LUẬN văn THẠC sĩ đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số trong rau đắng biển (bacopa monnieri) thu hái tại viêt nam bằng phương pháp HPLC

TỔNG QUAN

Tổng quan về cây Rau đắng biển

Vị trí phân loại của loài Bacopa monnieri trong hệ thống phân loại thực vật học:

Họ: Hoa Mõm Chó (Scrophulariaceae);

Rau đắng biển có tên khoa học là Bacopa monnieri (L.) Pennell., thuộc họ Hoa mõm chó (Scrophulariaccae), chi Rau đắng biển (Bacopa), có tên khoa học đồng nghĩa khác là Herpestis monnieri (L.) Rothm Ở Việt Nam, Rau đắng biển còn được gọi là rau Sam trắng, Sam trắng [1, 10]

Cây thảo, sống lâu năm, cao 10-20 cm Thân nhẵn, phần gốc mọc bò, bén rễ ở những mấu, phần trên mọc đứng Thân có vị đắng Lá mọc đối, không cuống, hình trái xoan, mọng nước, dài 0,8-1,2 cm, rộng 3-5 mm, gốc thuôn, đầu tù, hai mặt nhẵn

Lá có màu xanh đậm ở trên mặt, xanh nhạt ở mặt dưới, một gân chính, gân phụ không rõ Hoa màu trắng, mọc đơn độc ở kẽ lá trên một cuống dài Hoa không đều, lưỡng tính mẫu 5 Cuống hoa dài 2,6-5,6 cm, không lông, hai lá bắc con hình dải, dài 0,6 cm, ở đỉnh cuống hoa Bao hoa: năm lá đài rời, không đều, lá đài sau to nhất, hình trứng, có năm gân chính, dài 0,8 cm, rộng 0,5 cm, hai lá đài trước hình trứng, mũi nhọn, 3 gân chính, dài 0,7 cm, rộng 0,4 cm, hai lá đài bên nhỏ nhất, hình dải, 1 gân, có lông ở bìa, dài 0,6 cm, rộng 0,1 cm Năm lá đài không đều, cao 5-6 mm, năm cánh hoa có màu tím nhạt, dính nhau ở thành ống Bốn nhị, bầu không lông Quả nang hình trứng, nhẵn, có đài còn lại, hạt nhỏ, có góc cạnh Hạt nhiều, rất nhỏ, mùa hoa tháng 4-9 [6, 8, 10]

Hình 1.1 Hình ảnh cây và hoa Rau đắng biển [42, 43]

Chi Bacopa tương đối lớn, có khoảng 70 loài, phân bố rải rác khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới; song tập trung nhiều ở khu vực Trung và Nam Mỹ Ở Việt Nam chỉ có 2 loài Loài Rau đắng biển được coi là cây liên nhiệt đới, đồng thời cũng có thể thấy vùng cận nhiệt đới Ở châu Á, rau đắng biển phân bố rộng rãi từ vùng Nam Trung Quốc, Việt Nam, Lào đến các nước khác ở Đông Nam Á Ở Việt Nam, Rau đắng biển phân bố ở khắp các vùng đồng bằng và trung du miền Bắc và miền Nam Cây ưa sáng, thường mọc trên đất ẩm, pha cát lẫn với các loại cỏ thấp ở bờ ruộng, bãi sông, bờ kênh mương, Cây ra hoa quả nhiều năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt Cây còn có khả năng mọc chồi khỏe từ kẽ lá, kể cả phần còn sót lại sau khi cắt Do đó, Rau đắng biển cũng bị coi là loại cỏ dại ảnh hưởng tới cây trồng [10]

Dược liệu Rau đắng biển là phần trên mặt đất dùng tươi hoặc phơi khô của cây Rau đắng biển [8, 10]

Thành phần hóa học chính có tác dụng dược lý của Bacopa monnieri là các triterpen glycosid, sterol, sterol glycosid, các phenylethan glycosid, cucurbitacin, alkaloid và flavonoid [10, 15] Trong đó thành phần quan trọng là các hợp chất thuộc nhóm saponin và các saponin trong Bacopa monnieri được xác định là các triterpen glycosid nhóm dammaran (bacosids)

Thành phần hóa học chính có hoạt tính trong B.monnieri là các hợp chất triterpen glycosid có cấu trúc nhân dammaran (bacosids) với aglycon là jujubogenin và pseudojujubogenin [21] ( Bảng 1.1 và 1.2) Cấu trúc của các saponin này khác nhau về phần đường

Những saponin quan trọng bao gồm: bacosid A1, bacosid A2, bacosid A3[24,

34, 35], các bacopasaponin A-D [18, 20, 30, 31], các bacosaponin E và F [31], bacopasaponin G [20], bacopasaponin I và II [18], bacopasaponin III-V [17, 18, 20], bacopasaponin VI-VIII [41], bacopasaid N1, bacopasid N2 và bacopasid X [21]

Trong các saponin này, các bacopasaponin A, E, F và bacopasid VIII là các jujubogenin bisdesmosid [29] Hơn nữa, hai triterpen glycosid nhóm drammaran được acyl hóa là bacomosaponin A và bacomosaponin B cũng đã được phân lập bằng kỹ thuật quang phổ [15]

Trong những năm đầu nghiên cứu về B.monnieri, thành phần hóa học đầu tiên trong B.monnieri được xác định là 3-(α-L-arabinopyranosyl)-O-β-D-glucopyranosid- 10,20-dihydroxy-16-keto-dammar-24-en thường được gọi là bacoside A đã được phân lập và được coi là thành phần có tác dụng lên hệ thần kinh giúp tăng cường trí nhớ Sau đó, vào cùng thời điểm, người ta đã xác định bacosid B chỉ khác bacosid A ở góc quay quang học [15]

