Tổng quan về Bacillus thuringiensis var.israelensis

Luận Văn: Tổng quan về Bacillus thuringiensis var.israelensis

Mở Đầu

Một trong những tác nhân truyền nhũng bệnh hiểm nghèo cho ngời nh sốtrét, sốt xuất huyết, viêm não Nhật Bản… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr là do muỗi gây ra Muỗi sinh trởng vàphát triển rất tốt ở những vùng có điều kiện thuận lợi cho nhiều loài côn trùngphát triển nh những vùng nhiệt đới trong đó có Việt Nam Theo thống kê của Tổchức Y tế thế giới (WHO) thì hàng năm, trên Việt Nam thế giới có tới hàng triệutrờng hợp mắc các bệnh do muỗi truyền Riêng ở Việt Nam , theo thống kê 6tháng đầu năm 2001vẫn còn 126.000 ca sốt rét, 8.700 ca sốt xuất huyết, trong đó20-25% ca tử vong và 60-70% để lại di chứng Các bệnh hiểm nghèo do muỗitruyền đã có mặt ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nớc làm ảnh hởng đến tìnhhình kinh tế xã hội Bên cạnh đó, sự tiềm ẩn nguy cơ bùng nổ thành dịch do hiệntợng kháng thuốc của côn trùng làm cho các nhà quản lý phải có những nỗ lựcđể thanh toán các bệnh trên Sở dĩ có những nguy cơ đó là do một thời gian khádài từ trớc những năm đầu của thập kỉ 80, chúng ta đã sử dụng thờng xuyên cáchoá chất độc thuộc nhóm lân hữu cơ, các chất thuộc nhóm Pyrethroid để tẩmnhuộm màn Điều này không những phá vỡ cân bằng sinh thái, gây hiện tợngbùng nổ côn trùng do kháng thuốc mà còn ảnh hởng tới sức khoẻ con ngời.

Loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis (Bti) đợc phát hiện vào năm76 tại Israel có khả năng diệt muỗi đã mở ra một triển vọng mới cho việc kiểmsoát các vectơ truyền bệnh hiểm nghèo cho ngời Nhiều chế phẩm sinh học diệtmuỗi từ Bacillus thuringiensis var.israelensis đã đợc sản xuất và ứng dụng thànhcông nh Bactimos (Bỉ), Skeetan (Anh), Vectobac (Mỹ)… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr Theo tổ chức Y tế thếgiới thì việc sử dụng chế phẩm sinh học diệt muỗi từ các chủng Bacillusthuringiensis var.israelensis là một biện pháp rất an toàn và hiệu quả

ở nớc ta, việc nghiên cứu về Bacillus thuringiensis var.israelensis mới chỉbắt đầu từ một vài năm gần đây nhng cũng đã thu đợc những kết quả đáng kể.Nhiều chủng Bacillus thuringiensis var.israelensis có hoạt lực cao đã đợc phânlập, một vài dòng gen đã đợc nghiên cứu tách dòng, đọc trình tự và biểu hiện.Chúng ta cũng đã bớc đầu thử nghiệm thành công chế phẩm trong phạm viphòng thí nghiệm Tuy nhiên việc sản xuất và ứng dụng chế phẩm diệt muỗi từBacillus thuringiensis var.israelensis cần phải đợc nghiên cứu thêm nữa.

Phần I:Tổng quan về Bacillus thuringiensis

1.1 Tóm tắt về lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis

Lịch sử về Bacillus thuringiensis bắt đầu từ khi Loius Pasteur phát hiện thấymột loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tằm ông đặt tên là Bacillusbombyces Năm 1901, Ishiwata phân lập ra một loại vi khuẩn từ ấu trùng tằmbịbệnh và đặt tên là Bacillus sotto, năm 1911, Berliner đã phân lập đợc một loại vikhuẩn tơng tự từ xác ấu trùng bớm ĐịaTrung Hải Đến năm 1915, vi khuẩn nàychính thức mang tên Bacillus thuringiensis

