Thông tin tài liệu
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐẶNG THỊ HUỲNH MAI KHẢO SÁT TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN TỔNG HỢP CHẤT KẾT TỤ SINH HỌC PHÂN LẬP TỪ CHẤT THẢI TRONG AO NUÔI CÁ TRA VÀ ỨNG DỤNG VÀO XỬ LÝ NƢỚC AO NUÔI CÁ TRA Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã ngành : 62 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐẶNG THỊ HUỲNH MAI KHẢO SÁT TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN TỔNG HỢP CHẤT KẾT TỤ SINH HỌC PHÂN LẬP TỪ CHẤT THẢI TRONG AO NUÔI CÁ TRA VÀ ỨNG DỤNG VÀO XỬ LÝ NƢỚC AO NUÔI CÁ TRA Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã ngành : 62 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS TS HÀ THANH TỒN PGS TS NGƠ THỊ PHƢƠNG DUNG 2015 Cơng trình hồn thành tại: Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ Trung tâm học liệu - Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Các báo công bố Đặng Thị Huỳnh Mai, Hà Thanh Toàn Cao Ngọc Điệp, 2013 Đa dạng di truyền vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học phân lập từ bùn đáy ao nuôi cá tra đồng sông Cửu Long Báo cáo khoa học (Proceedings) hội nghị Khoa học Cơng nghệ Sinh học tồn quốc 2013; Quyển 1: Cơng nghệ Gen, Cơng nghệ Enzyme Hóa sinh, Cơng nghệ sinh học Y - Dược, Công nghệ sinh học Động vật: 137-141 Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ Đặng Thị Huỳnh Mai, Hà Thanh Toàn Cao Ngọc Điệp, 2014 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học phân lập từ bùn đáy ao nuôi cá tra đồng sông Cửu Long môi trường polysaccharide ứng dụng vào xử lý nước ao nuôi cá tra quy mơ phịng thí nghiệm Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn - Kỳ 1- Tháng 4/2014 (số 7/2014): 69-76 Đặng Thị Huỳnh Mai, Hà Thanh Tồn Cao Ngọc Điệp, 2014 Tối ưu hóa ứng dụng vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học môi trường protein vào xử lý nước ao nuôi cá tra quy mơ phịng thí nghiệm Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 30(2014): 13-21 Chƣơng TỔNG QUÁT VỀ LUẬN ÁN 1.1 Tính cấp thiết đề tài Nuôi trồng, chế biến xuất thủy sản mạnh kinh tế đặc biệt đồng sông Cửu Long (ĐBSCL); đó, lồi thủy sản có tiềm lớn cá tra đạt sản lượng xuất nhiều lồi cá ni nước với nhiều mặt hàng chế biến đa dạng, phong phú Tuy nhiên, bên cạnh lợi ích kinh tế, việc ni cá tra cơng nghiệp có tác động tiêu cực lớn đến môi trường thức ăn dư thừa, chất thải q trình trao đổi chất, hóa chất sử dụng… lắng xuống, tích tụ lại đáy ao nhanh chóng chuyển hóa thành ammonium, nitrate, phosphate hợp chất khác gây ô nhiễm môi trường Theo nghiên cứu Châu Minh Khôi ctv (2012) hàm lượng N P hịa tan ao nuôi cá tra cao gấp nhiều lần so với quy chuẩn QCVN 08:2008/BTNMT Nếu nuôi cá tra với mật độ cao (40-50 con/m2), sử dụng hoàn toàn thức ăn cơng nghiệp lượng chất thải tích tụ ao nuôi lớn (Trương Quốc Phú Trần Kim Tính, 2012) Ngồi ra, theo Quyết định 3885/QĐ-BNN-TCTS (2014) quy