KHẢO sát sự đa DẠNG DI TRUYỀN của nấm rhizoctonia solani gây BỆNH TRÊN cây BÔNG vải ở VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÊ VĂN HIỂU KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Rhizoctonia solani GÂY BỆNH TRÊN CÂY BÔNG VẢI Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC BẢO VỆ THỰC VẬT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Rhizoctonia solani GÂY BỆNH TRÊN CÂY BÔNG VẢI Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC BẢO VỆ THỰC VẬT Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS TỪ THỊ MỸ THUẬN LÊ VĂN HIỂU Niên khóa: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************* KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Rhizoctonia solani GÂY BỆNH TRÊN CÂY BÔNG VẢI Ở VIỆT NAM Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2002 – 2006 Sinh viên thực hiện: LÊ VĂN HIỂU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *************** KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Rhizoctonia solani GÂY BỆNH TRÊN CÂY BÔNG VẢI Ở VIỆT NAM Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS TỪ THỊ MỸ THUẬN LÊ VĂN HIỂU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com iii LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập trường Các thầy cô môn Công Nghệ Sinh Học thầy cô trực tiếp giảng dạy ln tận tình hướng dẫn, giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho suốt bốn năm qua ThS Từ Thị Mỹ Thuận tận tình hướng dẫn động viên suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp TS Bùi Minh Trí anh chị phụ trách phòng CNSH thuộc Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa- Sinh Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh tận tình giúp đỡ tơi thời gian làm đề tài KS Hồ Viết Thế; KS Vương Hồ Vũ; KS Nguyễn Thị Thùy Dương tận tình giúp đỡ hướng dẫn tơi thời gian thực khóa luận Tập thể lớp CNSH 28 hỗ trợ, động viên chia sẻ với vui buồn năm học qua Thành kính ghi ơn cha mẹ nuôi nấng, dạy bảo ngày hôm Chân thành cảm ơn Tp HCM, tháng 08 năm 2006 Sinh viên Lê Văn Hiểu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com iv TÓM TẮT LÊ VĂN HIỂU, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 “KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Rhizoctonia solani GÂY BỆNH TRÊN CÂY BÔNG VẢI Ở VIỆT NAM” Giáo viên hướng dẫn: ThS TỪ THỊ MỸ THUẬN Đề tài thực đối tượng nấm Rhizoctonia solani gây bệnh vải Việt Nam Đây tác nhân gây bệnh như: lở cổ rễ, chết rụi con, bệnh đốm cháy lá…gây thiệt hại đáng kể ảnh hưởng lớn tới suất cánh đồng trồng vải Việt Nam Chúng sử dụng kỹ thuật PCR – RFLP giải trình tự vùng ITS-rDNA nhằm mục tiêu khảo sát đa dạng di truyền 12 dòng R solani gây bệnh bơng vải Việt Nam, từ dễ dàng cho việc đưa biện pháp phòng trừ có hiệu bệnh nấm gây Đề tài thực phòng thực tập bệnh khoa Nơng Học, Trung tâm Phân tích Thí Nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, từ 13/02/2006 đến 15/08/2006 Nội dung nghiên cứu: Phục hồi 12 dòng nấm R solani gây bệnh vải Việt Nam Nhân sinh khối 12 dịng nấm R solani Ly trích DNA dòng nấm R solani Khuếch đại vùng ITS-rDNA 12 dòng nấm phản ứng PCR với cặp primer ITS4 - ITS5 Tiến hành phản ứng cắt vùng ITS-rDNA sau khuếch đại enzyme cắt giới hạn HaeIII, TaqI Phân tích đa dạng di truyền 12 dòng nấm dựa kết RFLP Tiến hành tinh sản phẩm PCR theo phương pháp cắt gel để đọc trình tự dịng nấm R solani Tiến hành đọc trình tự sản phẩm PCR vùng ITS-rDNA sau tinh cặp primer ITS1 - ITS4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com v Phân tích kết đọc trình tự vẽ phân nhánh di truyền Kết thu đƣợc: Phục hồi, nhân sinh khối ly trích DNA 12 dịng nấm R solani gây bệnh vải