Racemform von V aus; Einengen der Mutterlauge ließ noch weiteres inaktives V ausfallen; aus der Mutter lauge fiel nach starkem Einengen und auf Zugabe von Petroläther stark aktiviertes Material aus Vo[.]
R a c e m f o r m von V aus; Einengen der Mutterlauge ließ noch weiteres inaktives V ausfallen; aus der Mutterlauge fiel nach starkem Einengen und auf Z u g a b e von Petroläther stark aktiviertes Material aus V o n ca 50proz Aktivierung an lieferte erneutes Umkristallisieren aus Benzol audi ein optisch aktives Erstkristallisat: es wurde in weitere Fraktionierungen eingesetzt Das in Benzol sehr viel besser lösliche Mutterlaugen-Kristallisat wurde nunmehr aus Petroläther (Siedebereich 60 bis ° ) analog konsequent weiter fraktioniert Kieselgel-Chromatographie in Benzol und rasches Sublimieren (höchstens 0,1 g-Portionen!) bei ° und 0,001 T o r r gestattete die Abtrennung von den in den leichtest löslichen Fraktionen angereicherten Fremdbeimengungen, ohne daß Racemisation bemerkbar war Anschließendes viermaliges Umkristallisieren, zuletzt aus A l k o h o l , erbrachte keine Änderung der Schmelzpunkts- und Drehwerte mehr A u s insgesamt 70 g eingesetztem ( ± ) V wurden so direkt j e 0 m g der beiden V-Enantiomeren mit Höchstdrehung, ferner noch j e rund l g ( + ) - bzw ( - ) - M a t e r i a l mit [ a ] 405-Wer- ten von ( + ) - bzw ( - ) - 0 ° bis 1 0 ° isoliert Die Hauptmenge lieferte bei weiterer Fraktionierung auf beschriebenem W e g e grưßere Mengen der aktiven Formen Die Eigenschaften der höchstdrehenden Fraktionen sind in T a b angegeben Die thermische Racemisierung bei 120 — ° (i Vak eingeschmolzen) führte beide Enantiomeren wieder in die hochschmelzende R a c e m f o r m , Schmp ° , zurück Über die thermodynamischen Daten wird in Kürze berichtet a Die P M R - S p e k t r e n (in CS und CDC1 ) wurden im Varian D P 60 von Dr H F R I E B O L I N , Institut für Elektrowerkstoffe, Freiburg/Brsg., aufgenommen Die Drehwerte wurden im photoelektrisch arbeitenden Polarimeter der Fa C Zeiss, Oberkochen, bestimmt Der Firma R h o d i a c e t a A G , Freiburg (Dr H danken wir für die Überlassung des Celluloseacetats, den F a r b e n f a b r i k e n B a y e r AG und dem F o n d s d e r C h e m i s c h e n Industrie für die Unterstützung unserer Arbeiten WEIGAND) Zur Wirkung von substituierten a-Liponsäuren auf die Lipoamidoxidoreduktase *-Reaktion H W GOEDDE u n d W SCHLOOT Abteilung für Biochemische Genetik, Institut für Humangenetik und Anthropologie der Universität Freiburg/Br U SCHMIDT u n d J MALONE * * Chemisches Laboratorium der Universität Freiburg/Br ( Z Naturforschg 22 b, 0 — 3 [ ] ; e i n g e g a n g e n am 27 F e b r u a r 1967) The reactions of various recently synthesized analogous of a-lipoic acid (especially with fluoride as substituent) with lipoic acid dehydrogenase from pig heart muscle were investigated The influence of structural