hoạch đến năm 2020 diện tích ni cá Tra vùng 7.800 sản lượng khoảng 1,9 triệu Như thế, áp lực mơi trường cao có nhiều khó khăn chất lượng nguồn nước cấp khả tiêu Để xử lý nước, quy trình kết tụ sinh học đề nghị nhằm giúp loại bỏ tạp chất, tạo thuận lợi cho công đoạn xử lý sau với lợi điểm đầu tư sở hạ tầng ít, hiệu nhanh thân thiện với mơi trường Chất kết tụ sinh học có hiệu cao, khơng độc hại, phân hủy sinh học, không gây ô nhiễm thứ cấp, phạm vi ứng dụng rộng vi khuẩn tạo chất kết tụ dễ phát triển tăng sinh khối Tuy nhiên, hoạt tính chất kết tụ sinh học xác định chất di truyền sinh vật (Salehizadeh ctv., 2000), chịu ảnh hưởng yếu tố thành phần chất dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy, điều kiện mơi trường tạo chất kết tụ… Vì vậy, để có hiệu mong muốn, đề tài: “Khảo sát tính đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học phân lập từ chất thải ao nuôi cá tra ứng dụng vào xử lý nƣớc ao nuôi cá tra đồng sông Cửu Long” tiến hành nhằm tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả tạo kết tụ sinh học với tỉ lệ cao để ứng dụng vào xử lý nước ao ni cá tra, góp phần làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường nước ĐBSCL 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả tạo kết tụ sinh học với tỉ lệ cao, đồng thời khảo sát đa dạng di truyền vi khuẩn tuyển chọn - Xác định điều kiện phù hợp pH, chất dinh dưỡng, thời gian nuôi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn để kết tụ đạt tỉ lệ cao nhằm chọn số chủng, tổ hợp vi khuẩn có khả ứng dụng vào xử lý nuớc ao nuôi cá tra ĐBSCL 1.3 Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu Đề tài nghiên cứu vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học từ mẫu (nước+bùn đáy) ao nuôi cá tra 10 tỉnh/thành phố vùng ĐBCSL 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn luận án Luận án phân lập, tuyển chọn vi khuẩn có khả tạo kết tụ cao; xác định điều kiện phù hợp để kết tụ đạt hiệu nhất; đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn qua tính đa hình nucleotide thiết lập giản đồ phả hệ vi khuẩn tuyển chọn với chủng tương đồng di truyền Các kết đóng góp, bổ sung thông tin cho tài liệu tham khảo, giảng dạy cho nghiên cứu chuyên ngành sâu Trong thực tiễn, đề tài mở hướng ứng dụng vi khuẩn tạo kết tụ giúp giải nhu cầu xử lý nước ao ni cá tra, góp phần làm giảm nhiễm mơi trường nước 1.5 Những đóng góp luận án - Tuyển chọn số vi khuẩn có khả tạo kết tụ cao từ ao nuôi cá tra ĐBSCL Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn xác định chủng tương đồng di truyền kỹ thuật sinh học phân tử Khảo sát đa dạng di truyền vi khuẩn qua tính đa hình nucleotide dựa dấu phân tử SNP Thiết lập sơ đồ phả hệ thể mối tương quan vi khuẩn tuyển chọn với chủng tương đồng di truyền - Xác định điều kiện phù hợp giúp chủng vi khuẩn tuyển chọn đạt tỉ lệ cao Giới thiệu số chủng, tổ hợp vi khuẩn hiệu cao ứng dụng vào xử lý nước ao nuôi cá