Khuếch đại thành cơng vùng ITS-rDNA 12 dịng nấm R solani phản ứng PCR, sản phẩm PCR có kích thước khoảng 720 bp Đã tiến hành cắt sản phẩm PCR vùng ITS-rDNA hai enzyme giới hạn HaeIII, TaqI Kết quả, khơng nhận thấy có đa dạng mặt di truyền 12 dòng nấm R solani thu thập vải cắt hai enzyme Đã tiến hành đọc trình tự so sánh vùng ITS1 dòng nấm với với dòng nấm sở liệu NCBI Kết dịng nấm chia làm nhóm:  Nhóm 1: BV-50-01, BV-71-02  Nhóm 2: BV-62-02, BV-62-03  Nhóm 3: BV-61-04, BV-61-05, BV-61-06, BV-62-01 Đã xác định nhóm tiếp hợp hai dịng BV-50-01 BV-62-02 AG-1-IA AG-4 Như vậy, có đa dạng mặt di truyền 12 dòng nấm R solani gây bệnh vải Việt Nam LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vi MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang bìa Trang tựa Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục vi Danh sách hình ix Danh sách bảng x Danh sách chữ viết tắt xi Phần I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Giới hạn đề tài Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu nấm Rhizoctonia solani 2.1.1 Đặc điểm hình thái 2.1.2 Đặc điểm sinh lý 2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy 2.2 Điều kiện phát sinh bệnh phạm vi ký chủ 2.3 Sự phân nhóm nấm R solani 2.4 Giới thiệu sơ lược vải 2.4.1 Triệu chứng bệnh vải nấm R solani gây 2.4.1.1 Bệnh lở cổ rễ 2.4.1.2 Bệnh chết rụi 2.5 Các phương pháp ứng dụng sinh học phân tử 2.5.1 Phương pháp PCR 2.5.1.1 Nguyên tắc phương pháp PCR LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vii 2.5.1.2 Các thành phần cần thiết để thực phản ứng PCR 2.5.1.3 Thực phản ứng PCR 2.5.1.4 Các nhân tố ảnh hưởng tới phản ứng PCR 2.5.1.5 Lợi ích phản ứng PCR 10 2.5.2 Phương pháp RFLP 10 2.5.2.1 Restriction endonuclease 10 2.5.2.2 Quy trình phương pháp RFLP 11 2.5.3 Phương pháp đọc trình tự 12 2.5.3.1 Nguyên tắc phương pháp đọc chuỗi mã Sanger 12 2.5.3.2 Nguyên tắc giải trình tự máy Sequencer 12 2.5.3.3 Đọc trình tự sản phẩm PCR 12 2.5.4 Một số phương pháp sử dụng xây dựng phả hệ 12 2.5.4.1 Phương pháp Neighbor – Joining 12 2.5.4.2 Phương pháp Maximum Parsimony 13 2.5.4.3 Phương pháp Bootstrap 13 2.6 Cơ sở việc sử dụng vùng ITS-rDNA nghiên cứu đa dạng di truyền nấm R solani 13 2.6.1 Giới thiệu vùng rDNA 13 2.6.2 Sử dụng vùng rDNA để nghiên cứu đa dạng di truyền 15 2.7 Một số nghiên cứu nước nước đa dạng di truyền nấm R solani 16 2.7.1 Nghiên cứu nước 16 2.7.2 Nghiên cứu nước 16 Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 19 3.1 Thời gian địa điểm 19 3.2 Nội dung đề tài 19 3.3 Nguồn nấm R solani 19 3.4 Phương pháp tiến hành 19 3.4.1 Phục hồi nhân sinh khối nấm R solani 19 3.4.2 Ly trích DNA tổng số nấm R solani 20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com viii 3.4.3 Khuếch đại vùng ITS-rDNA dòng nấm R solani 23 3.4.4 Điện di đọc kết PCR gel agarose 24 3.4.5 Các bước thực phản ứng đọc trình tự 25 3.4.5.1 Chuẩn bị khuôn DNA 25 3.4.5.2 Phản ứng đọc trình tự sử dụng BigDye Terminator V3.3 Cycle Sequencing Kit 26 3.4.5.3 Tinh sản phẩm khuếch đại 26 3.4.5.4 Chạy điện di ghi nhận tín hiệu máy sequence ABI PRISM 3100 27 3.4.6 Phân tích RFLP vùng ITS-rDNA dòng nấm R solani 27 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Phục hồi nhấn sinh khối nấm 28 4.2 Ly trích DNA tổng số nấm 28 4.3 Pha loãng DNA tổng số 29 4.4 Tiến hành phản ứng PCR 30 4.5 Phân tích RFLP vùng ITS-rDNA dòng nấm R solani 34 4.6 Đọc trình tự sản phẩm PCR 38 Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Đề nghị 46 Phần VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Phần VII PHỤ LỤC 49 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 36 C M 10 11 12 M Hình 4.6 Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng ITS-rDNA 12 dòng R solani enzyme hạn chế HaeIII C Đối chứng; M Ladder; BV-50-01; BV-50-02; BV-61-01; BV-61-02; BV-61-04; BV-61-05; BV-61-06; BV-62-01; BV-62-02; 10.BV-62-03; 11 BV-71-01; 12 BV-71-02 Với enzyme HaeIII, vùng ITS-rDNA 12 dòng nấm R solani gây bệnh vải cắt hai vị trí cắt tạo band có kích thước khoảng 510 bp, 120 bp, 90 bp Kết phù hợp với kết Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005), cắt hai dòng BV-61-02 BV-62-03 hai enzyme giới hạn TaqI HaeIII Như cắt enzyme TaqI, HaeIII, chúng tơi nhận thấy khơng có đa hình đoạn cắt giới hạn vùng ITS-rDNA 12 dòng nấm R solani phân lập vải Việt Nam Ảnh điện di cho kết không rõ ràng, band DNA mờ kể band DNA sản phẩm PCR đối chứng so với hình 4.3 4.4, ngun nhân dung dịch điện di thuốc nhuộm cũ, điều ảnh hưởng lớn phân tích kết RFLP LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 37 Các dòng nấm cho kiểu cắt RFLP giống cắt hai enzyme TaqI HaeIII, điều dịng thu thập đối tượng vải nên khơng có khác biệt mặt di truyền dòng, kỹ thuật điện di ảnh hưởng đến kết phân tích Vì vậy, chúng tơi thực bước đọc trình tự để khẳng định lại kết xác 4.6 Đọc trình tự sản phẩm PCR Trước tiến hành bước đọc trình tự vùng ITS-rDNA dịng nấm R solani, tiến hành tinh sản phẩm PCR Việc tinh phải đảm bảo thu nhận lại lượng sản phẩm PCR có mẫu, mặt khác sản phẩm thu phải có độ tinh cao để đảm bảo cho việc đọc trình tự tối ưu, tránh tượng nhiễu đọc Với quy trình tinh phương pháp cắt gel Amersham, nêu mục 3.4.5.1 thành công việc tinh sản phẩm PCR dòng nấm R solani Sản phẩm sau tinh điện di kiểm tra lại gel agarose 1,5% Trộn µl sản phẩm tinh + µl loading dye Điện di 50 V/ 60 phút M 720 bp Hình 4.7 Ảnh điện di sản phẩm PCR vùng ITS-rDNA dòng nấm R solani sau tinh BV-61-01; BV-61-04; BV-61-05; BV-61-06; M Ladder; BV-62-02; BV-71-02; BC-63 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 38 Sau tinh sạch, mẫu gửi đọc trình tự máy ABI PRISM 3100 Tuy nhiên, chưa có hóa chất đọc trình tự nên chúng tơi đọc trình tự tám dịng R solani cặp primer ITS1 ITS4 Vùng ITS-rDNA nấm bao gồm vùng bảo tồn 5,8S vùng bảo tồn ITS1 ITS2, phản ứng đọc trình tự với hai primer ITS1 ITS4 đọc trình tự vùng ITS1, 5,8S, ITS2 Vùng 5,8S vùng bảo tồn, giống tất dòng nấm, khơng có ý nghĩa lớn việc phân tích đa dạng mặt di truyền Vùng ITS1 ITS2 vùng biến động, biến thiên lồi, vùng ITS1 vùng có biến động so với vùng ITS2, định so sánh vùng ITS1 Vùng ITS1 dòng BV-50-01: aatgaggagt tgagttgttg ctggcctttt ctaccttaat ttggcaggag gggcatgtgc acaccttctc tttcatccat cacaccccct gtgcacttgt gagacagcaa tagttggtgg atttaattcc atcatccatt tgctgtctac ttaatttaca cacactcta cttaatttaa actgaatgta attgatgtaa cgcatctaat acta Vùng ITS1 dòng BV-61-04: aatgaggagt agagttgtag ctggccattt ttctggcaat gtgcacactc ttctctttca tccacacacc cctgtgcacc tgtgagacag ttacaaggnc attttggagt ttgggcaagt gtggagcttc attgcaaaac ttttccctcc ttctcttggc ttttgctgtc tactcaatta acatacaaac tctattaaat ttaaaacgaa tgtaattgat gtaacgcatc taatacta Vùng ITS1 dòng BV-61-05: aatgaggagt agagttgtag ctggccattt ttctggcaat gtgcacactc ttctctttca tccacacacc cctgtgcacc tgtgagacag ttacaaggtc attttggagt ttgggcaagt gtggagcttc attgcaaaac ttttccctcc ttctcttggc ttttgctgtc tactcaatta acatacaaac tctattaaat ttaaaacgaa tgtaattgat gtaacgcatc taatacta Vùng ITS1 dòng BV-61-06: aatgaggagt agagttgtag ctggccattt ttctggcaat gtgcacactc ttctctttca tccacacacc ctgtgcacct gtgagacagt tacaaggtca ttttggagtt tgggcaagt gtggagcttc attgcaaaac ttttccctcc ttctcttggc ttttgctgtc tactcaatta acatacaaac tctattaaat ttaaaacgaa tgtaattgat gtaacgcatc taatacta Vùng ITS1 dòng BV-62-01: aatgtaagag