change on the reactivity of the various compounds, when reacting with lipoic acid dehydrogenase are discussed D i e p h y s i o l o g i s c h e H a u p t f u n k t i o n der L i p o n s ä u r e (1.2-Dithiolan-3-valeriansäure) ist die Coenzym- w i r k u n g b e i der o x y d a t i v e n D e c a r b o x y l i e r u n g a-Oxosäuren Die Liponsäureenzyme haben d e r e B e d e u t u n g bei T r a n s f e r - R e a k t i o n e n v o n gruppen von besonAcyl- (Abb 1) Die Pyruvatoxydase und die a-Oxoglutaratoxy- d a s e sind L i p o y l - P r o t e i n k o m p l e x e mit h o h e m M o l e k u l a r g e w i c h t , die durch O x y d a t i o n der a - O x o s ä u r e n d i e B i l d u n g v o n A c y l v e r b i n d u n g e n , z B des A c e t y l Coenzym A , ermöglichen Neben Coenzym A sind Thiaminpyrophosphat ( T P P ) , F A D , N A D u n d M g - I o n e n unmittelbar an * (E C d e n e n z y m a t i s c h e n U m s e t z u n g e n beteiligt D e r nach 1.6.4.3.) ** U SCHMIDT U J M A L O N E , Unveröffentlichte Versuche; J M A LONE, Dissertation der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Freiburg/Br 1967 H W GOEDDE, Z Vitaminforsch 3 , [1963] U SCHMIDT, P GRAFEN U H W GOEDDE, Angew Chem , 846 [1965] B M G U I R A R D , E E SNELL chemistry , [ ] U R G WILLIAMS, Arch Bio- O x y d a t i o n d e r a - O x o s ä u r e entstandene Acyl-lipoyl- K o m p l e x r e a g i e r t mit d e m C o e n z y m A ( A c y l t r a n s f e r durch L i p o y l t r a n s a c e t y l a s e ) ; anschließend w i r d reduzierte Liponsäure durch die die FAD-enthaltende L i p o a m i d o x i d o r e d u k t a s e w i e d e r zu L i p o n s ä u r e o x y diert ' - 10.1515/znb-1967-1213 Downloaded from De Gruyter Online at 09/12/2016 05:27:26AM via free access SH-CoA Acyl-S-CoA Abb Reaktionsschema zur Oxydation von Oxosäuren zu Acyl-Coenzym A I: Lipoyltransacetylase (E C 2.3.1.12.) II: Lipoamidoxidoreduktase (E C 1.6.4.3.) III: Decarboxylase W i e durch Arbeiten v o n et al , REED et al GUIRARD et al , KLINE und andere nachgewiesen w u r d e , ist die L i p o n s ä u r e f ü r viele M i k r o o r g a n i s m e n bekannt, denen zufolge ist Ausfallserscheinungen, wie z B Auch sind keine ist der be- vollständige Entzug v o n L i p o n s ä u r e durch Mangeldiät sehr schwer d u r c h f ü h r b a r , da L i p o n s ä u r e in der N a h r u n g weit verbreitet v o r k o m m t ; a u ß e r d e m w i r d diskutiert, d a ß Liponsäure durch die Darmflora zur sowie Substrat- notwendig Avitaminosen, Stoffwechselseitenwege könnten Andererseits Untersuchungen spezifität der L i p o a m i d o x i d o r e d u k t a s e mit Struktur- kannt, d i e b e i m Fehlen v o n L i p o n s ä u r e beschritten werden enzymatische analoga der L i p o n s ä u r e w u r d e n keine starken Inhi- unter L i p o n s ä u r e m a n g e l sind nicht beschrieben w o r den Bei diesen Wachstumstesten an S faecalis durch (Nr Substanz diese f ü r die E r n ä h r u n g h ö h e r e r Organismen ( N r 7, , und ) , o d e r inaktiv sind 13, 14, 15) ein W a c h s t u m s f a k t o r Bis jetzt sind j e d o c h keine Untersuchungen men gebildet werden bitoren e n t d e c k t , D i e in T a b 1, Abschnitt A , zus a m m e n g e f a ß t e n Daten zeigen, daß nur die 7-Methyll i p o n s ä u r e ( ) u n d die - T h i a - l i p o n s ä u r e ( ) 10 die R e d u k t i o n der D i h y d r o - l i p o n s ä u r e h e m m e n A n d e r e Analoga, wie die 2.4-Liponsäure sich inert o d e r zeigen (15), verhalten — w i e die - O x o - l i p o n s ä u r e ( ) oder dasLipoamid (5) — ähnliche Affinität zur L i p o a m i d o x i d o r e d u k t a s e w i e das p h y s i o l o g i s c h e Substrat Inzwischen sind weitere L i p o n s ä u r e - D e r i v a t e ent- k ö n n e E i n e andere Möglichkeit zu prüfen, o b L i p o n - wickelt s ä u r e f ü r h ö h e r e O r g a n i s m e n essentiell ist, besteht säure w u r d e n in - , - u n d 8-Stellung durch F l u o r - worden Die Kohlenstoffatome der Lipon- d a r i n , die W i r k u n g der L i p o n s ä u r e in v i v o aufzu- atome u n d / o d e r M e t h y l g r u p p e n substituiert: - F l u o r - heben V o n liponsäure ( ) , 7.7-Difluor-liponsäure ( ) , 8-Me- et al ' SCHMIDT wurden verschiedene strukturell abgeänderte L i p o n s ä u r e n hergestellt u n d thyl-7-fluor-liponsäure von fluor-liponsäure GOEDDE et al ' auf ihre Wirksamkeit getestet ( T a b ) Bei in vivo-Untersuchungen mit coccus faecalis w u r d e festgestellt, daß Liponsäurederivate das Wachstum dieser und 8-Methyl-7.7-di- Strukturanaloga zur a - L i p o n s ä u r e w u r d e n i m spek- einige trophotometrischen Test bezüglich ihrer Affinität zur Mutante L K L I N E U H A B A R K E R , J Bacteriol 60, 349 [1950] L J R E E D , P M JOHNSON U M E G E T Z E N D A N E R , J biol Chemistry 192, 851 [1951] U SCHMIDT, H A L P E S , J C LOEWENGUTH, P G R A F E N U Liebigs Ann Chem 666, 201 [1963] U S C H M I D T , P G R A F E N U H W G O E D D E , Liebigs Ann Chem 670, 157 [1963] GOEDDE, (18) ( s T a b 1, Abschnitt B ) Diese Strepto- f ö r d e r n ( T a b 1, N r 1, und 1 ) , andere es h e m - (19) Lipoamidoxidoreduktase und auf ihre Hemmwir- kung geprüft H.W 10 H W GOEDDE, C STAHLMANN, P GRAFEN U U SCHMIDT, Arch Mikrobiol 45, 359 [1963] H W G O E D D E , P G R A F E N U U S C H M I D T , Biochem Z 339, 23 [1963] A L Ü T T R I N G H A U S U D S O R G , unveröffentlichte Versuche; D S O R G , Dissertation der Naturwiss Fakultät d Universität Freiburg/Br 1961 - 10.1515/znb-1967-1213 Downloaded from De Gruyter Online at 09/12/2016 05:27:26AM via free access Abgewandelte Liponsäuren H C| S / z = H2C | HaC V Wachstum Nr H-Z-(CH2)4-COOH (1) H-Z-(CH2)4-CONH2 (5) H-Z-(CH2)4-CO-NH-CH2 (6) HO | CHsOH V V s Michaelis- Wechsel- Inhibitor- Art der Konstante zahl Konstante Hemmung [Mol/l • 10-3] • 103 Ki + 2,3 2,8 1,54 3,15 14,0 H3C Y I H2C -y CH-(CHo)4-COOH Y = C H - C H " I Y = CH-OH S Y = CO (7) (8) (9) \ / B 2,8 •10-3 - ++ H-Z-CH2-0-(CH2-C00H H—Z—CH —0 —(CH ) —CONH H-Z-CH2-CH(CH3)-(CH2)2-C00H H-Z-(CH2)2-S-CH2-C00H (10) (11) (12) (13) inert H-Z-C0-(CH2)3-C00H CH3-(CH2)3-Z-C00H (14) (15) inert inert H-Z-(CH2)3-CHF-C00H Y = CF2 (16) (17) 3,7 4,65 6.25 4.0 11,0 2,4 13,1 2,54 5,0 8,0 • 10- 0,96 3,2 9,87 3,6-10-3 H kompetitiv kompetitiv 1 F - C - -C-(CH2)4-C00H 1 H3CH-C /\ / X S F (18) - - 1I S / X 1 F—C 1 (19) C—(CH2)4—COOH - - 1 H3C-C S / V / H S Tab Wachstumstest an S faecalis und Untersuchungen zur Umsetzung von abgewandelter Liponsäure durch die Lipoamidoxidoreduktase Als einzige der untersuchten Fluor-liponsäuren Die durch Fluorsubstitution in 7-Stellung erreichte setzt Die Affinität dieser Substanz ( £ M 3,2 • ~ M ) reduktase wird wieder aufgehoben, wenn neben der entspricht ungefähr der des physiologischen Substra- Fluorsubstitution in Stellung am C-Atom der tes, der a-Liponsäure (KM 2,3 • - M) Eine Hemm- a-Liponsäure wirkung wird auf die enzymatische Reduktion der 8-MethyI-7-fluor-liponsäure ( ) und 8-Methyl-7.7- Liponsäure nicht ausgeübt Erfolgt die Substitution difluor-liponsäure durch Fluor am C-Atom in 7-Stellung ring) an beiden Wasserstoffatomen (Dithiolan(7.7-Difluor- Hemmwirkung auf Methylgruppen die (17) wird die 2-Fluor-liponsäure ( ) am Enzym umge- Lipoamidoxido- eingeführt Averden: (19) Nach den bisherigen Versuchen findet also nach Substitution im Dithiolanring durch eine oder meh- liponsäure, ) , so erfolgt keine Reduktion mehr rere Methylgruppen keine Umsetzung dieser am Enzym Andererseits wird der Umsatz des phy- bindungen am Enzym mehr statt (7, 18, ) ; Substi- siologischen Substrates Liponsäure nicht-kompetitiv tution in 7-Stellung durch eine Methylgruppe gehemmt (Ki 3,6" " ; s A b b ) dingt kompetitive Hemmung ( ) , w ährend nach Ein- - 10.1515/znb-1967-1213 Downloaded from De Gruyter Online at 09/12/2016 05:27:26AM via free access Verbe- f ü h r u n g einer M e t h y l g r u p p e in die Valeriansäure- kette die Aktivität a m E n z y m erhalten bleibt (12) F ü r die Umsetzung der a-Liponsäure durch Lipoamidoxidoreduktase stitution am C7-Atom dürfte von demnach besonderer die die Sub- Bedeutung sein: Substitution durch eine C H - G r u p p e führt zu einer kompetitiven Hemmung (7) Substitution durch eine H y d r o x y l g r u p p e b e d i n g t Inaktivierung (8) Nach E i n f ü h r u n g einer O x o g r u p p e erfolgt Um- satz wie b e i der a - L i p o n s ä u r e bei ähnlicher M i c h a e i s - Konstante ( £ M , - ~ M ) Abb Inhibitortest mit 7.7-Difluor-liponsäure; Testsystem: p M Titriplex III; mg Rinderserumalbumin; 0,6 jUM NADH; 0,5 ^ M NAD; 990 /uM Phosphatpuffer, pn 5,9; 10 y Diaphorase (B o e h r i n g e r ) ; 12,5 (I) /8,75 (II)/6,25 (III) •10~4 M a-Liponsäure; — 30-10~ M 7.7-Difluor-liponsäure;