Năm 1928, Huszddax phân lập chủng B.thuringiensis (Bt ) từ Ephestia, thửnghiệm nó trên sâu đục thân ngô ở Châu Âu, đây đợc coi là ứng dụng đầu tiêncủa Bacillus thuringiensis Chế phẩm thơng mại đầu tiên , Sporeine, đợc sản xuấtở Pháp năm 1938 Năm 1951-1956 Steinhaus nghiên cứu khả năng diệt côn trùngcủa Bacillus thuringiensis và đã sản xuất ở Mỹ Trong suốt những năm 1960,nhiều chế phẩm thơng mại của Bt đã đợc sản xuất ở nhièu quy mô khác nhau tạiMỹ, Pháp, Đức.Sau đó Howard Dulmage và Clayton Beesle của viện nghiên cứuNông Nghiệp USDA đã thu thập đợc bộ su tầm đầu tiên về các chủng Bt Năm1970, Dulmage đã phân lập đợc chủng HD-1 và cho đến nay nó vẫn đợc sử dụngcho nhiều nghiên cứu và trong chế phẩm Bt.

Thập niên 80, nhiều công ty sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh đã đăng ký sảnxuất và kinh doanh các chế phẩm BT Đầu những năm 90 tại một số quốc gia nhCuba, Trung Quốc, Mỹ đẫ sản xuất chế phẩm BT ở quy mô công nghiệp Ngàynay một số lợng lớn thơng phẩm trừ sâu sinh học BT đợc sử dụng trong việckiểm soát ấu trùng bộ cánh vẩy, hai cánh và cánh cứng… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr

1.2 Sự phân bố của B.thuringiensis

Bacillus thuringiensis tồn tại ở khắp mọi nơi trong đất và trên bề mặt lá, ởđất rừng, thảo nguyên, sa mạc hay ở môi trờng có điều kiện thuận lợi cho sâu bọphát triển nh bụi hạt từ các nhà máy xay lúa mì, trong các kho bảo quản ngũcốc… là do muỗi gây ra Muỗi sinh trSự phân bố của Bt là không liên quan đến sự phân bố của côn trùng đích.Tuy nhiên ,Bt thờng có xu hớng tồn tại nhiều trong môi tròng có nhiều sâu bọphát triển và giàu dinh dỡng.Có thể phân lập Bt từ nhiều loại môi trờng khácnhau Bt dễ dàng phát triển trong môi trờng thí nghiệm chỉ với một lợng tối thiểuchất dinh dỡng Mặc dù bào tử Bt tồn tại trong nhiều năm, nhng chúng khôngnảy mầm và nhân lên nh các tế bào sinh dỡng trong đất tự nhiên Điều này chứngtỏ rằng Bt không thích nghi với môi trờng đất.

1.3 Đặc điểm sinh thái của B.thuringiensis

B.thuringiensis là thành viên của nhóm I, chi Bacillus Đây là loại vi khuẩnsinh bào tử, Gram dơng, hô hấp hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc Tế bàocó kích thớc 3x6 m, có phủ tiêm mao không dày, có khả năng chuyển động , tếbào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi.

Là một loài thuộc chi Bacillus nên khi gặp điều kiện không thuận lợi nhthiếu dinh dỡng, nhiệt độ cao, khô hạn… là do muỗi gây ra Muỗi sinh trBt có khả năng sinh nội bào tử giúp chochúng chống chịu với điều kiện khắc nghiệt đó Bào tử của vi khuẩn có dạnghình trứng với kích thớc 1,5x2 m và có thể nảy mầm thành tế bào sinh dỡngkhi có điều kiện thuận lợi.

Sự hình thành bào tử diễn ra đồng thời với sự tạo thành protein tinh thể cókhả năng diệt côn trùng Tinh thể có nhiều hình dạng khác nhau ( hình vuông,chữ nhật, hình tháp, hình ôvan hoặc vô định hình ) Khi tế bào phân giải tinh thểvà bào tử đợc giải phóng ra ngoài Tinh thể có kích thớc khoảng 0,6x0,2  m, vàcó thể chiếm tới 30% trọng lợng khô của tế bào Tinh thể này đợc gọi là thể vùi.Tinh thể và bào tử có thể quan sát dới kính hiển vi đối pha ở vật kính đầu Tinhthể bắt màu sẫm còn bào tử không bắt màu nhng có mép sáng Hình dạng củatinh thể đợc quyết định bởi gen mã hoá cho tổng hợp protein của tinh thể nằmtrên plasmid.

1.4 Đặc điểm sinh hoá của B.thuringiensis

Nói chung B.thuringiensis không lên men sinh axít đối với arabinoza,xiloza, và manitol,khử nitơrat thanh nitơrit, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà,phát triển đợc trong môi trờng thạch kị khí có chứa 1% lizozym Sinh trởng tốtnhất ở nhiệt độ 28-30 0C, pH 6,8-7,2.

Tuy nhiên việc phân loại chỉ dựa trên typ huyết thanh vẫn cha phản ánh đợc mốiliên hệ giữa chủng giống và hoạt lực diệt côn trùng Viẹc phân lập và tuyển chọncác chủng Bt có giá trị vẫn gặp khó khăn Chính vì vậy, gần đây một số nhàkhoa học đã đề nghị đa ra phơng pháp phân loại mới dựa trên kết quả xác địnhtyp huyết thanh, hình dạng tinh thể, hoạt lực diệt côn trùng, gen Cry và thànhphần protein tinh thể, hình dạng tinh thể và hoạt lực diệt côn trùng

Bảng 1: Quan hệ giữa các lớp Cry, hình dạng tinh thể, thành phần protein và hoạt

lực diệt côn trùng.Lớp gen Thành phần

Protein (KDa)

Hình dạngtinh thể

Typ huyếtthanh

Hoạt lực diệtcôn trùngCry1A

Tháp đôiTháp đôiTháp đôiTháp đôiTháp đôi

Cánh vẩy Cánh vẩy Cánh vẩy Cánh vẩy Cánh vẩy Cry2A

Cánh vẩy, haicánh

Cánh vẩyCry3A

Cry3B Cry3CCry3D

Tháp đôiTháp đôiTháp đôiTháp đôi

Cánh cứngCánh cứngCánh cứngCánh cứngCry4A

Hình cầuHình cầuHình cầuHình cầu

Hai cánhHai cánhHai cánhHai cánh

cánh cứng

1.6.Các loại độc tố do B.thuringiensis sinh ra

Trong quá trình hình thành bào tử Bt có khả năng sinh ra 4 loại độc tố:+-Exotoxin hay ngoại đọc tố A

Năm 1954 lần đầu tiên Tomanaff phát hiện thấy vi khuẩn Bt var.elesti sảnsinh ra enzym leucintinase Tác động độc của enzym này liên quan đến sự phânhuỷ mang tính chất cảm ứng của phospholopit trong mô của côn trùng, làm côntrùng chết.Enym này lần đầu tiên liên kết với tế bào ruột sau đó tách ra và đợchoạt hoá bởi một chất không bền nhiệt Chất này có trọng lợng phân tử thấp, cóthể là lipit -Exotoxin có khả năng hoà tan vào nớc và đặc biệt chỉ tác động vàoloài ong xẻ có pH đờng ruột phù hợp với hoạt đông của enzym này -Exotoxincũng có hiệu lực với sâu thuộc bộ cánh cứng, cánh vẩy… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr

+-Exotoxin hay ngoại đọc tố B

Đọc tố này bền nhiệt ở 1200C trong vòng 15 phút vẫn giữ đợc hoạt tính.Một số Bt không sinh ra tinh thể độc nhng có thể sinh ra ngoại độc tố  Hoạttính của ngoại độc tố  bắt đầu xuất hiện trong giai đoạn phát triển mạnh trớckhi hình thành bào tử Ngoại độc tố là một nucleotid có trọng lợng phân tử thấp.Ngoại độc tố  còn có tác dụng cộng hởng với nội độc tố , sau khi có tác dụnggây dập vỡ, phá huỷ hoàn toàn biểu mô ruột giữa của ôn trùng mẫn cảm, ngoạiđộc tố nhanh chóng xâm nhập vào huyết tơng và máu gây thay đổi sinh lý dẫntới cái chết nhanh của côn trùng.

+-exotoxin hay độc tố tan trong nớc

-exotoxin thuộc nhóm photpholipaza, nó tác động lên photpholipit và giảiphóng ra axit béo -exotoxin có chứa các peptid với trọng lợng phân tử thấp vàmột số axitamin tự do Ngoại độc tố này tan trong nớc, không ổn định, mẫn cảmvới ánh sáng, oxy, không khí và nhiệt độ.

Nguyên tố của tinh thể, ngoài C, H, O, N, S còn thấy một số nguyên tố khácnh là Ca, Mg, Si, Fe… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr với một lợng nhỏ Ni, Zn, Al… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr và hầu nh không có P.