tttggttgta gctggcctct aattaacttg ggggcatgtg cacacctttc tctttcatcc catacacacc tgtgcacctg tgagacagat gttttctagg agggaaggaa ctttattgga cctactctcc ttggacttct gtctacttaa tctatataaa ctcaatttat tttaaaatga atgttatgga tgtaacacat ctaatacta LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 39 Vùng ITS1 dòng BV-62-02: aatgtaagag tttggttgta gctggcctct aattaacttg ggggcatgtg cacacctttc tctttcatcc catacacacc tgtgcacctg tgagacagat gttttctagg agggaaggaa ctttattgga cctactctcc ttggacttct gtctacttaa tctatataaa ctcaatttat tttaaaatga atgtaatgga tgtaacacat ctaatacta Vùng ITS1 dòng BV-62-03 aatgtagagt ttggttgtag ctggccccta attaacttgg gggcatgtgc acactctttc tctttcatcc catacacacc tgtgcacctg tgagacagat gttttctagg ggggaaggaa ctttattgga cctactctcc ttggactctc tgtctactta atctatataa actcaattta ttttaaaatg aatgtaatgg atgtaacaca tctaatacta Vùng ITS1 dòng BV-71-02 atgaggagtt gagttgttgc tggccttttct accttaattt ggcagggagg ggcatgtgc acaccttctc tttcatccat cacaccccctg tgcacttgtg agacagcaat agttggtgg atttaattcc atcatccatt tgctgtctact taatttacac acactctact taatttaaa ctgaatgtaa ttgatgtaac gcatctaatac ta Chúng tơi sử dụng chương trình ClustalX, gói phần mềm Clustal 1.83 để tiến hành so sánh trình tự vùng ITS1 tám dịng trên, từ kết so sánh phương pháp Bootstrap N – J Tree dựng phả hệ xác định mối quan hệ di truyền dòng BV-50-1-ITS1 AATG-AGGAGTTGAGTTGTTGCTGGCCTTTTCTACCTTAATTTGGCAGG-AGGGGCAT BV-71-02-ITS1 -ATG-AGGAGTTGAGTTGTTGCTGGCCTTTTCTACCTTAATTTGGCAGGGAGGGGCAT BV-61-06-ITS1 AATG-AGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCAATGTGCACACTCTTCTCTTTC BV-62-01-ITS1 AATG-AGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCAATGTGCACACTCTTCTCTTTC BV-61-05-ITS1 AATG-AGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCAATGTGCACACTCTTCTCTTTC BV-61-04-ITS1 AATG-AGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCAATGTGCACACTCTTCTCTTTC BV-62-02-ITS1 AATGTAAGAGTTTGGTTGTAGCTGGCCTCTAAT TAACTTGG -GGGCAT BV-62-03I-TS1 AATGTA-GAGTTTGGTTGTAGCTGGCCCCTAAT TAACTTGG -GGGCAT-*** * **** ***** ******* * * ** ** * * BV-50-1-ITS1 GTGCACACCTT-CTCTTTCATCCATCACAC -CCCCTGTGCACTTGTGAGACAGCAATA BV-71-02-ITS1 GTGCACACCTT-CTCTTTCATCCATCACAC -CCCCTGTGCACTTGTGAGACAGCAATA BV-61-06-ITS1 ATCCACACACC-CCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAGGTCATTTTGGAGTTTGGGCAA BV-62-01-ITS1 ATCCACACACC-CCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAGGTCATTTTGGAGTTTGGGCAA BV-61-05-ITS1 ATCCACACACC-CCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAGGTCATTTTGGAGTTTGGGCAA BV-61-04-ITS1 ATCCACACACC-CCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAGGNCATTTTGGAGTTTGGGCAA BV-62-02-ITS1 GTGCACACCTTTCTCTTTCATCCCATACAC ACCTGTGCACCTGTGAGACAGATGTT BV-62-03I-TS1 GTGCACACCTTTCTCTTTCATCCCATACAC ACCTGTGCACCTGTGAGACAGATGTT * ***** BV-50-1-ITS1 * * ** * * ** * * ** * *** * GTTGGTGGATTTAAT TCCATCATCCA -TTTGCTGTCTACTTAAT LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 40 BV-71-02-ITS1 GTTGGTGGATTTAAT TCCATCATCCA -TTTGCTGTCTACTTAAT BV-61-06-ITS1 GTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTTGGCTTTTGCTGTCTACTCAAT BV-62-01-ITS1 GTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTTGGCTTTTGCTGTCTACTCAAT BV-61-05-ITS1 GTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTTGGCTTTTGCTGTCTACTCAAT BV-61-04-ITS1 GTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTTGGCTTTTGCTGTCTACTCAAT BV-62-02-ITS1 TTCTAGGAGGGAAGGAACTTTATTGGACCTACTCTCCTTGGACT-T-CTGTCTACTTAAT BV-62-03I-TS1 TTCTAGGGGGGAAGGAACTTTATTGGACCTACTCTCCTTGGACTCT-CTGTCTACTTAAT * * * * * * * ********* *** BV-50-1-ITS1 TTACACACA CTCTACTTAATTTAAACTGAATGTAATTGATGTAACGCATCTAATACT- BV-71-02-ITS1 TTACACACA