phổ thơng “fucoidan” thích hợp nhằm dùng cho tất polysacarit sulfate hóa rong nâu, khơng liên quan đến thành phần chúng, hiển nhiên không sử dụng cho fucan sulfate hóa có nguồn gốc động vật [125] Nhờ đa dạng thành phần cấu trúc mà fucoidan sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị như: kháng đông tụ máu, kháng huyết khối, kháng virut, chống kết dính tế bào, chống tạo mạch (antiangiogenic), kháng viêm, kháng u, kháng bổ thể (anticomplementary), điều biến hệ miễn dịch, v.v [69] Nhờ vậy, fucoidan trở thành đối tượng thu hút nhiều quan tâm nghiên cứu nhà khoa học giới với tiềm ứng dụng lớn lĩnh vực thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ dưỡng dược liệu Cùng với số cơng trình nghiên cứu fucoidan tăng vọt khoảng 10 năm trở lại (Hình 1.1) [81] Hình 1.1 Số cơng trình cơng bố có liên quan đến fucoidan từ năm 1980-2010 Thành phần fucoidan rong nâu Hàm lượng fucoidan phụ thuộc vào loài rong, địa điểm thời gian thu hoạch rong Năm 1997, Park cộng công bố hàm lượng fucoidan từ 1-20% trọng lượng rong khô phụ thuộc vào lồi rong [100] Trước đó, cơng bố Stewart cộng (1961) cho hàm lượng fucoidan rong nâu không thay đổi nhiều thu rong mùa vụ khác [120] Tuy nhiên, sau cơng bố hiệu chỉnh lại nhiều nghiên cứu, theo công bố [100,126] hàm lượng fucoidan phụ thuộc vào vùng địa lý, loài rong thời điểm thu hoạch Năm 1994, Koo công bố hàm lượng fucoidan phân lập từ loài rong L religiosa, U pinnatifida, H fusiforme S fulvellum 2,7%; 6,7%; 2,5% 1,6% [66] Bảng 1.2 Thành phần hóa học số fucoidan [69] Rong nâu Thành phần hóa học (tỉ lệ mol) F vesiculosus Fucose/sulfate (1/1,20) F evanescens Fucose/sulfate/acetate (1/1,23/0,36) F distichus Fucose/sulfate/acetate (1/1,21/0,08) F serratus L Fucose/sulfate/acetate (1/1/0,1) Lessonia vadosa Fucose/sulfate (1/1,12) Macrocytis pyrifera Fucose/galactose (18/1) Pelvetia wrightii Fucose/galactose (10/1) Undaria pinnatifida (Mekabu) Fucose/galactose (1/1,1) Ascophyllum nodosum Fucose/xylose/GlcA (4,9/1/1,1) Himanthalia lorea Bifurcaria bifurcate Fucose/xylose/GlcA (2,2/1,0/2,2) Padina pavonia Fucose/xylose/mannose/glucose/galactose (1,5/1,5/1,2/1,2/1) Laminaria angustata Fucose/galactose/sulfate (9/1/9) Ecklonia kurome Fucose/galactose/mannose/xylose (1/0,67/0,03/0) Sargassum stenophyllum Fucose/galactose/mannose/xylose (1/0,2/0,02/0,24) Adenocytis utricularis Fucose/galactose/mannose (1/0,38/0,15) Hizikia fusiforme Fucose/galactose/mannose/xylose/GlcA (1/0,72/0,72/0,2/0,25) Dictyota menstrualis Fucose/xylose/uronic acid/galactose/sulfate (1/0,8/0,7/0,8/0,4) (1/0,3/0,4/1,5/1,3) Spatoglossum schroederi Fucose/xylose/galactose/sulfate (1/0,5/2/2) Fucoidan sulfate polysacarit dị thể với thành phần cấu tạo phức tạp Lần thành phần fucoidan dịch chiết nước xác định polysacarit có chứa L-fucose D-xylose, D-galactose uronic axít xem tạp chất [102] Tuy nhiên, cô bố Percival Ross (1950) cho thấy fucoidan dịch chiết nước nóng lồi rong Fucus vesiculosus, Fucus spiralis and Himanthalia lorea có chứa 38% ester sulfate, 56,7% fucose, 4% galactose, 1,5% xylose, 3% uronic axít 8% khống [103] Tỉ lệ fucose/galactose phân tử fucoidan phụ thuộc vào loài rong [80,92,102] Dillon cộng (1953) phân lập fucoidan từ lồi rong Ascophyllum nodosum có tỉ lệ fucose: galactose 8:1 [43], fucoidan phân lập từ rong Macrocystis pyrifera có tỉ lệ fucose:galactose = 18:1 [69] Ngoài ra, thành phần đường khác (như xylose, mannose, ) xác nhận hợp phần fucoidan [102] Thành phần fucoidan từ rong F vesiculosus 44,1% fucose, 26,3% sulfate, 31,1% tro lượng nhỏ amino-glucose [69,103] Như vậy, thành phần fucoidan phụ thuộc vào loài rong (bảng 1.2) [69,81] Ngoài phương pháp chiết ảnh hưởng tới thành phần fucoidan [81] Theo công bố [81], tác giả Percival (1968) phân lập fucoidan từ rong Ascophyllum nodosum cách chiết với nước nóng dung dịch kiềm lỗng nóng, kết thu fucoidan có thành phần gồm fucose, xylose, sulfate uronic axít , với lồi rong Ascophyllum nodosum tác giả Marais Joseleau (2001) tiến hành chiết dung dịch 0,01% NaCl 1% CaCl2 thu fucoidan có thành phần fucose, glucose, galactose sulfate [80] 1.2.3 Đa dạng cấu trúc fucoidan Việc phân tích cấu trúc polysacarit nói chung fucoidan nói riêng thách thức lớn hóa học chất hữu có gốc đường Cấu trúc fucoidan rong biển vô phức tạp không đồng [23] với thay đổi mơ hình liên kết (linkages), phân nhánh (branching), vị trí nhóm sulfate gốc đường polysacarit phụ thuộc vào nguồn gốc chúng [25,34,35] Vì vậy, việc phân tích cấu trúc chúng cịn vấn đề nan giải, sử dụng kỹ thuật phổ NMR phân giải cao [88] Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc chi tiết fucoidan công bố, có vài kết nghiên cứu phát tính quy luật cấu trúc fucoidan 10 -L-fucp-4(SO3-)  2)--L-fucp-(12)--L-fucp-(12)--L-fucp-(12)--L-fucp-(12) 4 4     SO3 SO3 SO3 SO3Hình 1.2 Cấu trúc fucoidan từ F vesiculosus mô tả vào năm 1950 [103] Percival Ross (1950) mô tả cấu trúc fucoidan từ rong Fucus vesiculosus polysacarit có khung mạch -L-fucose(12), vị trí mạch nhánh gốc đường -L-fucose(13) nhóm sulfate chủ yếu gắn vị trí C4 gốc đường L-fucospynanose (hình 1.2) [103] Mơ hình cấu trúc fucoidan tồn 40 năm Năm 1993, cấu trúc fucoidan rong F.vesiculosus nghiên cứu lại Patankar công sự, kết cho thấy có khác chất liên kết glycoside fucoidan với mạch -L-fucose(13) thay L-fucose(12), nhóm sulfate tìm thấy chủ yếu vị trí 4, phù hợp với mơ hình công bố trước [101] Sự khác cấu trúc fucoidan so với công bố Percival Ross Pantakar giải thích sau: kỹ thuật chiết tách khác nhau, fucoidan Percival Ross chiết dung mơi nước nóng, thay chiết dung mơi axít Pantakar; thứ hai khác phương pháp methyl hóa cuối khác phương