Sự tổng hợp tinh thể xẩy ra khoảng 3 giờ sau pha cân bằng Mỗi tế bào sinhbào tử chỉ có thể có từ 1 đến 3 tinh thể độc Tinh thể độc không tan trong dungmôi hữu cơ Có những tinh thể khi mới tách khỏi bào tử chỉ tan trong pH rấtkiềm.

Tinh thể đọc rất bền nhiệt,ủ 1 giờ ở 650C vẫn không bị mất hoạt tính, tínhđộc chỉ mất đi nếu ủ ở 1000C trong 30-40 phút.

1.7 Phân loại gen độc tố diệt côn trùng của B.thuringiensis

Ngày nay ngời ta đã phân tích 50 gen độc tố của Bt và nhận thấy một sốhoàn toàn giống nhau, đại diện cho cùng một gen hay biến dạng từ một gen.Trong đó có khoảng 20 gen phân biệt chịu trách nhiệm tổnh hợp các protein tinhthể, nhất là các protein tinh thể độc.

Bảng 2 Phân loại gen độc tố và phổ tác dụng của Bt

phân tử,kDa

đích Bacillusthuringiensis dạng tinhthểCry1A(a, b, c)

Cry1BCry1CCry1D, E, F

Cánh vẩyCánh vẩyHai cánhHai cánh

B berlinerB kurstaki KTOB entomocidusB aizawai

Lỡng thápCry2A

Cry2B, C

Cánh vẩyHai cánh

B aizawai

B kurstaki HD-1

Lập ơng

ph-Cry3A, B, C, D 66-73 Cánh cứng B tenebrionis Thoi dẹtCry4A, B

Cry4C, D

B morrisoni PG14B israelensiss

CầuChữ nhậtCry5A

Cánh cứng B kurstaki JHCC

Lỡng tháp

Phần II Tổng quan về Bacillus thuringiensis var.israelensis

2.1 Lịch sử phát triển của loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis

Bacillus thuringiensis đợc chia làm nhiều loài phụ Theo bộ su tập của trungtâm Bacillus diệt côn trùng Quốc tế, Viện Pasteur Paris năm 1996,đã có tới hơn69 loài phụ khác nhau nh: cánh vẩy, cánh cứng, hai cánh ở một số loài phụ củaBacillus thuringiensis var.berliner, Bacillus thuringiensis var.thompsoni… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr

Khác với loài Bacillus thuringiensis, loài phụ Bacillus thuringiensisvar.israelensis mới đợc phát hiện gần đây Loài phụ này có tác dụng diệt ấutrùng muỗi Các nhà khoa học Goldberg, Margarit là những ngời đầu tiên phânlập, nghiên cứu loài vi khuẩn này và De Bajac đặt tên cho là Bacillusthuringiensis var.israelensis Họ đã phân lập và nuôi cấy,thử hoạt lực diệt ẩutùngmuỗi với hàng trăm chủng khác nhau Tuy nhiên chỉ có một số chủng có hoạt lựcdiệt các loài muỗi Culex pipens, Culex univttatus, Aedes aegypti và Anophelessergentti… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr

Chủng đầu tiên đó đợc kí hiệu là ORN-60A và thuộc typ huyết thanh H14.Khả năng sinh độc tố và tác dụng diệt muỗi của vi khuẩn này đã có nhiều côngtrình công bố Ngày nay đã có rất nhiều chủng Bacillus thuringiensisvar.israelensis đợc tìm thấy và đợc phân loại làm phong phú thêm bộ su tập vềBacillus diệt côn trùng Các chủng thờng đợc sử dụng trong việc sản xuất chếphẩm sinh học diệt muỗi với các tên gọi khác nhau: Bactimos (Bỉ), Skeetan(Anh), Vectobac (Mỹ)… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr chế phẩm dạng lỏng, dạng bột thấm nớc, dạng viên,bánh nổi có tác dụng diệt ấu trùng của nhiều loài ruồi muỗi trong đó có loàiAedes Aegypti ( là vectơ truyền bệnh sốt xuất huyết) Chế phẩm Bacillus

thuringiensis var.israelensis có tác dụng tốt trong môi trờng nớc sạch, nớc khôngtù đọng hoặc nớc có nồng độ muối loãng và đợc Tổ chức Y tế thế giới lựa chọnđể diệt trừ các vectơ truyền bệnh sốt rét, sốt xuất huyết ở các nớc nhiệt đới.

2.2.Đặc điểm phân loại loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis

Bacillus thuringiensis var.israelensis là loài phụ của loài Bacillusthuringiensis De Bajac là ngời đầu tiên đã phân loại loài phụ Bacillusthuringiensis var.israelensis thuộc typ huyết thanh H14 Tuy nhiên vào năm 1988,Ohba và Aiawa (Nhật Bản) đã phân lập đợc hai chủng Bacillus thuringiensisthuộc typ huyết thanh H14 nhng lại không có hoạt lực diệt muỗi, ruồi đen Trớcđó (năm 1982) Pachun và cộng sự đã phân lập đợc chủng PG-14 thuộc typ huyếtthanh H8A,B có hoạt lực cao đối với ấu trùng muỗi Aedes Aegypti, Culexpipens, Culex univttatus, Aedes aegypti và Anopheles sergentti… là do muỗi gây ra Muỗi sinh tr

Do đó nếu chỉ dựa trên đặc diểm typ huyêt thanh thì không thể đảm bảo đợcphân loại một cách chính xác mà phải dựa trên những đặc điểm khác nhau nh lớpCry, thành phần và hình dạng protein tinh thể Hofte và Whiteley là những ngờiđầu tiên đa ra ý tởng phân loại loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis dựatrên sự kết hợp của tất cả các đặc điểm: gen Cry, thành phần và hình dạngprotein tinh thể, hoạt lực diệt côn trùng và typ huyết thanh ý tởng này đẵ đợc rấtnhiều nhà khoa học hởng ứng và đợc sử dụng chủ yếu cho đến nay để phân loạiBacillus thuringiensis var.israelensis.

Bảng 3: Đặc điểm phân loại của loài phụ Bacillus thuringiensis

var.israelensis (theo Hofte và Whiteley, 1989).Lớp gen Cry Thành phần

Hình dạngtinh thể

Typ huyếtthanh

Hoạt lực diệtcôn trùngCry4A

Hình cầuHình cầuHình cầuHình cầuHình cầu

Muỗi, ruồiđen

Muỗi, ruồiđen

Muỗi, ruồiđen

Muỗi, ruồiđen

Muỗi, ruồiđen

2.3.Protein diệt muỗi của loài phụ Bacillus thuringiensis var.israelensis

Sự hình thành protein tinh thể Bacillus thuringiensis thờng xẩy ra trong quátrình hình thành bào tử và nhiều nghiên cứu gần đây đã cho thấy nó có liên quanmật thiết tới sự có mặt của DNA plasmit Gen mã hoá protein độc thờng nằmtrên các plámid cỡ lớn trên 3 kb gồm một phần là genmã hoá protein độc và phầncòn lại mã hoá protein liên quan đến tính gắn.

Khi nghiên cứu các cách chủng Bacillus thuringiensis var.israelensis cóhoạt lực đối với côn trùng thuộc bộ hai cánh, ngời ta thấy protein độc của chúngbao gồm các tiểu phần protein có trọng lợng phân tử: 130 KDa, 128 KDa, 78KDa, 6 KDa , 28 KDa do các lớp gen Cry4A, Cry4B, Cry4C, Cry4D và Cyt mãhoá tổng hợp nên.Đây cũng chính là đặc điểm quan trọng nhất để phân biệt loàiphụ Bacillus thuringiensis var.israelensis với các loài khác

Nhóm Cry4 mã hoá tổng hợp các protein tinh thể có trọng lợng 130, 128,78 và 67 KDa, có kích thớc thông thờng khoảng từ 0.7-1.2 m Nhóm genCry4 mã hoá tổng hợp các protein tinh thể có trọng lợng 130, 128, 78và 67 kDacó kích thớc thông thờng đạt từ 0.7-1.2 m Nhóm gen Cyt bao gồm hai lớpCytA và CytB thờng tồn tại ở các chủng Bacillus thuringiensis mang nhóm genCry4 và tổng hợp các protein có trọng lợng phân tử khoảng 28 kDa Các chủngBacillus thuringiensis var.israelensis thờng tổng hợp các tinh thể protein hìnhcầu chỉ gây độc đối với bộ côn trùng hai cánh Tinh thể độc của Bti gồm ba loạithể vùi protein khác nhau gắn với nhau bằng các lớp vỏ bọc Mỗi thể vùi đợc bảo