CTCTACTTAATTTAAACTGAATGTAATTGATGTAACGCATCTAATACTA BV-61-06-ITS1 TAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATTGATGTAACGCATCTAATACTA BV-62-01-ITS1 TAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATTGATGTAACGCATCTAATACTA BV-61-05-ITS1 TAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATTGATGTAACGCATCTAATACTA BV-61-04-ITS1 TAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATTGATGTAACGCATCTAATACTA BV-62-02-ITS1 CTATATAAA CTCAATTTATTTTAAAATGAATGTTATGGATGTAACACATCTAATACTA BV-62-03I-TS1 CTATATAAA CTCAATTTATTTTAAAATGAATGTAATGGATGTAACACATCTAATACTA * * * * *** * * * ****** ****** ** ******** *********** Dấu * biểu thị tương đồng tám dòng so sánh Tiến hành vẽ phân nhánh di truyền tám dòng so sánh theo phương pháp Bootstrap Neighbor-Joining: Hình 4.8 Cây Neighbor – Joining thể mối quan hệ di truyền dòng so sánh LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 41 Số bên cạnh nhánh phần trăm (%) tương đồng (congruent) nhóm 1000 lần phân tích (bootstrap) thử nghiệm Dựa vào kết so sánh trình tự vùng ITS1 phân nhánh di truyền, xác định phần trăm mức độ tương đồng dòng so sánh Mức độ tương đồng dòng thể bảng 4.1 Dòng 1: BV-50-1-ITS1 100 100 67 67 67 2: BV-71-02-ITS1 100 100 67 67 3: BV-61-06-ITS1 67 67 100 4: BV-62-01-ITS1 67 67 5: BV-61-05-ITS1 67 6: BV-61-04-ITS1 67 67 76 77 67 67 76 77 100 100 100 60 61 100 100 100 100 60 61 67 100 100 100 100 60 61 67 100 100 100 100 60 61 7: BV-62-02-ITS1 76 76 60 60 60 60 100 99 8: BV-62-03I-TS1 77 77 61 61 61 61 99 100 Bảng 4.1 Phần trăm mức độ tƣơng đồng dòng so sánh Dựa kết phân tích phân nhánh di truyền, chúng tơi thấy dịng chia làm ba nhóm:  Nhóm 1: BV-50-01 BV-71-02 với độ tương đồng vùng ITS1 100 %  Nhóm 2: BV-62-02 BV-62-03 với độ tương đồng vùng ITS1 99 %  Nhóm 3: BV-61-04, BV-61-05, BV-61-06, BV-62-01 với độ tương đồng vùng ITS1 100 % Sử dụng chương trình DNAPARS (DNA Parsimony) gói phần mềm Phylip 3.64, xác định phân nhánh di truyền tốt nhất, xác định khoảng cách di truyền nhóm, nhóm với dịng Khoảng cách di truyền thể bảng 4.2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 42 One most parsimonious tree found (một phân nhánh di truyền tốt xác định) +BV-62-03I+ | +BV-62-02-I + | | +BV-61-04-I | | | | + 2-BV-61-05-I | | | +BV-62-01-I | | | +BV-61-06-I | 1-BV-71-02-I | +BV-50-1-IT Nhóm 4 2 2 1 Nhóm/ Dịng Khoảng cách BV-62-03IBV-62-02-I BV-61-04-I BV-61-05-I BV-62-01-I BV-61-06-I BV-71-02-I BV-50-1-IT 0.155556 0.206944 0.009722 0.013889 0.280556 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.008333 0.004167 Bảng 4.2 Khoảng cách di truyền dịng Để xác định nhóm tiếp hợp (AG) dịng này, chúng tơi so sánh trình tự vùng ITS1 dịng với trình tự vùng ITS1 dòng AG chuẩn sở liệu NCBI website (http://www.ebi.ac.uk/) Tuy nhiên, xác định nhóm tiếp hợp dịng BV-50-01 BV-62-02 Dịng BV-50-01 có tương đồng cao (100 %) vùng ITS1 dòng mang mã số AB 122135, AF 308631 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 43 BV-50-01-ITS1 AF308631 AB122135 AATGAGGAGTTGAGTTGTTGCTGGCCTTTTCTACCTTAATTTGGCAGGAGGGGCATGTGC AATGAGGAGTTGAGTTGTTGCTGGCCTTTTCTACCTTAATTTGGCAGGAGGGGCATGTGC AATGAGGAGTTGAGTTGTTGCTGGCCTTTTCTACCTTAATTTGGCAGGAGGGGCATGTGC ************************************************************ BV-50-01-ITS1 AF308631 AB122135 ACACCTTCTCTTTCATCCATCACACCCCCTGTGCACTTGTGAGACAGCAATAGTTGGTGG ACACCTTCTCTTTCATCCATCACACCCCCTGTGCACTTGTGAGACAGCAATAGTTGGTGG ACACCTTCTCTTTCATCCATCACACCCCCTGTGCACTTGTGAGACAGCAATAGTTGGTGG ************************************************************ BV-50-01-ITS1 AF308631 AB122135 ATTTAATTCCATCATCCATTTGCTGTCTACTTAATTTACACACACTCTACTTAATTTAAA ATTTAATTCCATCATCCATTTGCTGTCTACTTAATTTACACACACTCTACTTAATTTAAA