tra Chƣơng NỘI DUNG, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu Luận án thực với nội dung sau: 2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu Các thí nghiệm thực với thiết bị, dụng cụ hóa chất chun dụng phịng thí nghiệm Vi sinh vật Sinh học phân tử - Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ Sản phẩm PCR đoạn gen 16S rDNA chủng vi khuẩn gửi sang công ty MACROGEN Hàn Quốc để xác định trình tự đoạn DNA Ảnh chủng vi khuẩn tuyển chọn chụp qua kính hiển vi điện tử qt Phịng thí nghiệm Chuyên sâu - Trường Đại học Cần Thơ Hàm lượng TSS COD mẫu nước ao phân tích Trung tâm Kỹ thuật Ứng dụng Cơng nghệ - Sở Khoa học Công nghệ Thành phố Cần Thơ Phân tích tiêu Sinh-hóa Khoa Thủy sản - Trường Đại học Cần Thơ 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Thu mẫu xác định mật số Thu mẫu (nước + bùn đáy) ao nuôi cá tra 10 tỉnh ĐBSCL An Giang, Bến Tre, Cần Thơ, Đồng Tháp, Hậu Giang, Kiên Giang, Sóc Trăng, Tiền Giang, Trà Vinh, Vĩnh Long Ở tỉnh, thu từ 8-25 mẫu tùy theo số lượng ao nuôi cá Mẫu nước thu cách bờ ao từ m, cách mặt nước 0,5 m; mẫu bùn dùng gàu/lon múc mặt đáy Chứa riêng mẫu nước bùn đáy lọ nhựa 50 ml có nắp đậy, trữ lạnh 4oC phịng thí nghiệm Khi tiến hành phân tích trộn nước bùn đáy lại, khuấy đều, lấy dung dịch mẫu sử dụng Mẫu thu lần: lần vào mùa khô lần vào mùa mưa để so sánh phát triển mật số vi khuẩn theo mùa 2.3.2 Phân lập vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học Sử dụng mẫu thu vào mùa khô để phân lập vi khuẩn Vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học phân lập loại môi trường môi trường kết tụ protein (theo Hazana ctv., 2008; Bùi Thế Vinh, 2012) môi trường kết tụ polysaccharide (theo Deng ctv., 2003, Bùi Thế Vinh, 2012) Các khuẩn lạc vi khuẩn tạo chất kết tụ có bề mặt trơn, nhầy ướt Tái phân lập liên tục nhiều lần đến khuẩn lạc tách rời rõ đường cấy Sau kiểm tra độ rịng kính hiển vi, cấy chuyển sang ống, xem chủng riêng biệt trữ lại dùng cho thí nghiệm sau 2.3.3 Tuyển chọn vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao Mỗi chủng vi khuẩn phân lập nuôi môi trường trên, không bổ sung agar Chứa 50 ml dịch mơi trường bình tam giác, lắc máy với vận tốc 120-150 vòng/phút nhiệt độ phịng thí nghiệm 27oC (theo Gong ctv., 2008; Xia ctv., 2008) khoảng ngày Chuẩn bị dung dịch kaolin (5g/L) CaCl2 (1%) theo tỉ lệ 9:1 Chuẩn pH = Cho vào ống nghiệm 20 ml dung dịch kaolin (kaolin + CaCl2) 20µl dịch vi khuẩn nói (mật số ≥107 CFU/ml vi khuẩn kết tụ protein ≥108 CFU/ml vi khuẩn kết tụ polysaccharide) Mẫu đối chứng thực tương tự không chủng vi khuẩn Khuấy hỗn hợp giây máy khuấy giữ yên phút Lấy phần phía đo mật độ quang OD bước sóng 550 nm Mỗi nghiệm thức thực lần lặp lại Tính tỉ lệ kết tụ theo Deng ctv (2003) Tỉ lệ kết tụ % = OD đối ch ứng − OD (mẫu) OD (đối ch ứng ) x 100 Dựa vào tỉ lệ kết tụ, loại môi trường (kết tụ protein kết tụ polysaccharide) chọn vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao / tỉnh Tổng cộng có 10 vi khuẩn kết tụ protein 10 vi khuẩn kết tụ polysaccharide chọn 2.3.4 Nhận diện, dịnh danh chủng vi khuẩn tuyển chọn *Quan sát khuẩn lạc qua: màu sắc, hình dạng, độ nổi, kích thước Hình dạng, chuyển động vi khuẩn quan sát qua kính hiển vi quang học * Định danh vi khuẩn qua phân tích trình tự gen 16S rDNA - Tách chiết DNA theo quy trình Breugelmans Uyttebrock (2004) - Khuếch đại chuỗi gen 16S rDNA kỹ thuật PCR Sử dụng cặp mồi (primer) theo Gao ctv (2006), Gupta ctv.(1983): Mồi xuôi 37F : 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3’ Mồi ngược 1497R: 5’-ACGGCAACCTTGTTACGAGTT-3’ Tiến trình thực PCR: Thành phần hợp chất dùng kỹ thuật PCR: Thành phần H2O (cất lần) PCR buffer dNTP MgCl2 Đoạn mồi xuôi Đoạn mồi ngược BSA Taq DNA polymerase DNA Tổng Nồng độ 10X 1mM 10X 50ng/µl 50ng/µl 5U/µl 5U/µl 25ng/ml Thể tích (µl) 24,0 5,0 8,0 4,0 2,0 2,0 0,5 0,5 4,0 50,0 - Điện di sản phẩm PCR gel, ước lượng kích thước đoạn DNA Đun nóng 0,5 g agarose 40 ml TAE 1X cho tan hồn tồn Để nguội khoảng 50oC, cho 0,8 µl EtBr vào, lắc Đỗ vào khn để định hình tạo giếng, sau 90 phút sử dụng Trộn 10 µl mẫu DNA (đã qua PCR) với µl dung dịch tải giấy paraffin Cho dịch DNA thang chuẩn vào giếng mẫu DNA cần điện di vào giếng tiếp sau Tiến hành điện di hiệu 50-70 volt, khoảng 60 phút, dung dịch đệm TAE 1X Kết quan sát hệ thống máy chụp gel tia UV Kích thước band DNA vi khuẩn ước lượng dựa theo thang chuẩn - Giải trình tự DNA Sản phẩm PCR chuyển sang công ty MACROGEN (Hàn Quốc) để xác định trình tự đoạn gen DNA chủng vi khuẩn tuyển chọn - Định danh vi khuẩn tuyển chọn, xác định chủng tương đồng di truyền Trình tự đoạn DNA vi khuẩn so với trình tự DNA vi khuẩn lưu trữ ngân hàng gen NCBI tìm tỉ lệ tương đồng phần mềm BLAST N Bước đầu định danh vi khuẩn tuyển chọn xác định chủng tương đồng di truyền (2 chủng tương đồng/1 vi khuẩn) 2.3.5 Khảo sát đa dạng di truyền vi khuẩn tuyển chọn 2.3.5.1 Tính đa hình nucleotide chuỗi trình tự Các phần mềm BioEdit (Hall, 1999), Clustal W (Thompson ctv., 1994), MEGA 5.1(Tamura ctv., 2011) sử dụng để so sánh 10 chuỗi trình tự vi khuẩn tuyển chọn (trên loại môi trường) Căn vào dấu SNP nhận điểm tương đồng biến đổi trình tự ... VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐẶNG THỊ HUỲNH MAI KHẢO SÁT TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN TỔNG HỢP CHẤT KẾT TỤ SINH HỌC PHÂN LẬP TỪ CHẤT THẢI TRONG AO NUÔI CÁ TRA VÀ ỨNG DỤNG VÀO XỬ LÝ... muốn, đề tài: ? ?Khảo sát tính đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học phân lập từ chất thải ao nuôi cá tra ứng dụng vào xử lý nƣớc ao nuôi cá tra đồng sông Cửu Long” tiến hành nhằm... cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học phân lập từ bùn đáy ao nuôi cá tra đồng sông Cửu Long môi trường polysaccharide ứng dụng vào xử lý nước ao nuôi cá tra quy mơ phịng thí
Ngày đăng: 26/11/2022, 23:03
Xem thêm:
