LUẬN văn THẠC sĩ nghiên cứu tinh chế albumin trứng sử dụng trong dược phẩm

TỔNG QUAN

Sơ lược về lòng trắng trứng

Trứng bao gồm khoảng 9,5% vỏ trứng (bao gồm màng vỏ), 63% albumen (lòng trắng) và 27,5% lòng đỏ [21] Thành phần chính của trứng là nước (75%), protein (12%), lipid (12%), còn lại là carbohydrat, khoáng chất và một số vitamin (A, E, K và B) [18,23]

Protein phân bố ở cả lòng đỏ và lòng trắng trứng, trong khi đó lipid phân bố chủ yếu ở lòng đỏ Một vài khoáng chất được tìm thấy trong vỏ trứng [22]

Carbohydrat và các thành phần thứ yếu khác phân bố khắp các bộ phận của quả trứng, tồn tại ở cả dạng tự do và dạng liên hợp, liên kết với protein và lipid [23]

Lòng trắng trứng chiếm hơn một nửa (khoảng 60-63%) tổng khối lượng quả trứng Hai thành phần chính cấu tạo nên lòng trắng trứng bao gồm nước (chiếm khoảng 88%) và protein (khoảng 9,7-11%) Carbohydrat chiếm khoảng 0,5-0,6%, lượng lipid có trong lòng trắng trứng chỉ chiếm khoảng 0,01%, không đáng kể so với lượng lipid có trong lòng đỏ [21]

Protein là thành phần chính quyết định các đặc tính lý hóa và sinh học của lòng trắng trứng Trong nhiều thập kỉ qua, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để nhận biết, phân tách và định lượng các protein có trong lòng trắng trứng

Protein chiếm khối lượng lớn nhất trong tổng số protein lòng trắng trứng là ovalbumin (54%) Cùng với ovalbumin, ovotransferrin (12%), ovomucoid (11%), ovomucin (3,5%) và lysozym (3,4%) được xem là những protein chính của lòng trắng trứng Các protein khác cũng đã được nhận biết và định lượng bao gồm ovoinhibitor, ovoglycoprotein, ovoflavoprotein, ovomacroglobulin (ovostatin), cystatin, avidin… [18]

Bảng 1.1 Thành phần và tỷ lệ phần trăm khối lượng một số protein lòng trắng trứng [18]

Protein Phần trăm khối lượng (%) Protein Phần trăm khối lượng (%)

Như vậy, 70-80% protein lòng trắng trứng là ovalbumin, ovotransferrin và ovomucoid Do chứa một lượng lớn các protein trên, việc phát hiện và định lượng các protein kích thước nhỏ và chiếm tỷ lệ ít trở nên khó khăn hơn [12]

Gần đây, nghiên cứu của Mann K và Mann M sử dụng công nghệ Orbitrap kết hợp phân tích dữ liệu bằng phần mềm MaxQuant đã cho ra đời một danh sách mới, toàn diện nhất về các thành phần cấu tạo nên lòng trắng trứng, bao gồm 158 loại protein khác nhau [20]

1.1.2 Các protein chính trong lòng trắng trứng

Lòng trắng trứng chứa từ 9,7-11% protein, được xem như một hệ thống các protein hình cầu trong dung dịch thân nước Các protein chiếm thành phần nhiều nhất và tạo nên các tính chất đặc trưng của lòng trắng trứng bao gồm: ovalbumin, ovotransferrin, ovomucoid, ovomucin và lysozym

Ovalbumin là một mono phosphoglycoprotein hình cầu, khối lượng phân tử 45 kDa, điểm đẳng điện pI = 4,5, được cấu tạo từ 386 amino acid Nghiên cứu của Osuga và Feeney năm 1977 và Zabik năm 1992 cho thấy ovalbumin tồn tại ở

3 dạng A1, A2, A3 với tỷ lệ 85:12:3, chứa số nhóm phosphoryl tương ứng là 2, 1 và 0 Ovalbumin bị biến tính tại nhiệt độ 84 o C [2,5]

Ovotransferrin là một mono glycoprotein cấu tạo từ 686 amino acid với trọng lượng phân tử 77,7 kDa, điểm đẳng điện pI = 6,1 và biến tính ở nhiệt độ

61 o C [21] Ovotransferrin có chuỗi amino acid giống với glucoprotein vận chuyển sắt trong huyết tương người và chiếm 12 % lượng protein của lòng trắng trứng Ovotransferrin tồn tại ở hai dạng cấu trúc chính: dạng apo- (không liên kết với kim loại) và dạng holo- có khả năng liên kết với kim loại Cấu trúc dạng holo- của ovotransferrin bền hơn với các tác nhân vật lý và hóa học Trước đây protein này được gọi tên là conalbumin nhưng đã được đổi thành ovotransferrin sau khi phát hiện thấy khả năng liên kết với sắt và tăng đề kháng với nhiệt, áp suất cũng như enzym thủy phân protein và các tác nhân biến tính khác [2]

Ovomucoid là một glycoprotein có khối lượng phân tử 28 kDa, điểm đẳng điện pI = 4,1 Ovomucoid chứa từ 20-25% carbohydrat và có khả năng chống chịu cao với nhiệt độ (nhiệt độ biến tính là 77 o C) [21] Ovomucoid có hoạt tính ức chế trypsin và được xem như một chất gây dị ứng có trong thực phẩm Tuy nhiên nghiên cứu của Osuga và Feeny cho thấy ovomucoid trong trứng ức chế trypsin bò nhưng không có hoạt tính ức chế đối với trypsin người [2,5]

Ovomucin là một glycoprotein, đây là protein đóng vai trò tạo nên đặc tính nhớt của lòng trắng trứng Khác với các protein khác, ovomucin có khối lượng phân tử lớn, trong khoảng 5,5-8,8 x 10 3 kDa và chứa một lượng lớn cystin nối với nhau bởi các liên kết liên phân tử Ovomucin chiếm 1,5-3,5% lượng protein lòng trắng trứng và có điểm đặng điện pI = 4,5-5,0 [5,21] Ovomucin tồn tại ở 2 dạng: α-ovomucin và β-ovomucin trong đó α-ovomucin có số nhóm carbohydrat ít hơn dạng β do đó có khả năng hòa tan tốt hơn Ovomucin cũng chứa một lượng lớn nhóm disulfid và chứa tới 33% carbohydrat [5]

Lysozym là một enzym cấu tạo từ 129 amino acid với khối lượng lượng phân tử 14,2 kDa và điểm đẳng điện 10,7 Lysozym chứa 4 cầu nối disulfid dẫn đến khả năng đề kháng tốt với nhiệt, lysozym biến tính ở 75 o C [15,29]

Bảng 1.2 Thành phần và một số tính chất của các protein chính trong lòng trắng trứng [21]

Phần trăm khối lượng khô (%) Điểm đẳng điện (pI)

Khối lượng phân tử (kDa)

1.1.3 Vai trò sinh học và giá trị của các thành phần lòng trắng trứng đối với sức khỏe con người

Trứng từ lâu đã trở thành một phần quan trọng cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết trong chế độ ăn của con người Mặc dù chiếm đến 74% là nước, trứng vẫn là nguồn cung cấp các protein, acid béo, chất khoáng và các vitamin cần thiết cho cơ thể [34]

Ovalbumin

1.2.1 Cấu trúc và một số tính chất đặc trưng của ovalbumin

Ovalbumin là một mono phosphoglycoprotein có khối lượng phân tử 45 kDa, cấu tạo từ 386 amino acid, điểm đẳng điện pI = 4,5 Ovalbumin được tổng hợp tại vòi trứng và cấu thành nên 54% tổng khối lượng khô của protein lòng trắng trứng [2] Đây là một protein dự trữ và là nguồn cung cấp acid amin chủ yếu cho phôi trứng đang phát triển [24]

Ovalbumin chứa 3,5% carbohydrat, có 4 nhóm Sulfhydric tự do và một cầu nối disulfid (Cys74-Cys121) [5] Cấu trúc bậc 2 của ovalbumin gồm 41% xoắn α, 34% phiến β và 12% nếp gấp β [26]

Cấu trúc 3-D của ovalbumin với một mạch xoắn ốc phản ứng α (màu vàng) và các phiến βA (màu đỏ) được mô tả trong hình 1.1

Hình 1.1 Cấu trúc 3-D của ovalbumin [17]

Trong quá trình bảo quản, ovalbumin dần chuyển thành S-ovalbumin là một dạng cấu trúc bền hơn với nhiệt và thường được xem là ovalbumin “bền”

Sự có mặt của S-ovalbumin đã được chứng minh bởi sự khác nhau về nhiệt độ biến tính của 2 dạng cấu trúc này (92,5 o C đối với S-ovalbumin và 84,5 o C đối với ovalbumin gốc) S-ovalbumin đồng thời cũng cho thấy tính kị nước bề mặt cao hơn Lượng S-ovalbumin trong trứng tăng dần theo thời gian bảo quản, từ 5% ở trứng mới đẻ đến 81% sau 6 tháng bảo quản lạnh ở nhiệt độ 2 o C Cấu trúc tinh thể của S-ovalbumin đã được xác định là không có sự khác biệt với cấu trúc bậc

Các nghiên cứu cũng đã chỉ ra sự ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên sự chuyển đổi cấu trúc ovalbumin sang dạng S-ovalbumin Nghiên cứu của Alleoni năm 1977 cho thấy phần trăm S-ovalbumin khi bảo quản ở 8 o C sau thời gian 7,

14 và 21 ngày lần lượt là 18, 26 và 24%; ở nhiệt độ bảo quản 25 o C, lượng S- ovalbumin tương ứng sau 7 và 14 ngày là 56% và 60% Smith và Back nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên sự chuyển đổi cấu trúc của ovalbumin và cho thấy 95% ovalbumin chuyển thành dạng S-ovalbumin ở pH 10, nhiệt độ 55 o C trong

20 giờ Lượng S-ovalbumin chiếm tỷ lệ nhiều nhất ở pH 9,2 và ít nhất ở pH 7,9

1.2.2 Một số đặc tính của ovalbumin có tiềm năng nghiên cứu sử dụng trong

Lòng trắng trứng chứa một lượng lớn protein có hoạt tính kháng vi sinh vật, đóng vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch tự nhiên của trứng Ovalbumin và lysozym là hai protein chính tạo nên các đặc tính sinh học này của lòng trắng trứng

Các peptid tạo ra trong quá trình thủy phân ovalbumin nhờ các enzym tiêu hóa được phát hiện là có hoạt tính chống lại Bacillus subtilus, E coli, Bordetella bronchiseptica, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens cũng như Candida albicans [23]

Ovalbumin cũng có tiềm năng là một chất điều hòa miễn dịch, ovalbumin cho thấy khả năng gây ra sự giải phóng yếu tố hoại tử u TNF-α trong nghiên cứu in vitro, đồng thời các peptid có hoạt tính miễn dịch của ovalbumin được sử dụng để tăng cường đáp ứng miễn dịch trong miễn dịch trị liệu ung thư Hoạt động thực bào của đại thực bào cũng được tăng cường khi thêm peptid OVA 77-

Ovokinin, một peptid tách ra từ ovalbumin (OVA 358-365) và OV 359-

364 cho thấy tác dụng làm giảm mạnh huyết áp tâm thu trong tăng huyết áp tự phát ở chuột Hai peptid ức chế enzym chuyển hóa angiotensin I (ACE) cũng được tìm thấy trong ovalbumin là peptic (OVA 183-184) và tryptic (OVA 200-

218) [22,23] Nghiên cứu của Fujita và cộng sự năm 2000 tiến hành thủy phân ovalbumin với pepsin, trypsin và α-chymotrypsin cũng tạo ra 7 peptid ức chế ACE bao gồm LKA, LKP, LAP, IKW, FQKPKR, FKGRYYP và IVGRRHQG, trong đó một vài peptid đồng thời có tác dụng làm giảm nồng độ lipid trong máu

So với các polyme protein khác, ovalbumin được lựa chọn là một công cụ dẫn truyền thuốc, đặc biệt trong kiểm soát phân bố thuốc nhờ tính chất dễ kiếm, có nguồn gốc sinh học, giá thành rẻ, khả năng tạo gel, làm ổn định nhũ tương và nhạy cảm với pH, nhiệt độ [31]

1.2.3 Các phương pháp đánh giá ovalbumin

Phương pháp định lượng: Phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ ovalbumin trong dung dịch là đo độ hấp thụ quang của protein này tại bước sóng hấp thụ cực đại Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp cũng thường được sử dụng để định lượng ovalbumin nhờ hiệu quả và tính chính xác cao Bên cạnh đó, ovalbumin cũng được định lượng bằng các phương pháp định lượng protein bao gồm: Phương pháp so màu (Biuret, Lowry, Bradford), phương pháp dùng acid bicinchoninic (BCA), phương pháp phân tích amino acid sau khi thủy phân protein, phương pháp định lượng nito Kjeldahl [32]

Phương pháp định tính: Để định tính ovalbumin, các phương pháp thường được sử dụng là: HPLC, phương pháp điện di trên gel polyacrylamid, kĩ thuật miễn dịch ELISA [3,10,11,13,28]

Phương pháp đánh giá độ tinh khiết: HPLC, điện di SDS-PAGE [3- 4,10,13,28]

1.2.4 Các nghiên cứu tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng

Ovalbumin là một trong những protein đầu tiên được tách ra từ lòng trắng trứng Nó được phân tách lần đầu tiên vào những năm 1900 bằng phương pháp sử dụng dung dịch muối amoni sulfat nồng độ cao [8,14] Mặc dù được phân lập nhưng lượng muối sử dụng quá cao và độ tinh khiết của protein không được báo cáo Amoni sulfat bão hòa tiếp tục được sử dụng để tách ovalbumin bởi Warner và Weber (1951) và Warner (1954) tuy nhiên độ tinh khiết của protein tách được là thấp [28]

Năm 1940, Littlefield cùng cộng sự đã bào chế bột ovalbumin khô bằng phương pháp dùng dung dịch acid clohydric acid hóa dung dịch lòng trắng trứng về pH bằng điểm đẳng điện pI của ovalbumin Kết tủa được tách khỏi dung dịch bằng bộ lọc và sau đó được sấy khô [19]

Rhodes cùng cộng sự là những người đầu tiên sử dụng phương pháp sắc kí cho mục đích phân tách ovalbumin từ trứng Nhiều phép sắc kí khác nhau bao gồm sắc kí trao đổi ion đã được tiến hành thử nghiệm để tinh chế ovalbumin từ trứng Geng F cùng cộng sự đã phân lập được 4 protein của lòng trắng trứng gà bao gồm lysozym, ovotransferrin, ovalbumin, ovoflavoprotein bằng chất kết tủa polyethylen glycol, các protein này tiếp tục được tinh chế bằng sắc kí trao đổi ion Phương pháp HPLC được sử dụng để đánh giá độ tinh khiết của các protein tinh chế được Kết quả cho thấy độ tinh khiết của lysozym, ovotransferrin, ovalbumin, ovoflavoprotein lần lượt là 91,84%, 94,55%, 96,45% và 88,16%

[13] Tuy nhiên phương pháp này chỉ phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm, khó để áp dụng trên quy mô lớn

Năm 2009, Datta và cộng sự đã sử dụng công nghệ màng siêu lọc để tách ovalbumin từ lòng trứng gà Trong nghiên cứu này, hệ thống lọc 2 giai đoạn gồm một màng lọc polyether sulfon (PES) 30 kDa và một màng lọc PES 50 kDa được sử dụng, đồng thời dung dịch lòng trắng trứng được pha loãng bằng dung dịch muối NaCl 200mM Nghiên cứu cho thấy ovalbumin có độ tinh khiết cao (98,7%) ở điều kiện áp suất màng 2,5 kgfcm -2 , tốc độ khuấy 200 rpm, pH 2,5 và tỷ lệ pha loãng dung dịch lòng trắng trứng 1:1 (v/v) Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này liên quan đến đặc tính tạo bọt của protein lòng trắng trứng và khó để thực hiện ở quy mô lớn Việc kiểm soát áp suất, tốc độ khuấy, pH dung dịch và pha loãng vật liệu trên màng cũng khó duy trì [10]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu, thiết bị

Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu sử dụng

STT Nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn chất lượng

1 Amonium sulfat Merck – Đức NSX

2 Acid citric monohydrat Merck – Đức NSX

3 Acid chlohydric Trung Quốc NSX

4 Tris-hydrochloric Merck – Đức NSX

5 Sodium dodecyl sulfat Merck – Đức NSX

8 Tris hydrochloric Merck – Đức NSX

9 Bromphenol blue Merck – Đức NSX

10 Gel polyacrylamid Merck – Đức NSX

12 Coomassie brilliant blue Merck – Đức NSX

13 Trứng gà dưới 3 ngày tuổi Hà Nội An toàn thực phẩm

14 Nước cất BMBC DĐVN IV

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

- Máy ly tâm EBA 21 (HETTICH – Đức)

- Máy đo độ hấp thụ quang UV-2600 (SHIMADZU – Nhật Bản)

- Bể ổn nhiệt WB-5 (MRC – Israel)

- Máy đông khô Benchtop Manifold Freeze Dryers (USA)

- Thiết bị điện di AE-6500Dual ( ATTO – Nhật Bản)

- Hệ thống lọc tiếp tuyến Sartoflow Slice 200 Benchtop (SARTORIUS – Đức)

- Cân phân tích, cân kĩ thuật

- Một số dụng cụ phòng thí nghiệm: cốc có mỏ, ống đong, bình định mức, bình tam giác, pipet, đũa thủy tinh…

Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu tinh chế albumin trứng (ovalbumin) với hiệu suất và độ tinh khiết cao, nghiên cứu tiến hành thực hiện các nội dung sau:

- Nghiên cứu tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng:

 Khảo sát một số phương pháp tinh chế ovalbumin dựa trên các đặc tính khác nhau của các protein có trong lòng trắng trứng

 Xây dựng quy trình tinh chế ovalbumin

- Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của ovalbumin thu được từ quy trình tinh chế.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tinh chế albumin trứng

Nguyên lý chung: Các phương pháp sử dụng để tinh chế ovalbumin trong nghiên cứu này đều liên quan đến tính chất hydrat hóa của protein trong dung dịch Trong quá trình hydrat hóa, protein tương tác với nước qua các nối peptid hoặc các gốc R ở mạch bên nhờ liên kết hydro Nồng độ protein, pH, nhiệt độ, thời gian, lực ion, và sự có mặt của một số thành phần khác (muối, acid ) ảnh hưởng đến các phản ứng protein-protein và protein-nước, do đó làm thay đổi đặc tính tan hoặc không tan của protein trong dung dịch [1]

2.3.1.1 Tách albumin lòng trắng trứng bằng phương pháp thay đổi pH dung dịch

Cơ chế: Protein là một chất điện ly lưỡng tính vì trong phân tử của protein có nhiều nhóm phân cực mạnh (gốc R bên) của amino acid Trạng thái tích điện của các nhóm này phụ thuộc vào pH của môi trường, pH thay đổi dẫn đến thay đổi mức độ ion hóa và sự tích điện trên bề mặt các phân tử protein, làm thay đổi lực hút và đẩy giữa các phân tử này và khả năng liên kết với nước Tại pH bằng điểm đẳng điện pI, phản ứng protein-protein là cực đại, các phân tử protein dễ kết tụ lại với nhau và khả năng hydrat hóa và trương nở là cực tiểu Dựa vào tính chất này và sự khác nhau về điểm đẳng điện của các thành phần protein trong lòng trắng trứng để kết tủa một protein mong muốn (ovalbumin) bằng cách đưa pH dung dịch về điểm đẳng điện pI của ovalbumin [1]

Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút

Thu lấy dịch lỏng Điều chỉnh pH về 4,5 bằng dung dịch HCl 3M

Ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút

Hình 2.1 Sơ đồ tinh chế albumin trứng bằng phương pháp điều chỉnh pH

10g lòng trắng trứng + H 2 0 theo tỷ lệ 1:1 (v/v)

Tách riêng lòng trắng trứng khỏi lòng đỏ

Loại bỏ vật liệu màng không tan trong nước

Thu lấy kết tủa Ovalbumin Đông khô, bảo quản 4 o C

2.3.1.2 Tách albumin lòng trắng trứng sử dụng amoni sulfat bão hòa

Cơ chế: Muối trung tính có ảnh hưởng rõ rệt tới khả năng hòa tan của các protein hình cầu Khi nồng độ muối thấp, tính hydrat hóa của protein có thể tăng do sự đính thêm các ion giúp mở rộng mạng lưới protein Khi tăng đáng kể nồng độ muối trung tính thì độ tan của protein bắt đầu giảm do phản ứng muối – nước trở nên trội hơn, làm giảm liên kết protein – nước dẫn đến protein bị kết tụ, và ở nồng độ muối rất cao, protein có thể bị tủa hoàn toàn Các protein khác nhau kết tủa ở những nồng độ muối trung tính khác nhau Phương pháp này ứng dụng tính chất kết tủa protein bằng muối (phương pháp diêm tích), sử dụng muối amoni sulfat nồng độ cao để kết tủa ovalbumin từ lòng trắng trứng [1]

Thêm từ từ đồng thể tích dd (NH 4 ) 2 SO 4 bão hòa Để yên trong vòng 2 giờ

Ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút, thu lấy dịch lọc

Thêm từ từ vào dịch lọc đồng thể tích dd (NH4)2SO4 bão hòa Để yên trong 2 giờ

Ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút

Hình 2.2 Sơ đồ tinh chế ovalbumin sử dụng dd muối amoni sulfat bão hòa

10g lòng trắng trứng + H 2 0 theo tỷ lệ 1:1 (v/v)

Tách riêng lòng trắng trứng khỏi lòng đỏ

Thu lấy kết tủa Ovalbumin Đông khô, bảo quản 4 o C

2.3.1.3 Tinh chế ovalbumin bằng cách loại từng bước các protein có trong lòng trắng trứng

Tham khảo nghiên cứu của Abeyrathne và cộng sự [3,4],tiến hành tách lần lượt các protein chính có trong lòng trắng trứng, sử dụng kết hợp các phương pháp điều chỉnh pH, kết tủa protein bằng muối (kết hợp amoni sulfat với acid citric để làm giảm nồng độ muối sử dụng), lọc tiếp tuyến và biến tính các protein tạp bởi nhiệt

Nguyên lý: Ngoài ovalbumin, các protein chiếm thành phần phần trăm về khối lượng cao trong lòng trắng trứng bao gồm ovotransferrin (12%), ovomucoid (11%), ovomucin (3,5%), lysozym (3,4%) [18] Trong đó ovomucin là protein có khối lượng phân tử cao nhất và có độ tan thấp nhất Trước hết, dung dịch lòng trắng trứng được đưa về điểm đẳng điện pI = 4,75 của ovomucin để loại ovomucin Thay vì sử dụng muối trung tính ở nồng độ cao, các nghiên cứu của Abeyrathne N S cùng cộng sự đã chứng minh rằng việc thêm acid citric (2,5%, w/v) giúp làm tăng hiệu quả kết tủa protein đặc biệt là ovotransferrin, thậm chí ở nồng độ muối amoni sulfat thấp (5%, w/v) Cơ chế về tính nhạy cảm cao của ovotransferrin với amoni sulfat trong điều kiện acid chưa được rõ ràng, nhưng có thể liên quan đến sự thay đổi điện tích bề mặt của phân tử ovotransferrin, do đó làm thay đổi các tương tác của protein này với nước và các phân tử protein khác

Cách tiếp cận của phương pháp này nhắm đến việc thu lấy ovalbumin trong dịch lỏng thay vì kết tủa ovalbumin như các phương pháp khác [3]

Cách tiến hành như mô tả trong hình 2.3: Điều chỉnh pH về 4,75 bằng dung dịch HCl 3M, để yên trong 2h

Ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút, nhiệt độ 25 o C trong 30 phút

Thu lấy dịch lỏng, thêm amoni sulfat và acid citric để có nồng độ tương ứng là 5% (w/v) và 2,5% (w/v), để qua đêm ở nhiệt độ 4 o C

Ly tâm 5000 vòng/phút, 25 o C trong 30 phút

Thu dịch lỏng (S1), biến tính ở nhiệt độ 70 o C trong 15 phút

Ly tâm 5000 vòng/phút, 25 o C trong 30 phút

Hình 2.3 Sơ đồ tinh chế ovalbumin bằng cách loại từng bước các protein có trong lòng trắng trứng

10g Lòng trắng trứng + H 2 O theo tỷ lệ 1:1 (v/v)

Loại bỏ phần kết tủa là ovomucin

, hòa tan với nước theo tỷ lệ 1:4 (v/v)

Thêm 2% (w/v) amoni sulfat và 1,5% (w/v) acid citric, để qua đêm ở 4 o C

Ly tâm thu dịch lỏng S2

Loại các tạp protein còn sót lại Thu lấy dịch lỏng ovalbumin Đông khô ovalbumin, bảo quản ở 4 o C

Loại muối và các protein trọng lượng phân tử thấp khác bằng lọc tiếp tuyến qua màng 30 kD:

Sau khi loại ovotransferrin bằng amoni sulfat và acid citric, để loại muối và protein khối lượng phân tử nhỏ, dịch lỏng được lọc qua hệ thống lọc tiếp tuyến Sartoflow Slice 200 với màng lọc kích thước 30 kDa trong thời gian 2 giờ

Biến tính protein bằng nhiệt:

Lấy chính xác cùng một thể tích dung dịch sau khi lọc tiếp tuyến cho vào mỗi cốc có mỏ dung tích (được đánh số từ 1-4) Lần lượt cho biến tính các mẫu dung dịch trên trong bể ổn nhiệt ở các nhiệt độ: 70 o C,75 o C, 80 o C và 85 o C tương ứng trong thời gian 15 phút Mẫu sau biến tính được ly tâm thu lấy dịch lỏng và mang đi đông khô

2.3.2 Phương pháp đánh giá 2.3.2.1 Hình thức Đánh giá các tính chất cảm quan của sản phẩm đông khô gồm: màu sắc, độ mịn, độ xốp, độ đồng đều, kích thước các hạt kết tinh

2.3.2.2 Định lượng bằng phương pháp đo quang

Cơ chế: Protein hấp thụ mạnh ánh sáng trong vùng tử ngoại với hai cực đại hấp thụ ở bước sóng 280 nm và 200 nm nhờ sự có mặt của các amino acid chứa nhân thơm gồm phenylalanin, tryptophan, histidin và tyrosin Nồng độ các amino acid này thay đổi khá nhiều ở từng protein, dẫn đến sự khác nhau về độ hấp thụ riêng tại bước sóng hấp thụ cực đại Độ hấp thụ riêng E (1%, 1cm) thường rơi vào khoảng từ 4 đến 15, trong đó E (1%, 1cm) tại bước sóng hấp thụ cực đại 280 nm của ovalbumin trứng gà bằng 7 [32]

Dung dịch ovalbumin tinh chế cuối cùng trước khi đông khô thu được từ mỗi phương pháp tinh chế được pha loãng với nước với hệ số pha loãng thích hợp, đo độ hấp thụ quang tại bước sóng λ = 280nm

Kết quả dựa trên định luật Lambert – Beer:

A: là độ hấp thụ quang (Abs) ε: là hệ số hấp thu phân tử (M -1 cm -1 )

C: là nồng độ dung dịch (mol/l) l: chiều dày cuvet (cm)

Khi dung dịch có nồng độ 1% được đo độ hấp thụ tại một bước sóng xác định và chiều dài cuvet l = 1cm, độ hấp thụ quang khi đó của dung dịch là độ hấp thụ riêng E(1%, 1cm) Công thức tính độ hấp thụ quang A theo E(1%, 1cm):

A = E (1%, 1cm) C Độ hấp thụ riêng E (1%, 1cm) của ovalbumin bằng 7, do đó, nồng độ ovalbumin trong dung dịch được tính theo công thức sau:

2.3.2.3 Đánh giá hiệu suất tinh chế ovalbumin

Hiệu suất tách ovalbumin từ lòng trắng trứng (H%) được tính theo công thức sau:

- m2: khối lượng ovalbumin trong sản phẩm được định lượng bằng phương pháp đo quang

- m1: khối lượng ovalbumin có trong lòng trắng trứng Khối lượng này được tính dựa trên số liệu phân tích gần đây nhất các thành phần của lòng trắng trứng (chứa 10,95% protein, trong đó ovalbumin chiếm 54%) [3]

2.3.2.4 Định tính và đánh giá độ tinh khiết

Hệ thống điện di trên gel polyacrylamid natri dodecyl sulfat (SDS-PAGE) và phần mềm ImageJ được sử dụng để định tính, đánh giá độ tinh khiết của ovalbumin tinh chế được

Cơ chế: Trong điện trường, tốc độ di chuyển của các chất phụ thuộc vào điện tích, kích thước phân tử của chất đó và cường độ điện trường Trong đó, điện tích của một protein phụ thuộc vào thành phần amino acid của nó Protein tồn tại ở trạng thái xoắn và gấp khúc nhờ các liên kết disulfid, do đó kích thước phân tử của protein không phụ thuộc bởi khối lượng phân tử của protein đó Vậy nên các phân tử protein tự nhiên khác nhau có cùng khối lượng phân tử có thể di chuyển với tốc độ khác nhau trong cùng một điện trường SDS được thêm vào đệm điện di cùng với những chất khử như DDT (dithiotheitol) hoặc B-ME (β- mercaptoethanol) để phá vỡ các liên kết disulfid trong protein, biến protein từ dạng cấu trúc bậc 3 về dạng thẳng SDS đồng thời tích điện âm cho protein làm cho điện tích của phân tử protein lớn hơn hẳn điện tích có sẵn của nó SDS bám lên protein theo một tỷ lệ ổn định, làm cho điện tích mới của phân tử protein tỷ lệ với khối lượng phân tử của nó Lúc này, yếu tố duy nhất ảnh hưởng tới tốc độ di chuyển của các phân tử protein được biến tính bởi SDS là khối lượng phân tử của chúng Do đó các phân tử protein có khối lượng phân tử khác nhau được phân biệt [27]

Hình 2.4 SDS phá vỡ cấu trúc dạng cuộn xoắn của protein [27]

Hình 2.5 DDT đóng vai trò phá vỡ các liên kết disulfid [27]

- Chuẩn bị bộ đệm mẫu gồm 2% SDS, 20% glycerol, 20 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2mM EDTA, 160 mM dithiothreitol (DDT) và 0,1 mg/ml thuốc nhuộm xanh bromphenol

- Chuẩn bị mẫu protein theo công thức trong bảng 2.2:

Bảng 2.2 Công thức chuẩn bị mẫu điện di

Thành phần Thể tớch (àl)

- Biến tính mẫu ở nhiệt độ 95 o C trong thời gian 10 phút, sau đó tiến hành ly tâm loại bỏ kết tủa

- 15 àl mỗi mẫu protein và marker được tra lần lượt vào cỏc giếng của bản gel polyacrylamid 12% Chạy điện di với dòng điện 140V, 300 mA trong 2,5 giờ trên thiết bị điện di AE-6500Dual

- Để đọc kết quả điện di, gel được để qua đêm và nhuộm bằng thuốc nhuộm Coomassie Blue

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Khảo sát các phương pháp tinh chế albumin trứng

Tiến hành tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng bằng các phương pháp khác nhau, thu được các mẫu sản phẩm ovalbumin, trong đó:

- Mẫu 1: thu được từ phương pháp được mô tả trong mục 2.3.1.1

- Mẫu 2: thu được từ phương pháp được mô tả trong mục 2.3.1.2

- Mẫu 3: mẫu không lọc tiếp tuyến, biến tính ở 70 o C thu được từ phương pháp được mô tả trong mục 2.3.1.3

- Mẫu 4: mẫu sau khi lọc tiếp tuyến, biến tính ở 70 o C thu được từ phương pháp được mô tả trong mục 2.3.1.3

Kết quả được thể hiện trong hình 3.1 và bảng 3.1:

Hình 3.1 Sản phẩm đông khô thu được từ các phương pháp tinh chế ovalbumin trứng

Nhận xét: Về cảm quan, các sản phẩm ovalbumin đông khô thu được từ 3 phương pháp đều có màu trắng, ở trạng thái khô, tơi và xốp Độ mịn và độ xốp của các mẫu ovalbumin tinh chế được là khác nhau: Ovalbumin thu được từ phương pháp thay đổi pH (được mô tả trong mục 2.3.1.1) và phương pháp phân lập từng bước protein, có sử dụng màng lọc tiếp tuyến (được mô tả trong mục 2.3.1.3) có độ mịn cao hơn, tơi hơn và kích thước các tinh thể đồng đều hơn

Ngược lại, ovalbumin thu được từ phương pháp sử dụng dung dịch amoni sulfat bão hòa (được mô tả trong mục 2.3.1.2) và phương pháp phân lập protein từng bước nhưng không dùng màng lọc tiếp tuyến (được mô tả trong mục 2.3.1.3) xốp hơn, các tinh thể có kích thước lớn và không đồng đều

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát các phương pháp tinh chế ovalbumin trứng

Khối lượng lòng trắng trứng (g)

Khối lượng ovalbumin có trong lòng trắng trứng (g)

Khối lượng sản phẩm đông khô thực tế thu được (g)

Khối lượng ovalbumin trong sản phẩm đông khô (g)

Nhận xét: Kết quả khảo sát (bảng 3.1) cho thấy, sử dụng phương pháp thay đổi pH dung dịch về điểm đẳng điện của protein để tách ovalbumin từ lòng trắng trứng cho hiệu suất tách thấp (chỉ 16,52%) Dung dịch HCl 1M dùng để điểu chỉnh pH sẽ dễ dàng bay hơi trong quá trình đông khô, do đó sản phẩm đông khô thu được chứa chủ yếu là các thành phần của lòng trắng trứng Như vậy, với hàm lượng 0,098g trong tổng số 0,216g khối lượng sản phẩm đông khô, ovalbumin tách được bằng phương pháp này bị lẫn rất nhiều protein khác của lòng trắng trứng

Sản phẩm đông khô thu được từ hai phương pháp còn lại chứa một lượng muối amoni sulfat cao, đặc biệt đối với phương pháp dùng amoni sulfat bão hòa (protein chiếm khoảng 11% khối lượng lòng trắng trứng, trong khi đó lượng sản phẩm khô thu về lên đến 2,562g) Trên thực tế, các protein khác nhau bị kết tụ ở các nồng độ muối khác nhau, mặt khác quá trình kết tụ này không hoàn toàn phụ thuộc tuyến tính bởi nồng độ muối thêm vào Do đó, để lựa chọn một lượng dung dịch amoni sulfat tối ưu, đảm bảo vừa tách được ovalbumin với hiệu suất cao vừa ít gây kết tụ đồng thời các protein khác là tương đối khó khăn Hơn nữa, việc loại bỏ hoàn toàn một lượng muối lớn còn lại trong sản phẩm cũng gặp nhiều trở ngại, và khó để đảm bảo protein không bị thay đổi sau quá trình biến tính

Phương pháp tách lần lượt từng protein cho hiệu suất thu hồi ovalbumin cao nhất (trên 87%), lượng muối amoni sulfat được sử dụng là rất thấp (chỉ 5% w/v để tách ovotransferrin) So sánh khối lượng sản phẩm đông khô và khối lượng ovalbumin đo được bằng phương pháp đo quang cho thấy sự khác nhau không nhiều, chứng tỏ hầu hết amoni sulfat được loại bỏ qua màng lọc tiếp tuyến

Từ những kết quả trên, chúng tôi lựa chọn quy trình 2.3.1.3 để tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng Dung dịch sau khi được lọc tiếp tuyến có thể còn có lẫn các thành phần protein khác, đồng thời ovalbumin ngoài ra còn có thể tồn tại ở cả dạng cấu trúc S-ovalbumin có sức đề kháng cao hơn với nhiệt, do đó tiến hành một khảo sát biến tính trên 4 mẫu dung dịch (sau bước loại muối) tại 4 điểm nhiệt độ khác nhau: 70 o C, 75 o C , 80 o C và 85 o C.

Tinh chế ovalbumin bằng cách loại từng bước các protein có trong lòng trắng trứng và đánh giá một số chỉ tiêu của ovalbumin tinh chế được

3.2.1 Định tính sản phẩm tinh chế được

Tiến hành tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng theo phương pháp mô tả trong mục 2.3.1.3 Để xác định các protein có trong sản phẩm thu về, tiến hành theo phương pháp được mô tả trong mục 2.3.2.4 với các mẫu:

- Mẫu 1: Dung dịch LTT pha loãng 2 lần với nước

- Mẫu 2: Dịch lỏng sau khi loại ovomucin

- Mẫu 3: Dịch lỏng (S1) sau khi loại ovotransferrin

- Mẫu 4: Dịch lỏng (S2) sau khi loại ovotransferrin

- Mẫu 5: Dung dịch sau bước lọc tiếp tuyến

- Mẫu 6, 7, 8, 9: Dịch lỏng sau khi biến tính ở 75 o C, 70 o C, 80 o C và 85 o C

Kết quả chạy điện di được thể hiện trong hình 3.2:

Hình 3.2 Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu thu được từ các bước

Giếng 1: mẫu 1 Giếng 2: mẫu 2 Giếng 3: mẫu 3 Giếng 4: mẫu 4 Giếng 5: mẫu 5 Giếng 6, 7, 8, 9: mẫu 6, 7, 8, 9 Giếng 10: marker

Nhận xét: So sánh hình ảnh điện di của mẫu 1, 2 với các mẫu 3 – 9 cho thấy một lượng lớn ovotransferrin đã được loại khỏi dung dịch sau bước xử lý với amoni sulfat và acid citric Điều này chỉ ra rằng việc kết hợp acid citric giúp làm giảm nồng độ muối sử dụng và cho hiệu quả loại bỏ ovotransferrin cao Tuy nhiên, quan sát hình ảnh điện di ở giếng 4 có thể thấy một lượng nhỏ ovalbumin cũng bị kết tủa đồng thời với ovotransferrin

Ngoài ovalbumin, 2 protein khác có khả năng đề kháng tương đối tốt với nhiệt là lysozym (biến tính ở 75 o C) và ovomucoid (biến tính ở 77 o C) Hai protein này có khối lượng phân tử nhỏ (14,3 kDa và 28 kDa) do đó sẽ bị loại bỏ qua màng lọc tiếp tuyến 30 kDa (so sánh hình ảnh điện di ở giếng 5 so với giếng 1, 2,

Từ giếng số 6 – 9, hình ảnh trên gel điện di cho thấy sự khác biệt rõ rệt so với giếng số 5 Các tạp chất chính (ngoại trừ ovotransferrin) gồm ovomucoid, lysozym, globulin, avidin hầu như bị loại khỏi dung dịch Điều này chứng tỏ nhiệt độ có tác động rất lớn trong việc tinh sạch các protein khác ra khỏi ovalbumin

Các giếng 6, 7, 8 cho thấy rõ băng điện di của ovalbumin và lẫn một số lượng ít tạp chất là ovotransferrin Ở nhiệt độ 70 o C, hầu hết các tạp protein còn lại đều đều bị kết tủa hết ngoại trừ ovotransferrin Từ giếng 7, 6, 8, 9, ovotransferrin dần được loại bỏ nhờ kết tủa bởi nhiệt Đồng thời băng ovalbumin nhạt dần khi tăng nhiệt độ, ovalbumin bắt đầu có dấu hiệu kết tủa khi tăng nhiệt độ lên 75 o C, và bị kết tủa mạnh tại nhiệt độ 80 o C Ở 85 o C, ovalbumin gần như bị kết tủa hoàn toàn, băng điện di xuất hiện mờ trên giếng 9 có thể là của cấu trúc S-ovalbumin

3.2.2 Hiệu suất tinh chế ovalbumin

Tiến hành tinh chế ovalbumin theo phương pháp được mô tả trong mục 2.3.1.3 với khối lượng lòng trắng trứng ban đầu là 100 g Định lượng ovalbumin trong dung dịch sau khi biến tính ở nhiệt độ 70 o C, 75 o C, 80 o C, 85 o C bằng phương pháp mô tả trong mục 2.3.2.2 Hiệu suất tinh chế được tính toán theo công thức (3) được mô tả trong mục 2.3.2.3:

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất tinh chế ovalbumin

Nhận xét: Kết quả thực nghiệm cho thấy, hiệu suất tinh chế ovalbumin bắt đầu giảm mạnh khi tăng nhiệt độ từ 70 o C lên 75 o C Khi tăng dần nhiệt độ biến tính, khả năng đề kháng với nhiệt của ovalbumin giảm, do đó lượng ovalbumin bị kết tủa đồng thời cùng các tạp protein khác tăng, hiệu suất tách ovalbumin từ lòng trắng trứng giảm Khi biến tính ovalbumin chỉ còn 16,06%, gi biến tính 70 o C (87,33%)

3.2.3 Độ tinh khiết của ovalbumin

Các mẫu sau khi biến tính bởi nhiệt nh tâm, thu lấy dịch lỏng v độ tinh khiết của ovalbumin phần mềm ImageJ Công th Kết quả được thể hiện trong

Hình 3.3 Kết quả đo mật độ h ắng trứng giảm Khi biến tính ở nhiệt độ 85 o C, hiệu suất tinh chế

16,06%, giảm hơn 5 lần khi so sánh với giá trị (87,33%) ộ tinh khiết của ovalbumin ẫu sau khi biến tính bởi nhiệt như mô tả trong mục 2.3.1.3 đ ấy dịch lỏng và đông khô Sản phẩm đông khô được tiến h ộ tinh khiết của ovalbumin dựa trên tính toán mật độ hình ảnh

Công thức tính độ tinh khiết được mô tả trong mục ợc thể hiện trong hình 3.3 và bảng 3.3: ến tính loại tạp ở 70 o C Biến tính loại tạp ến tính loại tạp ở 80 o C Biến tính loại tạp ở 85 ết quả đo mật độ hình ảnh các băng điện bi bằng phần mềm ệu suất tinh chế ần khi so sánh với giá trị này ở nhiệt độ ả trong mục 2.3.1.3 được ly ợc tiến hành đánh giá ảnh trên bản gel bằng ả trong mục 2.3.2.4 ến tính loại tạp ở 75 o C ến tính loại tạp ở 85 o C ảnh các băng điện bi bằng phần mềm

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ tinh khiết của ovalbumin

Nhiệt độ ( o C) 70 75 80 85 Độ tinh khiết(%) 91,03 91,78 94,28 100

Nhận xét: Sau khi loại tạp protein bằng bước biến tính nhiệt, các mẫu ovalbumin tinh chế đều có độ tinh khiết cao (trên 91%) Độ tinh khiết của ovalbumin tinh chế được tăng theo giá trị nhiệt sử dụng để biến tính, tuy nhiên để lựa chọn nhiệt độ biến tính thích hợp cần xem xét đến hiệu suất thu hồi ovalbumin

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ biến tính lên hiệu suất tách và độ tinh khiết của ovalbumin

Theo như hình 3.4: Độ tinh khiết của sản phẩm sau khi loại tạp bằng biến tính tại nhiệt độ 70 o C và 75 o C có sự khác nhau không nhiều (91,03% và 91,78%) tuy nhiên hiệu suất thu hồi ovalbumin giảm gần một nửa Ovalbumin có độ tinh khiết trên 94% sau khi biến tính ở nhiệt độ trên 80 o C nhưng lượng ovalbumin hao phí là quá lớn, đặc biệt sau khi biến tính ở 85 o C, mặc dù độ tinh khiết của

70 75 80 85 Độ ti nh khi ết (%)

Hiệu suất Độ tinh khiết ovalbumin tinh chế được là gần như 100% nhưng lượng ovalbumin thu hồi chỉ khoảng 16% lượng ovalbumin có trong nguyên liệu thô

Từ những kết quả trên trên, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ 70 o C để biến tính loại tạp và hoàn thiện quy trình tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng như hình 3.5: Điều chỉnh pH về 4,75 bằng dung dịch HCl 3M, để yên trong 2h

Ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút, nhiệt độ 25 o C trong 30 phút

Thu lấy dịch lỏng, thêm amoni sulfat và acid citric để có nồng độ tương ứng là 5% (w/v) và 2,5% (w/v), để qua đêm ở nhiệt độ 4 o C

Ly tâm 5000 vòng/phút, 25 o C trong 30 phút

Thu dịch lỏng, lọc qua màng lọc tiếp tuyến 30 kDa

Thu lấy phần dịch lỏng, biến tính ở nhiệt độ 70 o C trong 15 phút

Ly tâm 5000 vòng/phút, 25 o C trong 30 phút

Hình 3.5 Hoàn thiện quy trình tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng

Loại bỏ phần kết tủa là ovomucin

Loại bỏ phần kết tủa là ovotransferrin

Loại các tạp protein còn sót lại Thu lấy dịch lỏng ovalbumin Đông khô ovalbumin, bảo quản ở 4 o C

Loại muối, lysozyme và các protein trọng lượng phân tử thấp

Nâng cấp quy mô

Tiến hành tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng theo quy trình đã hoàn thiện, được mô tả trong hình 3.5 với khối lượng lòng trắng trứng ban đầu là 300g Định lượng ovalbumin trong sản phẩm đông khô theo phương pháp mô tả trong mục 2.3.2.2, đánh giá hiệu suất tinh chế theo phương pháp mô tả trong mục 2.3.2.3, đánh giá độ tinh khiết của ovalbumin tinh chế được theo phương pháp mô tả trong mục 2.3.2.4 Kết quả được thể hiện trong bảng 3.4:

Bảng 3.4 Hiệu suất tinh chế và độ tinh khiết của ovalbumin với quy mô tinh chế 300 g lòng trắng trứng

Khối lượng ovalbumin trong sản phẩm đông khô

Hiệu suất (%) Độ tinh khiết (%)

Nhận xét: Khi nâng cấp quy mô tinh chế với khối lượng nguyên liệu lòng trắng trứng ban đầu là 300g, hiệu suất tinh chế ovalbumin tăng từ 87,33% lên 88,45%, độ tinh khiết của ovalbumin thu được giảm từ 91,03% còn 89,67% Các giá trị này thay đổi nhưng không đáng kể

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

Sau quá trình nghiên cứu và làm thực nghiệm, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã thu được kết quả như sau:

- Tinh chế được ovalbumin từ lòng trắng trứng bằng phương pháp loại từng bước các protein có trong lòng trắng trứng

- Ovalbumin tinh chế được có độ tinh khiết tương đối cao (trên 89,67%) và hiệu suất quá trình tinh chế trên 87%

Do hạn chế về thời gian, kết quả của khóa luận chỉ mới bước đầu xây dựng được quy trình tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng, để đánh giá chính xác hơn hiệu quả của phương pháp, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đưa ra một số đề xuất như sau:

- Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình tối ưu tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng nhằm tăng độ tinh sạch của sản phẩm

- Tiếp tục xây dựng phương pháp đánh giá và định lượng ovalbumin có độ chính xác cao hơn bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Đồng thời, các protein khác như ovotransferrin, ovomucin và lysozym đều có tiềm năng cao sử dụng trong dược phẩm, các protein này hoàn toàn có thể được phân lập đồng thời cùng với ovalbumin Do đó, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đề xuất sử dụng phương pháp này để tinh chế kết hợp nhiều protein trong lòng trắng trứng nhằm mục đích sử dụng trong dược phẩm

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt:

1 Lê Ngọc Tú (2002), Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội

2 Abeyrathne E D., Lee H Y., Ahn D U (2013),"Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents - A review", Poultry Science, 92(12), 3292-3299

3 Abeyrathne E., Lee H Y., Ahn D U (2013), "Sequential separation of lysozyme, ovomucin, ovotransferrin, and ovalbumin fromm egg white",

4 Abeyrathne N., Lee H Y., Ahn D U (2013), "Sequential Separation of Lysozyme and Ovalbumin from Chicken Egg White", Korean Journal for Food Science of Animal Resources, 33(1), 501-507

5 Alleoni A C (2006)"Albumen protein and functional properties of gelation and foaming", Scientia Agricola, 63(3), 291-198

6 Babini G S., Livermore D M (2000), "Effect of conalbumin on the activity of Syn 2190, a 1,5 dihydroxy-4-pyridon monobactam inhibitor of AmpC beta-lactamase", Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 45, 105-

7 Burley R W., Vadehra D (1989), The Avian Egg, Chemistry and Biology, Wiley-Interscience, New York

8 Chick H., Martin C J (1913), "The Precipitation of egg albumin by ammonium sulfate A contribution to the theory of the “Salting Out” of proteins", Biochemical Journal, 7, 380-398

9 Cotterill O J., Geiger S., G (1977), "Egg product yield trends from shell eggs", Poultry Science, 56, 1027-1031

10 Datta D., Bhattacharjee S et al (2009), "Separation of ovalbumin from chicken egg white using two-stage ultrafiltration technique", Separation and Purification Technology, 66, 353-361

11 Desert C., Guérin-Dubiard C., Nau F., Val F., Val F., Mallard J (2001),

"Comparison of different electrophoretic separations of hen egg white proteins", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 4553–4561

12 Fang J., H.Ma M., Qiu N., Wu X (2011), "Analysis of the Low-Molecular Weight Protein Profile of Egg-White and its Changes during Early Chicken Embryological Development", Verlag der Zeitschrift für Naturforschung, 67c, 208-214

13 Geng F., Huang Q et al (2012), "Co-purification of chicken egg white proteins using polyethylene glycol precipitation and anion-exchange chromatography", Separation and Purification Technology, 96, 75-80

14 Hopkins F G (1900), "On the separation of a pure albumin from egg white", The Journal of Physiology, 25, 306-330

15 Hoppe A., Zeece M G (2010), "Examination of egg white proteins and effects of high pressure on select physical and functional properties",

16 Houpalahti R., Fandino R L., Anton M (2007), Egg White Compounds,

17 Hungtinton J., Stein P (2001), "Structure and properties of ovalbumin",

18 Kovacs-Nolan J., Phillips M., Mine Y (2005), "Review: Advances in the value of eggs and egg components for human health", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 8421-8434

19 Littlefield V D, Hills B (1937), Process of Preparing Dried Egg Albumin, United States Patent Office

20 Mann K., Mann M (2011), "In-depth analysis of the chicken egg white proteome using an LTQ Orbitrap Velos", Proteome Science, 9, 7

21 Mine Y (2002), "Recent advances in egg protein functionality in the food system", World’s Poultry ScienceJournal, 58, 31-39

22 Mine Y., Kovacs-Nolan J (2004), "Biologically Active Hen Egg Components In Human Health and Disease", Journal of Pourtry Science,

23 Mine Y., Kovacs-Nolan J (2006), "New insights in biologically active proteins and peptides derived from hen egg", World’s Poultry Science Association, 62, 87-97

24 Mine Y., Yang M (2008), "Recent advances in the understanding of egg allergens: Basic, industrial, and clinical perspectives", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56 (13), 4874

25 Nerli B., Espariz M., Picó G (2001), "Thermodynamic study of forces involved in bovine serum albumin and ovalbumin partitioning in aqueous two-phase systems", Biotechnology and Bioengineering, 72, 468-474

26 Ngarize S., Herman H., Adams A., Howell N (2004), "Comparison of changes in the secondary structure of unheated, heated, and high-pressure- treated ss-lactoglobulin and ovalbumin proteins using Fourier transform Raman spectroscopy and self-deconvolution", Journal of Agricultural and Food, 52 (21), 6470-6477

27 Osward N., Kennedy S., Hogan M., Cartwright M (2012), 10 Things Every

Molecular Biologist Should Know, Science Square Ltd, Edinburgh

28 Pereira M., Cruz R A., Almeida M R., Lima A S., Coutinho A., Freire M

G (2016), "Single-Step Purification of Ovalbumin from Egg White Using Aqueous Biphasic Systems", Process Biochemistr, 16, 1-47

29 Radziejewska R C., Lesnierowski G., Kijowski J (2008), "Properties and application of egg white lysozyme and its modified preparations-A review",

Polish Journal of Food and Nutrition Sciences, 58, 5-10

30 Saravana S., Rao I., Nair B., Ramasami T (2008), "Aqueous two-phase poly(ethylene glycol)–poly(acrylic acid) system for protein partitioning:

Influence of molecular weight, pH and temperature", Process Biochemistry,

31 Sethi A., Sher M., et al (2013), "Albumin as a drug deliver and diagnostic tool and its market approved products", Acta Poloniae Pharmaceutical Drug Research, 70 (4), 597-600

32 Stoscheck C M (1990), Guide to Pretein Purification, Academic Press

33 Valenti P., Antonini G., Fanelli M R., et al (1982), "Antibacterial activity of matrix-bound ovotransferrin", Antimicrobial Agents and Chemotherapy,

34 Watkins B (1995), Egg Science and Technology, CRC Press, New York

35 Zhi W-B., Deng Q.-Y., Song J.-N., Quyang F (2005), "Purification of ovalbumin from hen egg white by high-speed counter-current aqueous two- phase chromatography", Chinese Journal of Biotechnology, 21, 129-134.