ATTTAATTCCATCATCCATTTGCTGTCTACTTAATTTACACACACTCTACTTAATTTAAA ************************************************************ BV-50-01-ITS1 AF308631 AB122135 CTGAATGTAATTGATGTAACGCATCTAATACTA CTGAATGTAATTGATGTAACGCATCTAATACTA CTGAATGTAATTGATGTAACGCATCTAATACTA ********************************* Dấu * biểu thị tương đồng dịng so sánh Hai dịng thuộc nhóm AG-1-IA, dịng BV-50-01 thuộc nhóm tiếp hợp AG-1-IA Dịng BV-62-02 có tương đồng cao vùng ITS1 dòng mang mã số DQ 102448 Đây dòng thuộc nhóm AG-4, dịng BV-62-02 thuộc nhóm tiếp hợp AG-4 BV-62-02-ITS1 AATGTAAGAGTTTGGTTGTAGCTGG-CCTCTAATTAACTTGGGGGCATGTGCACACCTTT DQ102448 AATGTA-GAGGTTGGTTGTAGCTGGGCCCCTAATTAACTTGGGGGCATGTGCACACCTTT BV-62-02-ITS1 CTCTTTCATCCCATACACACCTGTGCACCTGTGAGACAGATGTTTTCTAGGAGGGAAGGA DQ102448 CTCTTTCATCCCATACACACCTGTGCACCTGTGAGACAGATGTTTTCTAGGGGGGAAGGA ****** *** ************** ** ******************************* *************************************************** ******** BV-62-02-ITS1 CTTTATTGGACCTACTCTCCTTGGACTTCTGTCTACTTAATCTATATAAACTCAATTTTA DQ102448 ACTTTATTGGACCTACTCTCCTTGGACTTCTGTCTACTTAATCTATATAAACTCAATTTA ************************************************************ BV-62-02-ITS1 TTTTAAAATGAATGTAATGGATGTAACACATCTAATACTA DQ102448 TTTTAAAATGAATGTAATGGATGTAACACATCTAATACTA **************************************** Dấu * thể tương đồng dòng so sánh Các kết cho thấy có đa dạng di truyền dòng nấm R solani gây bệnh vải Việt Nam Kết khác với kết mà chúng tơi có phân tích RFLP 12 dịng nấm nêu mục 4.5 Tuy nhiên, chúng tơi sử dụng hai enzyme cắt TaqI, HaeIII, Schneider ctv (1997), xác định có 13 enzyme cho thấy đa hình đoạn cắt giới hạn nhóm tiếp hợp nấm R solani, nên cho kết chưa xác LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 44 Hạn chế: chúng tơi so sánh trình tự vùng ITS1, vùng ITSrDNA nấm bao gồm vùng ITS1, 5,8S ITS2 Ngoài vùng 5,8S bảo tồn tất dịng nấm nên khơng có ý nghĩa lớn phân tích đa dạng di truyền, vùng ITS2 vùng biến động nên vùng gây nên khác biệt mặt di truyền dịng nấm, kết chúng tơi chưa xác hồn tồn Chúng tơi bước đầu thành cơng việc phân nhóm dịng nấm trên, từ tạo điều kiện thuận lợi việc áp dụng biện pháp phòng trừ thích hợp dịng nấm để hạn chế gây hại chúng cánh đồng trồng vải Việt Nam LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 45 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Có thể giảm nồng độ Taq DNA polymerase xuống 0,03 UI, thực phản ứng PCR với thể tích 50 µl để tiết kiệm hóa chất thời gian mà thu sản phẩm PCR có chất lượng tốt Đã khuếch đại thành cơng vùng ITS-rDNA 12 dịng nấm R solani thu thập vải với cặp primer ITS4 ITS5, sản phẩm PCR 12 dịng khơng có khác biệt có kích thước khoảng 720 bp Khơng nhận thấy có đa hình 12 dịng nấm cắt sản phẩm PCR vùng ITS-rDNA hai enzyme cắt giới hạn TaqI, HaeIII Đã phân nhóm dịng nấm gây bệnh thành ba nhóm, xác định nhóm tiếp hợp (AG) hai dịng BV-50-01, BV-62-02 thuộc nhóm AG-1-IA AG4 5.2 Đề nghị Hồn thiện q trình điện di để q trình điện di ổn định hơn, từ xác định kết RFLP cách xác Thực phản ứng cắt vùng ITS-rDNA 12 dòng nấm với enzyme hạn chế khác theo đề nghị Schneider ctv (1997), để đánh giá xác đa dạng di truyền 12 dòng nấm R solani gây bệnh bơng vải Việt Nam Đọc trình tự lại tất dịng, kể dịng phân tích trên, phân tích kết đọc trình tự tồn vùng ITS-rDNA nhằm thu kết xác Do 12 dòng nấm R solani gây bệnh đối tượng vải, nên có tương đồng mặt di truyền cao Do đó, để xác định đa dạng di truyền dòng cách xác ta sử dụng phương pháp có xác cao để xây dựng phả hệ phương pháp Maximum Parsimony Methods… LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 46 PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 