pháp phân tích cấu trúc Percival Ross phân tích cấu trúc fucoidan dựa tính chất sắc ký hóa học sản phẩm methyl hóa, sản phẩm methyl hóa Patankar phân tích phương pháp GC-EI/MS Cấu trúc fucoidan từ loài rong Ascopphyllum nodosum (A nodosum) công bố nghiên cứu [34,35,40,42] Năm 2001, Chevolt cộng phân lập fucoidan từ rong nâu Ascorphylum nodosum [35], cấu trúc fucoidan oligosacarit (bậc polyme hóa từ 8-14) lồi rong cấu thành liên kết luân phiên (13) (14) (hình 1.3) [35] Cấu trúc fucoidan từ A.nodosum Daniel cộng nghiên cứu 11 sử dụng enzym đặc hiệu làm xúc tác sinh học để thủy phân tạo fucoidan oligosacarit, kết cho thấy có mặt lượng lớn liên kết glycoside gốc -L-fucose(13) -L-fucose(14) [40] [3)-α-L-Fucp (2SO3-)-(14)-α-L-Fucp (2,3SO3-)-1]n H CH3 H H - H HO O3SO H CH3 H H - O3SO H OSO3 - H Hình 1.3 Cấu trúc phân đoạn fucoidan tách phân lập từ rong nâu A nodusum H Cấu trúc fucoidan từ loài rong Ecklonia kurome công bố năm 1991 Nishino Nagumo Do tính dị thể phân tử fucoidan nên phổ NMR chúng phức tạp để giải thích cấu trúc cách trực tiếp Cấu trúc phân tử trung bình fucoidan chủ yếu tạo thành liên kết α-Lfucose(13) với phần lớn nhóm sulfate gắn vị trí C-4 phần C-2 vị trí C-2 điểm chẻ nhánh (hình 1.4) [91] H H H H - O3SO - O3SO CH3 H H CH3 H OH OH H H Hình 1.4 Cấu trúc fucoidan có sulfat vị trí liên kết 3-O-linked loài rong E.kurome H Năm 1999, cấu trúc fucoidan loài rong Cladosiphon Okamuranus (Chordariales) [89], Chorda filum (Laminariales) Ascophyllum nodosum (Fucales) [34,41] công bố Cấu trúc fucoidan rong Cladosiphon 12 okamuranus Chorda filum tạo thành gốc α-L-fucose(13) lặp lại đặn, với số nhóm sulfate vị trí C-2 (2-O-sulfateation) vị trí C-4 (4O-sulfateation) (hình 1.5) Sự xuất nhóm O-acetyl mạch nhánh phân tử fucoidan làm tăng thêm tính dị thể cấu trúc chúng H H H H H R2O H R2O R1O R1O H H R3O H CH3 H H CH3 H H R2O CH3 H R1 = SO3- H COCH3 R2 = SO3- HH H H H H H R2O R2O H R2O RO H R1O OH H H H H CH3 H CH3 H CH3 R1O H Hình 1.5 Cấu trúc trung bình fucoidan phân lập từ rong Chorda filum [36] H Năm 2002, cấu trúc fucoidan trọng lượng phân tử cao phân lập từ rong Fucus evanescens nghiên cứu Bilan cộng sự, kết họ phát thấy có tương đồng cấu trúc fucoidan với cấu trúc fucoidan rong A.nodosum [23] Sau vào năm 2004 2006, nhóm tác giả tiếp tục công bố thêm hai cấu trúc fucoidan từ rong Fucus distichus L Fucus serratus tạo thành gốc 1→3)α-L-Fucp 1→4)α-L-Fucp liên kết lặp lại cách tuần tự, nhóm sulfate chủ yếu vị trí C-2 C-2,4 (hình 1.6 hình 1.7) [24,25] 13 [3)--L-Fucp-(2,4 SO3-)-(14)--L-Fucp-(2SO3-)-(1]n H H H CH3 HO H OSO3- - O3SO CH3 H H H H Hình 1.6 Cấu trúc phân đoạn fucoidan phân lập từ rong Nâu Fucus distichus L OSO3- 3)--L-Fucp(2R1,4R2)-(14)--L-Fucp(2SO3-)-(1 Trong đó: R1 = SO3-, R2 = H chiếm 50% R1 = H, R2 = -L-fucp-(14)--L-fucp(2SO3-)-(13)-L-fucp(2SO3-)-(1 chiếm 50% Hình 1.7 Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus Như vậy, có mối liên hệ rõ ràng loài rong cấu trúc fucoidan, chưa đủ chứng để thiết lập mối tương quan hệ thống cấu trúc fucoidan với Bộ rong (algal order) Hầu hết công bố cấu trúc fucoidan phân lập từ loài rong vùng ơn đới, thành phần hóa học loại fucoidan nhìn chung đơn giản với gốc đường fucose sulfate Tuy nhiên, fucoidan lồi rong vùng nhiệt đới thành phần hóa học chúng phức tạp nhiều phân tử chúng thường tồn đồng thời nhiều gốc đường khác điều gây nhiều khó khăn cho việc phân tích cấu trúc loại fucoidan Đó lý khơng có nhiều cơng bố cấu trúc fucoidan rong biển vùng nhiệt đới, cho dù hoạt tính sinh học chúng vô thú vị 1.2.4 Các phương pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu Một số quy trình khác sử dụng để chiết fucoidan Mối bận tâm quy trình tách chúng nhiễu gây polysacarit khác 14 laminaran alginat Những thử nghiệm chiết tiến hành với dung môi nước Năm 1950, fucoidan từ rong Fucus vesiculosus Fucus spiralis Percival Ross chiết tách nước sôi 24 giờ, sau loại bỏ alginate protein Pb-acetate, fucoidan kết tủa dạng phức hydroxide cho phản ứng với Ba(OH)2 Phức thu được, đem thủy phân dung dịch H2SO4 loãng, fucoidan tách làm màng thẩm tách [103] Năm 1952, Black khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ, thời gian chiết tỷ lệ dung dịch chiết với rong nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi fucoidan Kết cho thấy điều kiện tối ưu để chiết fucoidan bao gồm khuấy huyền phù rong với dung dịch HCl pH: 2,0-2,5 (tỷ lệ 1:10) 70oC 1h Bằng cách xử lý lần chiết phân lập cỡ 50% fucoidan lần chiết tách 80% fucoidan Fucoidan cịn chiết đun nóng phần rong khô với 10 phần H2O 100oC 3-7,5h, cách thu 55-60% fucoidan Khi tăng tỉ lệ H2O : rong, thời gian chiết số lần chiết tăng hiệu suất chiết Theo tác giả chiết nước đơi khơng thích hợp khó tách cặn rong khỏi dung dịch nước Fucoidan thơ tách khỏi dịch chiết axít trung hịa cho bay đến khơ, hịa tan lại nước kết tủa thu phân đoạn fucoidan với cồn nồng độ 30% 60% (v/v) Phân đoạn 60%, fucoidan thơ có chứa 30-36% fucose Có thể tách fucoidan với hàm lượng fucose lớn 40% từ sản phẩm thô cách xử lý rong nguyên liệu với formaldehyde [29] Những nỗ lực nhằm đưa phương pháp chiết fucoidan có hệ thống thực Mian Percival [84] Họ tiến hành chiết tuần tự, xử lý rong nguyên liệu với formaldehyde, xử lý với cồn nồng độ 80% để loại bỏ mannitol, hợp chất màu sản phẩm khối lượng phân tử thấp, sau rong chiết cách khuấy trộn với dung dịch CaCl2 2% (ở nhiệt độ phòng 70oC) để phân lập laminaran fucoidan (alginate cố định dạng muối Ca-alginat không tan) Fucoidan chiết tiếp với dung dịch HCl loãng (pH: 2) Sau bã rong chiết với 3% Na2CO3 để thu lại alginate dạng muối tan Na-alginat Hai dung môi bổ sung cuối nhằm chiết thêm