Tuy nhiên các nghiên cứu tiếp theo đã chỉ ra rằng bacosid A và bacosid B không phải là những hợp chất hóa học đơn lẻ, mà chúng được chứng minh là các hỗn hợp của triterpen glycosid Nghiên cứu gần đây cho thấy bacosid A là hỗn hợp của bốn triglycosidic saponin: bacosid A3, bacosid II, 𝛼-L-arabinofuranosyl-(1→2)-(β- D-glucopyranosyl-(1→3)- 𝛼-L-arabinofuranosyl] jujubogenin (còn gọi là bacopasid X) và bacopasaponin C [21] và bacosid B là một hỗn hợp của bacopasid N1, bacopasid N2, bacopasid IV và bacopasid V

Bảng 1.1: Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là jujubogenin trong rau đắng biển [41]

Bảng 1.2: Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là pseudojujubogenin trong rau đắng biển [41]

Phần trên mặt đất của B.monnieri sau khi được chiết bằng methanol 50%, cô đặc và để qua đêm Lấy phần dịch chiết đi lọc và phân đoạn liên tiếp với Ethyl Acetat (EtOAc) và n-Butanol (n-BuOH) Chiết xuất EtOAc đã được phân tích bằng sắc ký silicagel để thu được các cucurbitacin: cucurbitacin A-D, cucurbitacin E và ba phenylethanoid glycosid gồm: monnierasid I, III và plantiosid B [28]

Bảng 1.3: Cấu trúc một số hợp chất cucurbitacin [28]

Ngoài các thành phần đã được phân lập và xác định cấu trúc đã nêu trên, có nhiều nghiên cứu xác định được thành phần flavonoid trong rau đắng biển là luteolin và apigenin [14] Một nghiên cứu được thực hiện bởi Anju Varshney và các cộng sự, tiến hành định lượng Luteolin trong các bộ phận khác nhau ở phần trên mặt đất của rau đắng biển thu hái ở các vùng của Ấn Độ bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và thu được kết quả hàm lượng Luteolin tại thân của B monnieri tại vùng Chembur, Mumbai là 0,0940 ± 0,0047 mg/ 500g; trong khi hàm lượng Luteolin trong lá B monnieri thu hái tại cùng Bhayander, Maharashtra là 0,01691 ± 0,0024 mg/ 500g

[12] Ngoài ra, một nghiên cứu khác cũng định lượng hàm lượng Luteolin và Apigenin ở các phần trên mặt đất trong dịch chiết Methanol (MeOH) của B monnieri bằng sắc ký lỏng pha đảo lần lượt là 0,22% và 0,45% [11]

Hình 1.2 Cấu trúc của Luteolin và Apigenin

Ngoài các triterpen glycosid đã được phân lập và xác định cấu trúc, một số thành phần hóa học khác cũng được tìm thấy trong rau đắng biển Thành phần đầu tiên được phân lập và xác định trong monnieri là alkaloid brahmi Sau đó, các alkaloid tiếp theo cũng được xác định là nicotin, herpestin [16] Tiếp theo, hàng loạt các báo cáo phân lập được các glycosid: asiaticosid và thanakunicid [19]

1.1.6 Một số tác dụng dược lý

Rau đắng biển là một loại thảo dược lâu năm được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền như một loại thuốc bổ thần kinh để cải thiện trí thông minh và trí nhớ, tăng cường chức năng não và giúp gia tăng tuổi thọ Theo y thuật Ayurveda, một hệ thống y học được phát triển tại Ấn Độ cách đây hơn 3000 năm, Rau đắng biển đã được sử dụng lần đầu tiên để bảo vệ thần kinh chống lại chứng mấy trí nhớ

Trong suốt bốn thập kỉ qua, Rau đắng biển và các hợp chất được phân lập từ nó ngày càng thu hút rất nhiều các nhà nghiên cứu hóa sinh vì các tác dụng dược lý bảo vệ thần kinh đáng chú ý đã được xác định như: tác dụng chống lại chứng mất trí nhớ, bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer; chống trầm cảm, lo âu; chống co giật và chống oxy hóa, [29] Ngoài ra, nhiều nghiên cứu về dược lý cũng chỉ ra rằng, B.monnieri mang nhiều tác dụng khác như tác dụng chống viêm, chống vi khuẩn Helicobacter

Pylori, thuốc chống giun, chống ung thư, an thần và làm ổn định hoạt động của các tế bào mast, [8, 15]

1.1.6.1 Tác dụng cải thiện trí nhớ và khả năng nhận thức, học hỏi

Những nghiên cứu trong dịch chiết cồn của các hợp chất được phân lập từ

Tổng quan về phương pháp HPLC

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào yếu tố đó Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được detector phát hiện và chuyển qua bộ phận xử lý số liệu Thời gian chất phân tích được rửa giải được ghi lại nhờ detector gọi là thời gian lưu Thời gian lưu phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích và thành phần của pha động và pha tĩnh [3, 4, 23]

Trong HPLC, pha tĩnh là các hợp chất được gắn lên chất mang thường là các hạt hình cầu có đường kính 1,5 – 10 μm, có nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích

Pha tĩnh có độ phân cực khác nhau, dựa vào độ phân cực của pha tĩnh mà người ta phân ra hai loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo

- Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực (các silica có chứa nhóm alkyl ít cacbon mang nhóm chức phân cực –CN, -NH2, ), pha động không phân cực

- Sắc ký pha đảo: pha tĩnh không phân cực (các silica gắn mạch cacbon dài C18, C8, ), pha động phân cực

Pha động trong HPLC là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột sắc ký Trong sắc ký pha thuận, pha động là các dung môi ít phân cực như hexan, isopropylether, ngược lại trong sắc ký pha đảo, pha động là các dung môi phân cực như nước, methanol, acetonitril,

Nguyên tắc cấu tạo của một bộ máy sắc ký lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận kết nối với nhau [2, 3, 4, 23]

- Hệ thống cấp pha động;

- Đầu dò detector (nhận tín hiệu);

- Bộ phận thu nhận và xử lý số liệu

Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao [15]

1.2.2.1 Hệ thống cấp pha động

Tất cả các dung môi trong pha động dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân tích và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích nhằm mục đích tránh làm hỏng sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra píc tạp trong quá trình phân tích

Pha động trước khi đưa vào bình chứa pha động cần được lọc qua màng lọc 0,45μm và loại bỏ khí hòa tan trong pha động (ví dụ: N2, O2) bằng cách: rung siêu âm, sục khí trơ Heli có khả năng hòa tan thấp trong pha động Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ xảy ra:

- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của píc thay đổi

- Trong trường hợp bọt quá nhiêu, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể bơm sẽ không hút được dung môi khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động

Trong bất kì trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai

Hệ thống bơm sắc ký lỏng phải giữ cho pha động luôn luôn chảy với một lưu lượng không đổi Ống dẫn và hệ thống nối phải là loại chịu được áp suất sinh ra do hệ thống bơm Máy sắc ký lỏng hiện nay thường có áp suất tối đa 412 bar (407atm), tốc độ dòng từ 0,1-9,999 ml/phút Hệ thống được điều khiển bằng bộ vi xử lý có khả năng cung cấp hai chế độ vận hành của pha động bao gồm:

- Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký

- Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2-4 loại dung môi được đặt trong các bình khác nhau Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình chạy sắc ký theo chương trình đã định trước (chương trình dung môi) nhờ bộ trộn

Tốc độ dòng pha động có thể thay đổi theo áp suất của bơm

Mẫu được tiêm thẳng vào pha động ở ngay đầu cột với áp suất cao nhờ sự điều chỉnh dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu cho phép thể tích tiêm từ 5 μL - 100μL Có hai cách tiêm mẫu vào cột là tiêm mẫu bắng tay hoặc tiêm mẫu tự động

Khi tiêm bằng tay có thể gây sai số do thể tích tiêm vào vòng chứa mẫu không đủ

Một máy HPLC bình thường có hai cột : cột phân tích và cột bảo vệ

Hiện nay, cột pha tĩnh thường được làm bằng thép không gỉ, ngoài ra còn có cột bằng thủy tinh hoặc chất dẻo Chiều dài cột khoảng 10-30 cm, đường kính trong cột 1-10 mm, hạt nhồi cột cỡ 5-10 μm, Ngoài ra còn một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt Lò cột giúp đảm bảo nhiệt độ ổn định cho cột

Chất nhồi cột: đường kính 1,8-5 μm có thể dùng cột ngắn 3-10 cm và nhỏ (đường kính trong 1 – 4,6 mm) loại cột này có hiệu năng tách cao Chất nhồi cột tùy theo loại cột và kiểu sắc ký Thông thường chất nhồi cột là silicagel (pha thường) hoặc là silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm oxid, polyme xốp, chất trao đổi ion

Cột được nhồi các hạt nhồi cột và pha tĩnh tương tự như cột phân tích, nhưng ngắn hơn và rẻ hơn, dài 7,5 mm và giá chỉ bằng 1/10 cột phân tích thông thường; đặt trước cột sắc kí để loại bỏ bớt tạp và gia tăng tuổi thọ của cột phân tích

- Đầu dò là một bộ phận phát hiện chất phân tích khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo bản chất của chất phân tích mà sử dụng detector phù hợp Một số loại detector hiện đang được sử dụng:

- Detector quang phổ tử ngoại từ 200 đến 380 nm

- Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV/VIS) từ 190 đến 900 nm, áp dụng cho những chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại hoặc khả kiến

Những nghiên cứu về định lượng hàm lượng triterpen glycosid tổng số trong

Triterpen glycosid là thành phần chính và đã được nhiều nghiên cứu chứng minh tạo lên tác dụng trên hệ thần kinh của Rau đắng biển nên những hợp chất triterpen glycosid thường được lựa chọn làm chất đánh dấu hóa học trong tiêu chuẩn hóa dược liệu Rau đắng biển Hầu hết các nghiên cứu trên thế giới đều sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng các bacosid trong Rau đắng biển Một số chương trình chạy sắc ký trong các tài liệu tham khảo được tổng kết như bảng 1.4

Bảng 1.4 Một số phương pháp định lượng triterpen glycosid trong Rau đắng biển

Dung môi chiết Điều kiện sắc ký TLTK

Chiết hồi lưu cách thủy

+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm), kích thước hạt: 5àm

+ Pha động: ACN : TFA 0,1% (35:65, tt/tt) + Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

+ Thể tớch tiờm mẫu: 20àL + Detector: PDA (205 nm)

2 HPLC-DAD Siêu âm Methanol

+ Cột: Luna RP-18 (150 mm x 4,6 mm), kích thước hạt: 5àm + Cột bảo vệ: Phenomenex RP-18

+ Pha động: ACN : H3PO4 0.2% (35:65, tt/tt), điều chỉnh pH đến 3,0 bằng NaOH 5M

+ Thể tớch tiờm: 20àL + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Detector: PDA (205 nm)

+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5àm) + Pha động: ACN : Na2SO4 0,05M (pH= 2,3) (31,5 : 68,5, tt/tt) + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

+ Nhiệt đô cột: 30 o C + Thể tớch tiờm: 20àL + Bước sóng phát hiện: 205 nm

+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5àm)

+ Pha động đẳng dòng (isocratic): ACN : Na2SO4 (từ Na2SO4 khan 0,71%, kl/tt) (315 : 685, tt/tt), điều chỉnh về pH = 2,3 bằng acid sulfuric

+ Dung môi pha mẫu: MeOH 70%

+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Nhiệt độ cột: 30 o C

+ Thể tớch tiờm mẫu: 20àL + Bước sóng phát hiện: 205 nm

- Kết quả: Tỷ lệ thời gian lưu của các thành phần hóa học chính trong rau đắng biển: Bacopasid I, Bacosid A3, Bacopasid X và Bacopasaponin C so với Bacopasid II lần lượt là: 1,4; 0,9; 1,2;

+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5àm)

+ Pha động (Gradient): ACN : đệm phosphat (từ KH2PO4 khan và H3PO4, pH = 2,3) + Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút + Nhiệt độ cột: 27 o C

+ Thể tớch tiờm mẫu: 20àL

- Kết quả: Tỷ lệ thời gian lưu của các thành phần hóa học chính trong rau đắng biển: Bacopasid I, bacopasid II, bacopasid X và bacopasaponin C so với bacosid A3 lần lượt là: 0,73; 1,04;

Nhận xét: Đối tượng nghiên cứu của tất cả các tài liệu tham khảo đều là Rau đắng biển được rửa sạch, sấy khô và nghiền thành bột Các chương trình sắc ký đều sử dụng thành phần pha động chính là ACN cùng một dung dịch đệm nhất định có pH vùng acid, và chủ yếu chạy với chế đồ đẳng dòng pha động (isocratic) Các điều kiện sắc ký trong các tài liệu tham khảo hầu hết đều sử dụng cột sắc ký pha đảo C18, thể tớch tiờm mẫu 20 àL, tốc độ dũng 1,0 – 1,5 ml/phút và bước súng phỏt hiện là 205 nm Trong Dược điển Anh [15], và USP 40 – NF35 [18], hàm lượng bacosid tổng số được tính là tổng hàm lượng bacopasid I, bacosid A3, bacopasid II, đồng phân isomer jujubogenin của bacopasaponin C (bacopasid X) và bacopasaponin C tính theo bacosid A3 Trong nghiên cứu này chúng tôi sẽ tiến hành định lượng triterpen glycosid tổng số tham khảo theo USP 40 – NF35.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là mẫu dược liệu Rau đắng biển được thu hái ở vùng một số tỉnh tại Việt Nam Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học bởi Khoa Tài nguyên dược liệu, Viện Dược Liệu Sau đó được gửi về Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu để tiến hành đánh xây dựng phương pháp và đánh giá chất lượng Dược liệu tươi sau đó được sấy khô ở 55 o C, bảo quản trong túi bóng kín ở nơi khô ráo thoáng mát

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu dược liệu Rau đắng biển thu thập

TT Ký hiệu Tên Việt

Tên khoa học Họ thực vật Nơi lấy Ngày lấy

Nhật Lệ, Đồng Hới, Quảng Bình

Quảng Thành, TP Thanh Hóa

Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị

- Các chất chuẩn chuẩn bacopasid I (CAS: 382148-47-2, LOT: PRF9012222), bacosid A3 (CAS: 157408-08-7, LOT: PRF9212143), bacopasid II (CAS: 382146- 66-9, LOT: PRF8062301), bacopasid X (CAS: 94443-88-6, LOT PRF9162411) và bacopasaponin C (CAS: 178064-13-6, LOT: PRF8062302) được cung cấp bởi hãng Biopurify Phytochemicals Ltd với độ tinh khiết trên 98%

- Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (methanol, acetonitril) của hãng Merck

- Các dung môi, hoá chất dùng để xử lý mẫu methanol, ethanol mua của Trung Quốc và đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A.)

- Nước cất sử dụng là nước cất hai lần đã được deion hoá

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Shimadzu bao gồm: Hệ bơm binary LC-30AD, detector SPD-M20A DAD, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-30AC, bộ phận ổn nhiệt CTO-10AS của Shimadzu Phần mềm điều khiển Labsolution

- Cột sắc ký Zobax Eclip XDB C18 (250 x 4,6mm, 5àm) của Agilent

- Bếp cách thủy (Memmert, WB – 14 LO)

- Cân phân tích (Precisa XT 220A), độ chính xác 0,00001 g

- Cân kỹ thuật điện tử (Ohaus) độ chính xác 0,01 g

- Cân xác định độ ẩm (Sartorius, MA – 45)

- Các dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc bacosid A3: Cân chính xác 10 mg chuẩn bacosid A3, hòa tan và định mức trong bình định mức 5 mL bằng methanol thu được dung dịch chuẩn gốc bacosid A3 có nồng độ khoảng 2 mg/ml

- Các dung dịch chuẩn bacopasid I, bacopasid II, bacopasid X và bacopasaponin C có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml trong methanol được sử dụng để xác định vị trí các píc bacopasid I, bacopasid II, bacopasid X và bacopasaponin C trong mẫu thử

Các dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở nhiệt độ 4 o C, sử dụng ổn định trong 02 tháng

2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng bacosid tổng số trong Rau đắng biển 2.3.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

- Khảo sát chương trình pha động: Tiến hành khảo sát chương trỉnh rửa giải gradient với pha động gồm acetonitril (kênh B) phối hợp với nước (kênh A) theo các tỉ lệ khác nhau

Các kết quả thu được với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), và hệ số đối xứng (AS) RS ≥ 1,5; AS nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 (tối ưu xấp xỉ bằng 1); tR của các chất phân tích không quá dài nhưng phải đảm bảo tách xa nhau

Tiến hành sắc ký dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn bacosid A3 trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ghép nối với detector DAD (Shimadzu) để khảo sát điều kiện sắc ký

Sau khi khảo sát các điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phương pháp định lượng bacosid tổng số (tính theo bacosid A3) trong Rau đắng biển bằng HPLC theo hướng dẫn của AOAC a Độ thích hợp hệ thống

Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị ở trên Ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích píc Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích Yêu cầu các giá trị thời gian lưu, diện tích píc có RSD ≤ 2% b Độ chọn lọc của phương pháp:

- Tính chọn lọc của phương pháp: Là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác

Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, tính chọn lọc thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng, píc của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các píc tạp Trên sắc ký đồ mẫu trắng phải không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn

Tiến hành chạy sắc ký dung dịch chuẩn bacosid A3, dung dịch thử Rau đắng biển và mẫu trắng methanol với chương trình đã lựa chọn Ghi lại các thông số thời gian lưu và diện tích píc

Thời gian lưu píc bacosid A3 của dung dịch chuẩn, dung dịch thử Rau đắng biển phải tương đương nhau Píc trong mẫu thử phải tách hoàn toàn với các píc khác trong nền mẫu Hệ số chồng phổ của mẫu thử và mẫu chuẩn phải lớn hơn 0,99 c Khoảng tuyến tính

- Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đo được và nồng độ chất phân tích

Tiến hành sắc kí các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu đo được và nồng độ Vẽ đồ thị thuộc giữa tín hiệu và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất)

- Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ các chất phân tích Đánh giá đường chuẩn dựa vào giá trị R 2 và độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn (Δ) Yêu cầu: 0,99 ≤ R 2 ≤ 1 d Độ lặp lại

KẾT QUẢ

Thẩm định phương pháp phân tích

3.2.1 Tính thích hợp hệ thống

Tính thích hợp của hệ thống được đánh giá theo phương pháp như đã trình bày ở trên Kết quả được đánh giá thông qua giá trị RSD (%) của diện tích píc và thời gian lưu sau 6 lần phân tích lặp lại cùng một mẫu chuẩn bacosid A3 có nồng độ 0,42 mg/ml Kết quả được trình bày trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống

RSD(%) 0,05 0,75 Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích píc và thời gian lưu đều nhỏ hơn 2 %, cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC sử dụng là phù hợp và đảm bảo độ ổn định của phép phân tích định lượng bacosid tổng số trong Rau đắng biển

3.2.2 Tính chọn lọc của phương pháp

Tiến hành phân tích 3 mẫu: dung dịch bacosid A3 chuẩn, dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng methanol với điều kiện phân tích HPLC đã trình bày ở trên, thu được kết quả đánh giá bằng các sắc ký đồ tương ứng như hình sau:

Hình 3.3 Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc của phương pháp

Hình 3.4 So sánh phổ UV của bacosid A3 trong mẫu thử và mẫu chuẩn

Thời gian lưu của píc bacosid A3 trên sắc ký đồ mẫu Rau đắng biển tương tự như thời gian lưu của các píc chuẩn tương ứng trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn Bên cạnh đó, trên sắc ký đồ mẫu thử píc bacopasid I, bacosid A3, bacopasid II, jujubogenin isomer của bacopasaponin C và bacopasaponin được tách hoàn toàn khỏi các píc khác Hệ số chồng phổ của bacosid A3 của mẫu thử so với mẫu chuẩn lớn hơn 0,99 Như vậy, phương pháp đủ đặc hiệu để định lượng bacosid tổng số trong Rau đắng biển

3.2.3 Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

Chuẩn bị một dãy gồm dung dịch chuẩn bacosid A3 có nồng độ tăng dần từ 0,21 mg/ml đến 1,68 mg/ml rồi tiến hành phân tích HPLC với các điều kiện như đã trình bày ở trên Kết quả xác định được khoảng tuyến tính từ 0,21 mg/ml đến 1,68

249 223 mg/ml và phương trình hồi quy tuyến tính y = 2369732,91x + 30580,47 với hệ số tương quan R 2 = 0,9998

Bảng 3.4 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích của píc bacosid A3

Nồng độ (mg/ml)

Tiến hành: Cân chính xác khoảng 2,5 g dược liệu Xử lý mẫu theo quy trình đã trình bày ở trên để thu được dung dịch tiêm sắc ký Tiến hành làm lặp lại 6 lần trên cùng một mẫu dược liệu Kết quả được trình bày trong bảng 3.5

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại

TT m dược liệu (g) Hàm lượng (%)bacosid tổng (tính theo bacosid A3)

Hàm lượng trung bình của bacosid (tính theo bacosid A3) trong mẫu dược liệu Rau đắng biển là 3,30% (tính theo khối lượng dược liệu khô tuyệt đối), với độ lệch chuẩn tương đối RSD = 1,44% < 1,5% cho thấy phương pháp xây dựng có độ lặp lại cao

Mẫu thêm chuẩn: Cân chính xác khoảng 2,5 bột dược liệu và thêm một lượng bacosid A3 chuẩn, quá trình thêm chuẩn được tiến chuẩn bị ở 3 mức: 5 mg, 10 mg và

15 mg Sau đó, tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã trình bày ở trên

Mẫu không thêm chuẩn: cân chính xác khoảng 2,5 g bột dược liệu và tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã trình bày ở trên Định lượng bacosid trong mẫu thêm chuẩn và mẫu không thêm chuẩn bằng HPLC, mỗi mức thêm chuẩn được làm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình Kết quả được trình bày trong bảng 3.6

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp

Nồng độ thực (mg/ml)

Nồng độ thêm chuẩn (mg/ml)

Nồng độ mẫu thêm chuẩn (mg/ml)

Nồng độ thêm chuẩn tìm lại (mg/ml) Độ thu hồi (%)

2,5002 25,002 0,891 0,150 99,9 Độ thu hồi trung bình của phương pháp định lượng bacosid tổng số trong dược liệu Rau đắng biển bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC đạt trong khoảng 95-102%, chứng tỏ phương pháp đã xây dựng có độ đúng cao.

Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (Tính

Áp dụng phương pháp đã xây dựng, tiến hành đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (Tính theo bacosid A3) trong Rau đắng biển thu hái tại một số tính ở Việt Nam Mỗi mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần độc lập Kết quả như sau:

Bảng 3.7 Hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) trong dược liệu Rau đắng biển thu hái tại Việt Nam

TT Ký hiệu Nơi lấy Ngày lấy

Hàm lượng (%)bacosid tổng số (tính theo bacosid

1 RĐB1 Thái Thụy, Thái Bình 10-6-2019 3,22 ± 0,01

2 RĐB2 Tiền Hải, Thái Bình 07-07-2019 3,25 ± 0,01

3 RĐB3a Giao Thủy, Nam Định 07-09-2019 2,53 ± 0,01

4 RĐB3b Giao Thủy, Nam Định 07-09-2019 3,04 ± 0,03

7 RĐB5a Cửa Tùng, Quảng Trị 07-11-2019 3,16 ± 0,02

8 RĐB5b Cửa Tùng, Quảng Trị 07-11-2019 3,15 ± 0,02

9 RĐB6a Nhật Lệ, Đồng Hới,

10 RĐB6b Nhật Lệ, Đồng Hới,

11 RĐB7a Bố Trạch, Quảng Bình 13-07-2019 2,04 ± 0,04

12 RĐB8a Quỳnh Lưu, Nghệ An 13-07-2019 2,47 ± 0,06

13 RĐB8b Hoàng Mai, Nghệ An 13-07-2019 1,89 ± 0,01

16 RDB10a Nga Sơn, Thanh Hóa 7-2019 3,17 ± 0,01

18 RDB10c Tĩnh Gia, Thanh Hóa 7-2019 3,53 ± 0,05

Nhận xét : Kết quả thu được cho thấy hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) trong các mẫu Rau đắng biển nằm trong khoảng từ 1,89 – 5,74%

Trong đó, mẫu Rau đắng biển thu tại Thanh Hóa cho hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) cao nhất (5,74 ± 0,03) Kết quả thu được góp phần vào đánh giá chất lượng dược liệu Rau đắng biển tại Việt Nam.

BÀN LUẬN

Về thu thập mẫu dược liệu

Rau đắng biển (Bacopa monnieri) là một loại thảo dược vị đắng, tính mát Từ lâu, loài cây này đã được sử dụng rất phổ biến trong đời sống của con người như dùng làm rau ăn hoặc dùng làm thuốc trong y học cổ truyền Ấn Độ từ 3000 năm trước, có tác dụng bảo vệ trí nhớ, bổ thần kinh, tăng cường nhận thức và chống oxy hóa

Các kết quả điều tra đến nay cho thấy Rau đắng biển phân bố phổ biến ở Việt Nam ở độ cao đến 500m so với mực nước biển, tuy nhiên tập chung nhiều ở các tỉnh của Việt Nam: Thái Bình, Nam Định, Hải Phòng, Quảng Ninh, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Bình, Quảng Trị, Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Tây Ninh, Đồng Nai, TP Hồ Chí Minh, Vĩnh Long, Cần Thơ, Cà Mau, Đồng Tháp, Hậu Giang, An Giang Tuy nhiên, hiện nay Dược điển Việt Nam chưa có chuyên luận Rau đắng biển Phương pháp định lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) đã được đề xuất trong nhiều chuyên luận của dược điển Mỹ, Anh, tuy nhiên chưa có nghiên cứu đánh giá nào trên đối đượng Rau đắng biển tại Việt Nam Nghiên cứu này góp phần vào công tác tiêu chuẩn hóa dược liệu Rau đắng biển tại Việt Nam

Nhóm thực hiện đề tài đã tiến hành thu thập mẫu Rau đắng biển tại các tỉnh ở cả ba miền Bắc Trung Nam như Thái Bình, Nam Định, Thanh Hóa, Nghệ An, Huế, Quảng Trị, Quảng Bình, Kiền Giang và vẫn đang tiếp tục thu thêm mẫu để đánh giá chất lượng dược liệu Rau đắng biển ở Việt Nam

4.2 Về xây dựng phương pháp định lượng

Hiện tại, Dược điển Mỹ cũng như Dược điển Anh đã có chuyên luận cho dược liệu Rau đắng biển, trong đó đã có tiêu chí đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) bằng phương pháp HPLC Tuy nhiên, có một khó khăn thực tế khi áp dụng phương pháp này là thời gian lưu của các bacosid bị ảnh hưởng nhiều khi thay đổi các cột sắc ký khác nhau Để có thể áp dụng được phương pháp theo điều kiện cơ sở phòng thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành chạy chuẩn đơn của bacopasid I, bacosid A3, bacopasid II, đồng phân isomer jujubogenin của bacopasaponin C (bacopasid X) và bacopasaponin C để xác định thời gian lưu cũng như thời gian lưu tương đối của các bacosid so với bacosid A3 Sau khi xác định được các thông số này, chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp theo các tiêu chí đánh giá của AOAC, kết quả thu được cho thấy phương pháp đạt yêu cầu của AOAC

4.3 Về kết quả định lượng triterpen glycosid tổng số trong các mẫu Rau đắng biển

Trong nghiên cứu này chúng tôi đã định lượng hàm lượng triterpen glycosid trong 23 mẫu dược liệu Rau đắng biển (Bacopa monnieri) thu hái tại Việt Nam bằng phương pháp HPLC Kết quả thu được cho thấy hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) trong các mẫu Rau đắng biển nằm trong khoảng từ 1,89 – 5,74% Trong đó, mẫu Rau đắng biển thu tại Thanh Hóa cho hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) cao nhất (5,74 ± 0,03)

So sánh với một nghiên cứu khác của tác giả Trần Trung Nghĩa và các cộng sự (2017), kết quả hàm lượng triterpen glycosid trong một số mẫu Rau đắng biển nằm trong khoảng 1,71 – 4,45%, mẫu có hàm lượng triterpen glycosid cao nhất là mẫu Rau đắng biển được nhân giống và trồng tại Thanh Hóa [9] Hàm lượng triterpen glycosid tổng trong nghiên cứu này không có sự chênh lệch nhiều so với khoảng hàm lượng triterpen glycosid tổng trong nghiên cứu của chúng tôi Ngoài ra, các kết quả cũng đều cho thấy rằng Rau đắng biển được thu từ nhiều địa phương khác nhau có hàm lượng tritepen glycosid là khác nhau và vùng trồng mang hàm lượng cao nhất tại Thanh Hóa

Trong khi đó tiêu chuẩn nguyên liệu Rau đắng biển được quy định trong Dược điển Mỹ chỉ là 2,5% bacosid [37] Các kết quả này cho thấy nguồn nguyên liệu Rau đắng biển của Việt Nam có chất lượng tốt thể hiện ở hàm lượng triterpen glycosid cao, nhiều hứa hẹn dùng làm nguyên liệu phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận

Qua quá trình thực hiện đề tài, các mục tiêu đặt ra đã hoàn thành, cụ thể như sau:

1 Đã xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) trong dược liệu Rau đắng biển với điều kiện như sau: Điều kiện sắc ký:

+ Cột: Zobax Eclip XDB C18 (250 x 4,6mm, 5àm)

+ Pha động (Gradient): ACN : đệm phosphat (từ KH2PO4 khan và H3PO4, pH = 2,3)

+ Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

+ Thể tớch tiờm mẫu: 20 àL

Thời gian (phút) % Kênh A % Kênh B

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 2,5 g dược liệu đã xay nhỏ vào bình cầu có dung tích 100 ml Thêm chính xác 25 ml dung dịch methanol Chiết hồi lưu cách thủy trong 10 phút Để nguội về nhiệt độ phòng và gạn lấy lớp dịch Tiếp tục chiết đến khi dịch chiết mất màu Gộp các dịch chiết, cô dưới áp suất giảm và định mức đến 100 ml bằng methanol Lọc dịch thử qua màng lọc cellulose acetat 0,45 àm thu được dịch sắc ký

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 10,0 mg bacosid A3 vào bình định mức 5 ml Thêm 3 ml dung dịch methanol, lắc đều Bổ sung bằng dung dịch trên đến vạch Tiến hành pha loãng thu được dung dịch chuẩn bacosid A3 có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml

2 Phương pháp được đánh giá thẩm định theo các tiêu chí của AOAC về: độ thích hợp hệ thống (các giá trị RSD đề nhỏ hơn 2%); độ lặp lại (RSD (%) nhỏ hơn 1,5 %); độ thu hồi (đều nằm trong khoảng 92 – 105%); đường chuẩn và khoảng tuyến tính (các giá trị R 2 đều lớn hơn 0,99)

3 Áp dụng phương pháp trên 23 mẫu Rau đắng biển cho thấy cho thấy hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) trong các mẫu Rau đắng biển nằm trong khoảng từ 1,89 – 5,74% Trong đó, mẫu Rau đắng biển thu tại Thanh hóa cho hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) cao nhất (5,74 ± 0,03) Đề xuất

- Tiếp tục nghiên cứu đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) tại các thời điểm thu hái khác nhau và các vùng khác nhau

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt

1 Nguyễn Tiến Bân (Chủ Biên) (2003&2006), Danh lục các loài thực vật Việt

Nam, 3, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Hà Nội

2 Bộ Y Tế (2018), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học

3 Bộ Y Tế (2012), Hóa phân tích, 2, Nhà xuất bản Y học Hà Nội

4 Hoàng Minh Châu (2002), Cơ sở hóa học phân tích, Nhà xuất bản Khoa học

5 Quách Thị Lê Hà (2011), Triển khai mô hình đánh giá tác dụng của thuốc chống trầm cảm trên tế bào thần kinh vỏ não phôi thai chuột cống nuôi cấy và dòng tế bào NG 108-15 tại Viện Dược liệu, Đại học Dược Hà Nội

6 Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản trẻ

7 Nguyễn Thị Thu Hương (2006), "Tác dụng chống oxy hóa in vitro của rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst, Scrophulariaceae)", Tạp chí dược liệu

8 Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học

9 Trần Trung Nghĩa, Nguyễn Văn Tài,Lê Hùng Tiến (2017), "Xây dựng phương pháp định lượng Bacoside trong rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst bằng HPLC và tuyển chọn mẫu giống rau đắng biển có hàm lượng Bacoside cao", Tạp chí Khoa học & Công nghệ 4(9), tr 86-92

10 Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, 2, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật

11 Aiyalu Rajasekaran, Nagulsamy Sarathikumar (2014), "Simultaneous

Estimation of Luteolin and Apigenin in Methanol Leaf Extract of Bacopa monnieri Linn by HPLC", British Journal of Pharmaceutical Research 4(13), pp 1629-1637

12 Anju Varshney, Sunita Shailajan,Naresh Chandra (2011), "Estimation of flavonoid-luteolin in different plant parts of Bacopa monnieri (L.) Wettst by

13 Bhattacharya SK,Ghosal S (1998), "Anxiolytic activity of a standardized extract of Bacopa monniera: an experimental study", Phytomedicine, 5(2), pp

14 Bailey Kr,Crawley Jn (2001), "Methods of behavior analysis in neuroscience

", Chemical Rubber Company press, 2nd edition

15 Bhandari Pamita, Sendri Nitisha,Devidas Shinde Bhagatsing (2020),

"Dammarane triterpenoid glycosides in Bacopa monnieri: A review on chemical diversity and bioactivity", Phytochemistry, 172, pp 112276

16 Bose KC, Bose NK (1931), "Observations on the actions and uses of Herpestis monniera", Journal of the Indian Medical Association, 1, pp 60

17 Chakravarty AK, Garai S, Masuda K, Nakane T,Kawahara N (2003),

"Bacopasides III-V: three new triterpenoid glycosides from Bacopa monniera", Chem Pharm Bull (Tokyo), 51(2), pp 215-7

18 Chakravarty AK, Sarkar T, Masuda K, Shiojima K, Nakane T,Kawahara N

(2001), "Bacopaside I and II: two pseudojujubogenin glycosides from Bacopa monniera", Phytochemistry, 58(4), pp 553-6

19 Chen Yun-Bo,Lai Shi-Long (2005), "Effects of drug serum in broken bushen yizhi formulas on cell model of Alzheimer disease", Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research, pp 250-253

20 Chia-Chung Hou, Shwu-Jiuan Lin,Juei-Tang Cheng (2002), "Bacopaside III,

Bacopasaponin G, and Bacopasides A, B, and C from Bacopa monniera", journal of Natural Products, 65(12), pp 1759-1763

21 Chillara Sivaramakrishna, Chillara Vrao,Golakoti Trimurtulu (2005),

"Triterpenoid glycosides from Bacopa monnieri", Phytochemistry, 66(23), pp

22 Chopra RN, Nayar SL,Chopra IC (1956), Glossary of Indian Medicinal

23 Harvey D (2000), Modern analytical chemistry, McGraw-Hill New York

24 Jain P, Kulshreshtha DK (1993), "Bacoside A1, A minor saponin from Bacopa monniera", Phytochemistry, 33(2), pp 449-451

25 Kumar N, Abichandani LG, Thawani V,Gharpure KJ (2016), "Efficacy of

Standardized Extract of Bacopa monnieri (Bacognize(R)) on Cognitive

Functions of Medical Students: A Six-Week, Randomized Placebo-Controlled Trial", Evid Based Complement Alternat Med, 2016, pp 4103423

26 Nanteetip Limpeanchob, Somkiet Jaipan (2008), "Neuroprotective effect of

Bacopa monnieri on beta-amyloid-induced cell death in primary cortical culture", Journal of Ethnopharmacology, 120(1), pp 112-117

27 Nimisha Pulikkal Sukumaran,Augustine Amalraj (2019),

"Neuropharmacological and cognitive effects of Bacopa monnieri (L.) Wettst – A review on its mechanistic aspects", Complementary Therapies in Medicine, 44, pp 68-82

28 Pamita Bhandari, Neeraj Kumar,Bikram Singh (2007), "Cucurbitacins from

29 Ramawat Kg, Mérillon Jm (2008), Bioactive Molecules and Medicinal Plants,

30 Saraswati Garai, Shashi B Mahato (1996), "Bacopasaponin D-A pseudojujubogenin glycoside from Bacopa monniera", Phytochemistry, 43(2), pp 447-449

31 Shashi B Mahato,Saraswati Garai (2000), "Bacopasaponins E and F: two jujubogenin bisdesmosides from Bacopa monniera", Phytochemistry, 53(6), pp 711-714

32 Stough C, Lloyd J, Clarke J, Downey L, Hutchison C,Rodgers (2001), "The chronic effects of an extract of Bacopa monniera (Brahmi) on cognitive function in healthy human subjects", Psychopharmacology, 156, pp 481-484

33 Steven Roodenrys,Dianne Booth Msc (2002), "Chronic Effects of Brahmi

(Bacopa monnieri) on Human Memory", Neuropsychopharmacology, 27, pp

34 Subha Rastogi, Dinesh K Kulshreshtha (1998), "Bacoside A2-A triterpenoid saponin from Bacopa monnieri", Indian Journal of Chemistry, 38B, pp 353-

35 Subha Rastogi, Raghwendra Pal, Dinesh K (1994), "Bacoside A3, A triterpenoid saponin from Bacopa monniera", Phytochemistry, 36(1), pp 133-

36 The British Pharmacopoeia Commission Secretariat of the Medicines and

Healthcare Products Regulatory Agency (Mhra) (2016), British Pharmacopoeia, The Stationery Office

37 The United States Pharmacopeial Concention (2015), The United State

Pharmacopeia 38 NF 33 Second Supplement, Rockville, Maryland: United

38 The United States Pharmacopeial Convention (2018), The United State

Pharmacopeia 40 NF 35 Second Supplement, Rockville, Maryland : United

39 Tripathi YB, Chaurasia S, Tripathi E, Upadhyay A, Dubey GP (1996),

"Bacopa monniera Linn as an antioxidant: mechanism of action", Indian J Exp Biol, 34(6), pp 523-6

40 Watoo Phrompittayarat, Sakchai Wittaya-Areekul, Kanchalee Jetiyanon

(2007), "Determinationof Saponin Glycosides in Bacopa monnieri by

Reversed Phase High PerformanceLiquid Chromatography ", Thai Pharmaceutical and Health Science Journal, 2(1), pp 26-32

41 Yun Zhou, Yun-Heng Shen, Chuan Zhang, Juan Su (2007), "Triterpene

Saponins from Bacopa monnieri and Their Antidepressant Effects in Two

Mice Models", Journal of Natural Products, 70(4), pp 652-655

42 https://doctors24h.vn/cay-rau-dang.html

43 https://www.thuocbietduoc.com.vn/thuoc-goc-2718/rau-dang-bien.aspx

44 https://duocthu.com/hplc-dung-de-lam-gi/hplc-2/#prettyPhoto

45 https://plants.usda.gov/core/profile?symbol=XAST.

Về kết quả định lượng triterpen glycosid tổng số trong các mẫu Rau đắng biển