10 Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử: Những nguyên tắc chọn giống trồng NXB Nông Nghiệp, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Ngơ Việt Duy, 2005 Nghiên cứu khả chuyển nạp gen hai giống vải COKER312 VN36P vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Luận văn tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Thị Huệ, 2003 Khảo sát số đặc tính đánh giá đa dạng mẫu phân lập Rhizoctonia solani thu thập từ số ký chủ khác Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học Đại học Nơng Lâm, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Lê Tuấn Kiệt, 2005 Bước đầu đọc trình tự vùng ITS-rDNA nấm Rhizoctonia solani Kunh Luận văn tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Đức Lƣợng, 2001 Cơng nghệ sinh học NXB đại học quốc gia, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Đức Lƣợng ctv., 2002 Công nghệ gen NXB đại học quốc gia, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Vũ Triệu Mân Lê Lƣơng Tề, 1998 Giáo trình bệnh Nơng Nghiệp NXB Nơng Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam Ou S H., 1983 Bệnh hại lúa (Viện Bảo Vệ Thực Vật dịch) NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005 Sử dụng kỹ thuật RFLP khảo sát đa dạng di truyền nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều ký chủ khác Luận văn tốt nghiệp ngành Công Ngệ Sinh Học Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Trần Thị Thủy Tiên, 2005 Xác định trình tự vùng ITS-rDNA nấm Beauveria bassiana Vuille ký sinh côn trùng gây hại Luận văn tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Tiếng Anh 11 12 Carling D.E., and Sumner D.R., 1992 Rhizoctonia pp 157-165 In: Singlton L., Mihail J.D and Rush C.M (eds), Methods for research on soilborne phytopathologenic fungi APS Press, St Paul, Minnesota Carling D.E., Kuninaga., and Brainard K.A., 2001 Hyphal Anastomosis Reactions, rDNA-Internal Transcribed Spacer Sequences, and Virulence Levels Among Subsets of Rhizoctonia solani Anastomosis Group-2 (AG-2 ) and AG-BI Phytopathology 92: 43-50 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 47 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Kanematsu., and Naito., 1994 Genetic Characterization of Rhizoctonia solani AG-2-3 by Analyzing Restriction Fragment Length Polymorphisms of Nuclear Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacers Phytopathology 61: 18-21 Kuninaga., Natsuaki., Takeuchi., and Yokosawa., 1997 Sequency variation of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in Rhizoctonia solani Curr Genet (1997) 32: 237-234 Kuninaga., Carling., Takeuchi., and Yokosawa., 1999 Comparison of rDNAITS Sequences between Potato and Tobaco Strains in Rhizoctonia solani AG-3 Plant Pathology 66: 2-11 (2000) Lee S.B., and Taylor J.W., 1990 Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores, In: Weising K., Nybom H., Wolff K., and Meyer W., 1995, DNA fingerprinting in plants and fungi CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo.p 70-71 Liu Z.L., and Sinclair J.B., 1992 Genetic Diversity of Rhizoctonia solani anastomosis group Phytopathology 82: 778-787 Liu Z.L., and Sinclair J.B., 1993 Differentiation of intraspecific groups within anastomosis of Rhizoctonia solani using ribosomal DNA internal transcribed spacer and isozymecompairisions Can J Plant Phathol 15: 272-280 Priyatmojo A., Escopalao V E., Tangonan N G., Pascual C B., Suga H., Kageyama K., and Hyakumachi M., 2001 Characterization of new subgroup of Rhizoctonia solani Anastomosis Group ( AG-1-ID), Causal agent of necrotic leaf spot on coffe Phytopathology 