Protocol for CelCradle™ 500A Operation Protocol for CelCradle™ 500A Operation | Version 3 © ESCO Aster All Rights Reserved 1 | P a g e 21 Changi South Street 1 Singapore 486777 Tel +65 65420833 | Fax[.]
21 Changi South Street Singapore 486777 Tel: +65 65420833 | Fax: +65 65426920 Quy trình vận hành CelCradle™ 500A Protocol for Celcradle 500A Operation (General protocol) Nội dung NGUYÊN, VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP Phủ chất gắn kết lên vật liệu mang (carrier) (tùy thuộc yêu cầu) Chuẩn bị cho cấy tế bào Cấy tế bào Cấy thẳng đứng Cấy ngược Nuôi cấy tăng trưởng tế bào Kiểm soát sinh trưởng tế bào (Tham khảo phụ lục A) Thu tế bào Một vài lưu ý thu tế bào PHỤ LỤC A Nhuộm tế bào Nhuộm tế bào sống với thuốc nhuộm huỳnh quang Nhuộm thường cố định tế bào Thu lượng nhỏ tế bào ngày để theo dõi Hóa chất tách tế bào Thuốc nhuộm CVD (Crystal Violet Dye) Theo dõi tăng sinh tế bào với Prestoblue Assay Tính lượng Glucose tiêu thụ Đo pH PHỤ LỤC B (các kết quả) 10 Nhuộm tế bào sống 10 Nhuộm Hemotoxylin ngày khác 11 Cấu trúc Hợp lưu cao tế bào (MSCs) 11 Tăng trưởng tế bào (MSCs) 12 Phương pháp đánh giá khả sống tăng sinh tế bào 12 Mức độ tiêu thụ Glucose (MSCs) 13 Protocol for CelCradle™ 500A Operation | Version 1|Page © ESCO Aster All Rights Reserved Protocol for CelCradleTM 500A Operation NGUYÊN, VẬT LIỆU • Dung dịch chứa chất gắn kết (khơng bắt buộc) • PBS khơng chứa Mg2+/Ca2+ • Tế bào • Mơi trường hồn chỉnh • CelCradle Stage 3000 • CelCradleTM 500A (EscoAster/VaccixCell) • Thiết bị đo Glucose GlucCell Monitoring System (GlucCell Meter + Strips) • Thiết bị đo pH • Kẹp dài • Dụng cụ lọc vật liệu mang • Kit Crystal Violet Dye (CVD) • Thuốc nhuộm Trypan Blue / Hemotoxylin • Florescent diacetate (FDA) (1 μg/ml) (ThermoFisher Scientific) • Propidium Iodide (PI) (1 μg/ml) (ThermoFisher Scientific) • Hoechst 33342 (1 μg/ml) (ThermoFisher Scientific) • Hóa chất tách tế bào (0.05% Trypsin-EDTA/Tryple Express/Collagenase/Accutase/Accumax) Protocol for CelCradle™ 500A Operation | Version 2|Page © ESCO Aster All Rights Reserved Protocol for CelCradleTM 500A Operation PHƯƠNG PHÁP Phủ lớp gắn kết (tùy thuộc yêu cầu) a Đặt chai CelCradle 500A Tủ an toàn sinh học cấp II b Phủ vật liệu mang với fibronectin với dung dịch gắn kết tế bào 30 phút 37oC c Hút dung dịch d Rửa nhanh vật liệu mang với 250ml PBS, lắc nhẹ (nếu cần thiết) e Thực bước (cấy tế bào) Lưu ý: Phủ lớp gắn kết theo hướng dẫn nhà sản xuất Chuẩn bị cấy tế bào Chuẩn bị chai nuôi cấy tế bào T- 175 để cấy cho chai CelCradle™ 500A Loại tế bào Tế bào gốc trung mơ Tế bào nỗn chuột hamster Trung Quốc Chinese hamster ovary cells (CHO) HEK293T Vero Hybridoma OKT MDCK Mật độ tế bào cấy (Số tế bào/ vật liệu mang) 20,000 – 60,000 100,000 – 300,000 100,000 – 500,000 100,000 – 300,000 100,000 – 300,000 60,000 – 120,000 Cấy tế bào Cấy thẳng đứng Chuẩn bị 400ml môi trường nuôi cấy – 2x108 tế bào 100ml môi trường nuôi cấy Từ từ đổ 400ml môi trường nuôi cấy vào chai CelCradle-500A Nén phần phía chai đẩy mơi trường lên đảm bảo vật liệu mang tiếp xúc hồn tồn với mơi trường Tra từ từ dịch tế bào vào toàn vật liệu mang đảm bảo tế bào phân bố đến vật liệu mang Protocol for CelCradle™ 500A Operation | Version 3|Page © ESCO Aster All Rights Reserved Protocol for CelCradleTM 500A Operation Đặt chai CelCradle lên thiết bị CelCradle Stage Cài đặt thơng số cho q trình cấy tế bào - Up: 2.0 mm/s, Top Holding: 20 s; Down: 2.0 mm/s; Bottom Holding: 0s Sau nhấn “Start” để bắt đầu trình bám tế bào (Thay đổi “Up” sang “Down” cách nhấn phím “STOP”; cài đặt phút, nhấn giữ phím “DELAY”; cài đặt giây, nhấn giữ nhanh phím “DELAY”) Sau 3~5 giờ, thay đổi thơng số: Up: 1.0 mm/s, Top Holding: s, Down: 1.0 mm/s, Bottom Holding: phút, để thực trình ni tế bào (Các thơng số thay đổi) Cấy ngược Đối với trường hợp lượng tế bào cấy 5x107 tế bào trường hợp tế bào khó bám (Phù hợp cho tế bào gốc trung mô) Từ từ tra phân bố dịch tế bào lên vật liệu mang phủ lớp gắn kết tế bào Protocol for CelCradle™ 500A Operation | Version 4|Page © ESCO Aster All Rights Reserved Protocol for CelCradleTM 500A Operation Đặt nắp chai xanh có lọc đĩa petri vơ trùng đậy lại để đảm bảo nắp vô trùng sử dụng lại Dùng nắp trắng không lọc thay tạm thời Đặt ngược chai đảm bảo tất vật liệu mang rơi xuống nắp tiếp xúc hồn tồn mơi trường Lắc để tế bào phân bố chai Đặt chai tủ ấm Ủ 2-4 để tế bào bám vào vật liệu mang Cứ 15 phút, Lắc chai nhẹ nhàng để tế bào phân lại môi trường Sau giờ, lấy 10ml môi trường để đếm số lượng tế bào tự 10 Ly tâm trộn tế bào cịn lại mơi trường ni cấy tính % lượng tế bào bám 11 Lặp lại bước g-h để kiểm tra bám tế bào 12 Dừng trình cấy tỷ lệ bám đạt 90% Protocol for CelCradle™ 500A Operation | Version 5|Page © ESCO Aster All Rights Reserved Protocol for CelCradleTM 500A Operation Lưu ý: Tế bào MSC đạt tỉ lệ bám >90% sau Người sử dụng dừng q trình cấy sau Tỷ lệ bám đạt khoảng 98% Nuôi cấy tăng trưởng tế bào Cấp môi trường vào chai 500 ml Đặt chai vào CelCradle Stage Cài đặt thông số cho q trình ni cấy nhấn “Start” để bắt đầu trình cấy i Up: 1.0 mm/s, Top Holding: s, ii Down: 1.0 mm/s, Bottom Holding: Lưu ý: Các thơng số thay đổi cho phù hợp với đặc điểm dòng tế bào Theo dõi tăng trưởng tế bào (Tham khảo phụ lục A) Theo dõi nồng độ glocose độ pH hàng ngày mơi trường để dự đốn thời gian để thay môi trường nuôi cấy bổ sung glucose sodium bicarbonate Nên kiểm tra nồng độ glucose, nhuộm đếm tế bào ngày, ngày chạy thử nghiệm ban đầu Thử nghiệm đánh giá khả sống tế bào Prestoblue /Thử nghiệm MTT/ sử dụng để theo dõi trạng thái tế bào vật liệu mang (Phụ lục A) a ml môi trường: Đo pH glucose b vật liệu mang: Thử nghiệm PrestoBlue số phương pháp khác dùng để đánh giá hoạt động chuyển hóa tế bào theo quy trình chuẩn a vật liệu mang: Nhuộm tế bào sống/chết sử dụng FDA, PI, Hoechst theo quy trình chuẩn c vật liệu mang: Thu tế bào trypsin để đếm số lượng tế bào sống nhuộm đếm nhân CVD d Thay môi trường nuôi cấy khi: a Nồng độ glucose giảm xuống 1g/L b pH thấp 7.00 c khoảng 2-3 ngày (theo quy trình ni 2D nồng độ glucose pH ổn định) e Thu tế bào đạt độ hợp lưu tế bào tối đa Lưu ý: Thử nghiệm lượng Glucose tiêu thụ/ Thử nghiệm Prestoblue đếm tổng số tế bào sử dụng để đo mức độ hợp lưu tế bào Ngoài ra, tế bào hình thành cấu trúc dạng lưới đạt mức độ hợp lưu cao (Phụ lục B) Protocol for CelCradle™ 500A Operation | Version 6|Page © ESCO Aster All Rights Reserved Protocol for CelCradleTM 500A Operation Thu tế bào Dùng dụng cụ lọc để loại môi trường nuôi cấy giữ lại vật liệu mang Nhẹ nhàng rửa tế bào với 500 ml PBS (hai lần) 10 phút cách đặt chai vào thiết bị CelCradle cài đặt thông số tốc độ Up: mm/sec, Down: mm/sec, Upholding: sec, Down holding: sec Loại bỏ PBS sau lần rửa Thêm 120 ml dung dịch trypsin-EDTA 0,05% (đã làm ấm), đậy kín bình nắp trắng khơng màng lọc Úp ngược bình để vật liệu mang tiếp xúc hoàn toàn dung dịch tách, ủ khoảng 15 phút tủ ấm Vỗ mạnh lòng bàn tay vào chai phút Xoay chai lúc vỗ Thêm 0,1mg/ml DNase chất ức chế trypsin 0,1% (hoặc 10% huyết thanh) vào 100 ml môi trường nuôi cấy dung dịch HBSS Thêm 100 ml dung dịch vào chai, nắp chặt bình nắp trắng không lọc Đảo ngược chai Lắc để lấy tế bào từ vật liệu mang Đổ dung dịch tế bào vào ống ly tâm 10 Lặp lại bước - khoảng - lần, để thu tối đa lượng tế bào 11 Thu toàn tế bào cách ly tâm; kiểm tra mật độ tế bào khả sống 12 Đánh giá hiệu thu tế bào kiểm tra lượng tế bào lại vật liệu mang Lưu ý thu tế bào: Bước rửa với PBS ban đầu quan trọng loại bỏ tồn huyết tế bào chết Một lượng tế bào bật bước này, phần lớn tế bào chết Bước làm tăng hiệu thu tế bào sống Nếu hiệu thu tế bào sống đạt mức yêu cầu, cần thực lần thu Để đảm bảo thu hoạch hiệu quả, lắc nhẹ q trình ủ với enzyme Úp ngược bình đặt lên máy lắc 200rpm 37oC 15 phút, tế bào thuộc loại khó tách Thời gian đủ cho enzyme hoạt động quan trọng cho việc thu tế bào hiệu Phần lớn tế bào chịu tác động trypsin-EDTA 30 phút mà không mà bị giảm khả sống Mật độ cao tế bào yêu cầu nhiều enzyme tách thời gian ủ dài Accutase (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA) cho phép ủ với thời gian dài mà không ảnh hưởng tới tế bào Thêm 0,5mg/ml DNase chất ức chế trysin /huyết để làm tăng hiệu tách tế bào từ vật liệu mang đảm bảo khả sống cao tế bào Protocol for CelCradle™ 500A Operation | Version 7|Page © ESCO Aster All Rights Reserved Protocol for CelCradleTM 500A Operation PHỤ LỤC A Nhuộm tế bào Nhuộm tế bào sống thuốc nhuộm huỳnh quang Thu 1-2 vật liệu mang BioNOC® II từ bình ni cấy chuyển vào giếng khác đĩa 24 giếng Cho 500µl mơi trường ni cấy vào giếng Cho thuốc nhuộm nồng độ pha lỗng u cầu: 1µg/ml Hoescht 33342 (Thermo Fisher, H3570), 1µM fluorescein diacetate (FDA, Thermo Fisher, C34852 1µg/ml propidium iodide (PI, Sigma Aldrich P4170) môi trường nuôi cấy Ủ vật liệu mang 30 phút 37oC, 5% CO2, chụp ảnh lọc tương ứng (xanh dương ứng với Hoechst 33342, xanh ứng với FDA đỏ ứng với PI) Lưu ý: Một vài loại nhuộm huỳnh quang khác sử dụng để phát tế bào Ví dụ: calcein green, acridine orange, Cell tracker etc Cố định nhuộm tế bào Thu 1-2 vật liệu mang BioNOC® II từ bình ni cấy Loại nước cố định tế bào ethanol 70% phút, sau ethanol 99,5% Rửa nước khử ion PBS lần để loại bỏ ethanol Nhuộm tế bào với hematoxylin H&E 5-10 phút Rửa nhuộm với nước khử ion Quan sát vật liệu mang kính hiển vi Lưu ý: Có thể dùng vài loại nhuộm khác Ex: Trypan blue Nhuộm huỳnh quang để quan sát tế bào lại vật liệu mang sau hoạch Thu tế bào theo dõi hàng ngày Enzyme tách tế bào Enzyme tách tế bào: Accumax, Trypsin 0,25%, TrypLe Express, Collagenase Thu vật liệu mang từ bình ni cấy chuyển vào ống 1,5 ml Rửa vật liệu mang với PBS 1ml PBS Loại bỏ PBS Lặp lại bước thêm lần Tách tế bào enzyme: i Trypsin / TrypLE Express: (hầu hết loại tế bào) Thêm 1ml Trypsin-EDTA 0,25%, ủ 37oC khoảng 10-15 phút Trung hòa 1ml mơi trường ii Accumax/Accutase: (thích hợp cho tế bào gốc) Thêm 1ml Accumax/Accutase, ủ nhiệt độ phòng 15-30 phút (Thời gian ủ phụ thuộc vào mật độ tế bào, khuyến nghị thời gian ủ 15 phút, 20 phút 30 phút) Accumax phù hợp cho tế bào phát triển không gian 3D Tuy nhiên, người sử dụng lựa chọn phương pháp hóa chất thường dùng iii Collagenase: (thích hợp cho tế bào gốc) Pha loãng collagenase loại II (Thermo Scientific, Mã số 17.101) đến nồng độ cuối chứa 100 đơn vị /ml CaCl2 5mM hòa tan PBS Thêm 1ml collagenase ủ 15-30 phút (Lưu ý tối ưu thời gian ủ phù hợp) Protocol for CelCradle™ 500A Operation | Version 8|Page © ESCO Aster All Rights Reserved Protocol for CelCradleTM 500A Operation Gảy nhẹ vào đáy ống 10-20 lần Chuyển dung dịch vào ống 15ml Thêm ml PBS hút nhả dịch để lấy tế bào khỏi vật liệu mang Lặp lại bước Lặp lại bước lần (tổng số lần rửa với PBS) Ly tâm, loại bỏ dịch, trộn tế bào lượng nhỏ thể tích đếm tế bào với buồng đếm hồng cầu Tính số tế bào trung bình vật liệu mang Thuốc nhuộm CVD (Crystal Violet Dye) Lấy vật liệu mang từ bình ni cấy chuyển vào ống ly tâm 1,5ml Cho 0,5ml CVD vào ống Vortex ống 60 giây Ủ ống 37oC Vortex vài lần trình ủ Đếm nhân tính số tế bào trung bình vật liệu mang Lưu ý: Hóa chất nhuộm CVD cung cấp ESCO, catalog no.1400014 không phù hợp sử dụng cho tế bào gốc tiết lượng lớn chất ngoại bào (ECM) Đánh giá tăng sinh tế bào Thử nghiệm Prestoblue Lấy vật liệu mang từ bình ni cấy chuyển vào giếng khác đĩa 24 Cho vật liệu mang trống đặt vào giếng Cho 450µl mơi trường 50 µl Prestoblue vào giếng Ủ 37°C, 5% CO2 Cho 100µl mơi trường vào đĩa 96 giếng đọc giá trị huỳnh quang bước sóng kích thích 560 nm bước sóng phát xạ 590 nm máy đo quang phổ đo độ hấp thu bước sóng 570nm OD600 bước sóng tham chiếu Đo đối chứng để tính giá trị thực (loại bỏ giá trị nền) Tính lượng Glucose tiêu thụ Mơi trường thu từ bình ni cấy đo nồng độ Glucose thiết bị Glucell Giá trị Glucose đo thời điểm T N (Glucose TN) Khi thay môi trường, đo giá trị glucose lấy làm giá trị đối chứng gốc (Glucose T 0) Glucose tiêu thụ: Glucose T0 – Glucose TN Theo dõi pH Thu 2ml môi trường từ CelCradle để đo pH Thực đo sau thu môi trường từ CelCradle để đảm bảo pH không bị thay đổi điều kiện môi trường Protocol for CelCradle™ 500A Operation | Version 9|Page © ESCO Aster All Rights Reserved Protocol for CelCradleTM 500A Operation PHỤ LỤC B (KẾT QUẢ) Nhuộm tế bào sống Protocol for CelCradle™ 500A Operation | Version 10 | P a g e © ESCO Aster All Rights Reserved Protocol for CelCradleTM 500A Operation Nhuộm Hemotoxylin ngày khác Day Day Hợp lưu tế bào cao (MSCs) Protocol for CelCradle™ 500A Operation | Version 11 | P a g e © ESCO Aster All Rights Reserved Protocol for CelCradleTM 500A Operation Sinh trưởng tế bào (MSCs) Đánh giá khả sống tăng sinh tế bào Đánh giá khả sống tăng sinh tế bào Absorbance (OD 570) 0.14 Thử nghiệm Presto Blue (MSCs) 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 Day Protocol for CelCradle™ 500A Operation | Version 12 | P a g e © ESCO Aster All Rights Reserved Protocol for CelCradleTM 500A Operation Thử nghiệm MTT (MSCs) Absorbance (OD 570) 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Day Mức độ tiêu thụ Glucose (MSCs) Protocol for CelCradle™ 500A Operation | Version 13 | P a g e © ESCO Aster All Rights Reserved ... trường Protocol for CelCradle™ 500A Operation | Version 9|Page © ESCO Aster All Rights Reserved Protocol for CelCradleTM 500A Operation PHỤ LỤC B (KẾT QUẢ) Nhuộm tế bào sống Protocol for CelCradle™. .. vật liệu mang phủ lớp gắn kết tế bào Protocol for CelCradle™ 500A Operation | Version 4|Page © ESCO Aster All Rights Reserved Protocol for CelCradleTM 500A Operation Đặt nắp chai xanh có lọc đĩa... 12 Dừng trình cấy tỷ lệ bám đạt 90% Protocol for CelCradle™ 500A Operation | Version 5|Page © ESCO Aster All Rights Reserved Protocol for CelCradleTM 500A Operation Lưu ý: Tế bào MSC đạt tỉ lệ