91: 1054-1061 Schneider., Salazar., Rubio., and Keijer., 1997 Identification of Rhizoctonia solani associated with field-grown tulips using ITS rDNA polymorphism and pectic zymograms European Journal of Plant Pathology 103: 607-622 White T.J., Bruns T., Lee S., and Taylor J., 1999 Amplification and direct sequencing of fungal ribosome ARN genes for phylogenetics P 315-322 In: Innis M A., Gelfanhd D H., White J J (eds) PCR protocols, a guide to methods and applications Academic Press, New York Trang Web http://plantbio.berkeley.edu/~bruns/ http://www.vivisimo http://bugwood.org http://www.ncbi.nih.gov/ http://www.ebi.ac.uk/ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 48 PHẦN VII PHỤ LỤC 7.1 Danh sách dòng nấm Rhizoctonia solani đƣợc sử dụng đề tài Bảng 7.1 Danh sách dòng nấm R solani đƣợc sử dụng đề tài STT Tên dòng nấm Cây ký chủ Nơi thu thập BV-50-01 Bông vải Cư M Nga, Daklak BV-50-02 Bông vải Cư Jút, Daklak BV-61-01 Bông vải Sông Trầu, Thống Nhất, Đồng Nai BV-61-02 Bông vải Vĩnh Tân, Thống Nhất, Đồng Nai BV-61-04 Bông vải Vĩnh Tâm, Vĩnh Cửu, Đồng Nai BV-61-05 Bông vải Xã Lộ 25, Thống Nhất, Đồng Nai BV-61-06 Bông vải Cẩm Đường, Long Thành, Đồng Nai BV-62-01 Bơng vải Bình Thuận BV-62-02 Bông vải Ninh Thuận 10 BV-62-03 Bông vải Ninh Thuận 11 BV-71-01 Bơng vải Ơ Mơn, Cần Thơ 12 BV-71-02 Bông vải Phụng Hiệp, Cần Thơ ( Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Học, ĐHNL Tp HCM cung cấp) 7.2 Danh sách primer đƣợc sử dụng để nghiên cứu rDNA nhân nấm Bảng 7.2 Những trình tự primer trên vùng ITS 5,8S rDNA Những trình tự primer vùng ITS 5,8S rDNA ITS1 (Whi) TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 1769-1787(ssu) ITS1F (Gad) CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A 22 ITS2 (Whi) GCT GCG TTC TTC TTC ATC ATG C (sim To 5.8S) 20 ITS3 (Whi) GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC (sim To 5.8SR) 20 ITS4 (Whi) TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 20 60-41(lsu) 19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 49 ITS4B (Gad) CAG GAG ACT TGT ACA CGG TCC AG 23 ITS4S (Kre) CCT CCG CTT ATT GAT ATG CTT AAG 59-36(lsu) 24 ITS5 (Whi) GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G (sim to SR6R) 1745- 1766(ssu) 22 ITS5R CCT TGT TAC GAC TTT TAC TTC C 5.8S (Vil0) CGC TGC GTT CTT CAT CG 17 5.8SR (Vil0) TCG ATG AAG AAC GCA GC 18 SR6R (Vilu) AAG TAP AAG TCG TAA CAA GG 1747-1766(ssu) 20 LR1 (Vil0) GGT TGG TTT CTT TTC CT 73-57(lsu) 17 SLG-1 (Gro) TTG CGC AAC CTG CGG AAG GAT 1773-1793(ssu) 21 NS24R TAA AAG TCG TAA CAA GGT TT 1750-1769(ssu) 20 1766-1745(ssu) 22 Ssu ref Mankin et al., 1986 Gene 44:143-145 Lsu ref Lapeyre et al., 1993 Nucleic Acids Res 21:3322-3322 7.3 Kết giải trình tự vùng ITS1 dƣới dạng peak Hình 7.1 Trình tự dạng peak với primer ITS1 dòng BV-62-02 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 50 Hình 7.2 Trình tự dạng peak với primer ITS1 dòng BV-71-02 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... 8/2006 “KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Rhizoctonia solani GÂY BỆNH TRÊN CÂY BÔNG VẢI Ở VIỆT NAM? ?? Giáo viên hướng dẫn: ThS TỪ THỊ MỸ THUẬN Đề tài thực đối tượng nấm Rhizoctonia solani gây bệnh. .. ? ?Khảo sát đa dạng di truyền nấm Rhizoctonia solani gây bệnh vải Việt Nam? ?? LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2 Mục tiêu Nghiên cứu đa dạng di truyền dòng nấm R solani gây. .. CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *************** KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Rhizoctonia solani GÂY BỆNH TRÊN CÂY BÔNG VẢI Ở VIỆT NAM Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS