tìm hiểu sự biến đổi của cùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TÔ VŨ AN TÌM HIỂU SỰ BIẾN ĐỔI CỦA VÙNG LẶP LẠI THUỘC ORF94, ORF125 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) TẠI CÀ MAU LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TƠ VŨ AN TÌM HIỂU SỰ BIẾN ĐỔI CỦA VÙNG LẶP LẠI THUỘC ORF94, ORF125 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) TẠI CÀ MAU LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Th.s TRẦN THỊ TUYẾT HOA 2008 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Phần I: Giới thiệu Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Phần II: Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình ni tôm biển 2.1.1Trên giới 2.1.2 Việt Nam 2.1.3 Đồng sông Cửu Long 2.1.4 Cà Mau 2.2 Tình hình dịch bệnh nuôi tôm 2.2.1 Trên giới 2.2.2 Trong nước khu vực Đồng sông Cửu Long 2.3 Ảnh hưởng bệnh đốm trắng đến nghề nuôi tôm 2.4 Đặc điểm tác nhân gây bệnh đốm trắng 2.4.1 Tác nhân gây bệnh 2.4.2 Triệu chứng…… 2.4.3 Phương thức lây truyền loài cảm nhiễm 2.4.4 Chẩn đoán…………………………… 24.5 Phòng ngừa xử lý bệnh 2.4 Một số nghiên cứu bệnh đốm trắng 10 2.6 Kỹ thuật PCR ứng dụng 14 2.6.1 Quy trình 14 2.6.2 Những ứng dụng PCR 15 2.6.3 Hạn chế 15 Phần III: Vật liệu phương pháp nghiên cứu 16 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 16 3.2 Vật liệu nghiên cứu 17 3.2.1 Mẫu vật 17 3.2.2 Dụng cụ 17 3.2.2.1 Dụng cụ thu mẫu 17 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.2.2.2 Dụng cụ phân tích PCR 17 3.2.3 Hóa chất 17 3.2.3.1 Phân tích PCR 17 3.4 Phương pháp Nested-PCR 17 3.4.1 Qui trình ly trích DNA 18 3.4.2 Qui trình khuếch đại 18 3.4.3 Cách chuẩn bị phản ứng 18 3.4.4 Chạy điện di 18 3.4.5 Đọc kết 19 3.5 PCR-genotyping 19 3.5.1 PCR-Genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 19 3.5.1.1 Điều kiện phản ứng 19 3.5.1.2 Thành phần hóa chất tham gia phản ứng PCR-genotyping 19 3.5.1.3 Đọc kết 20 3.5.2 PCR-Genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 21 3.5.2.1 Điều kiện phản ứng 21 3.5.2.2 Thành phần hoá chất tham gia phản ứng PCR-genotyping 21 3.5.2.3 Đọc kết 22 Phần IV: Kết thảo luận 23 4.1 Kết xác định diện WSSV mẫu tôm 23 4.2 Kết phân tích PCR-genotyping 27 4.2.1 Kết PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 27 4.2.1.1 Phản ứng PCR-genotyping (ORF94) thực theo qui trình Trần Thị Mỹ Duyên, (2006) 27 4.2.1.2 Kết phân tích mẫu WSSV thu Cà Mau (PCR-genotyping-ORF94) 29 4.2.2 Kết PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 32 4.2.3 Mối liên hệ số vùng lặp lại thuộc ORF94 ORF125 35 Phần V: Kết luận đề xuất 37 5.1 Kết Luận 37 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5.2 Đề xuất 37 Phần VI: Tài liệu tham khảo 38 Phần VII: Phụ lục 42 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1: Thể tỉ lệ cảm nhiễm WSSV 25 Hình 4.2: Kết điện di sản phẩm PCR mẫu tơm ao có dấu hiệu đốm trắng Cà Mau gel 1% 25 Hình 4.3: Kết điện di kiểm tra 10 mẫu sau giảm thể tích 28 Hình 4.4: Kết điện di khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 mẫu WSSV thu Cà Mau 30 Hình 4.5: Kết điện di khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 mẫu thu Cà Mau 32 Hình 4.6: Kết điện di khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu WSSV thu Cà Mau 34 i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Thành phần nồng độ hoá chất thực phản ứng PCRgenotyping (ORF94) 20 Bảng 3.2: Thành phần nồng độ hoá chất thực phản ứng PCRgenotyping (ORF125) 21 Bảng 4.1: Một vài thông tin ao nuôi nhiễm WSSV mẫu tôm Cà Mau 26 Bảng 4.2: Cường độ nhiễm 10 mẫu kiểm tra 28 Bảng 4.3: Kết phân tích nhóm vùng lặp lại thuộc ORF94 ao tôm thu Cà Mau 29 Bảng 4.4: Kết qủa phân tích nhóm vùng lặp lại thuộc ORF125 ao tôm thu Cà Mau 33 Bảng 4.5: Kết PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 35 ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa tận tình dẫn suốt trình thực đề tài Chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Thủy Sản, bạn lớp BHTS NTTS K30 tận tình giúp đở suốt trình học tập làm luận văn Xin cảm ơn cha, mẹ, chị, em chổ dựa vững cho nghiệp tương lai thân Tác giả Tô Vũ An LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TĨM TẮT Cà Mau tỉnh có diện tích sản lượng tôm nuôi cao nước Nhưng năm gần tình hình dịch bệnh bùng phát nhiều nơi gây trở ngại người nuôi tôm bệnh đốm trắng tác nhân White Spot Syndrome Virus (WSSV) Theo nghiên cứu gần cho thấy WSSV có nhiều biến đổi mặt cấu trúc di truyền Nghiên cứu thực để tìm hiểu đặc điểm gen virut gây bệnh đốm trắng tôm sú nuôi Cà Mau khả ứng dụng vùng lặp lại thuộc ORF94 ORF125 nghiên cứu dịch tể học Virut gây bệnh đốm trắng Kết phân tích 60 mẫu tơm dương tính với WSSV 12 ao tổng số 24 ao thu Cà Mau sử dụng phương pháp PCRgenotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 ORF125 cho thấy có biến động cấu trúc di truyền WSSV tôm sú Cà Mau Kết cho thấy số vùng lặp lại gen WSSV ao khác Trong ao nhiễm WSSV số vùng lặp lại thường giống 9/12 ao ORF94 10/12 ao ORF125 Đối với ORF94 xác định nhóm vùng lặp lại (4 đến 10 vùng lặp lại) kiểu gen có 6, vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao 24,6% Cịn ORF125 có nhóm vùng lặp lại (từ đến vùng lặp lại) kiểu gen có vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao 47% Sự khác biệt vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 gen WSSV ao tôm bệnh đốm trắng cho thấy tồn nhiều kiểu gen WSSV khác có khả gây bệnh đốm trắng tơm Kết nghiên cứu ứng dụng nghiên cứu lan truyền phân bố WSSV, làm sở cho việc phòng ngừa kiểm soát bùng phát bệnh đốm trắng WSSV gây LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN I GIỚI THIỆU Cà Mau tỉnh nằm tận cực nam tổ quốc có ba mặt giáp biển hệ thống sơng ngịi chằng chịt nên thuận lợi cho nghề nuôi trồng thủy sản phát triển Từ đầu thập niên 80 nghề nuôi trồng thủy sản Cà Mau (đặc biệt nghề nuôi tôm sú) phát triển với hình thức ni qng canh truyền thống suất ni thấp Để tăng suất việc chuyển đổi từ hình thức ni qng canh truyền thống sang bán thâm canh thâm canh cần thiết Do hiệu kinh tế mà nghề nuôi tôm đem lại nên diện tích sản lượng tơm ni Cà Mau không ngừng tăng năm gần Xuất thủy sản xem ngành kinh tế mũi nhọn tỉnh khu vực Việc thâm canh hóa ni tơm sú khơng tăng suất mà làm tăng nguy bùng phát dịch bệnh Theo thống kê Bộ Thủy sản năm có hàng nghìn hecta ao ni tơm thương phẩm phải thu hoạch sớm bệnh 80% bệnh đốm trắng Đây bệnh nguy hiểm chúng có khả lây lan nhanh ao gây thiệt hại lớn (có thể gây chết đến 100% sau - 10 ngày nhiễm bệnh) mà cịn có khả lây lan qua khu vực lân cận qua nguồn nước hay loài giáp xác Nhưng mức độ gây hại chúng khác vùng vụ năm (có ao tơm bị nhiễm đốm trắng tơm chết nhanh có ao ni bị nhiễm đốm trắng tơm phát triển bình thường đến thu hoạch) Vấn đề có nhiều giả thiết đặt như: điều kiện mơi trường, quản lý chăm sóc sức khỏe tôm nuôi, tác nhân gây bệnh: biến đổi kiểu gen WSSV Do vậy, Đề tài: "Tìm hiểu biến đổi vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 virus gây bệnh đốm trắng tôm sú (Penaeus monodon) Cà Mau" thực LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com lại Đặc biệt mẫu 12e có hai vạch DNA có kích thước 399 bp, 561 bp ứng với số vùng lặp lại Kết kiểm tra cho thấy 10 mẫu cho kết rõ ràng vạch DNA sáng rõ nét, kể mẫu có vạch DNA tương ứng với hai vùng lặp lại Như sử dụng rộng rãi qui trình để xác định vùng lặp lại thuộc ORF94 WSSV cho kết tốt mà cịn giảm giá thành phản ứng 4.2.1.2 Kết phân tích mẫu WSSV thu Cà Mau (PCR-genotypingORF94) Mẫu tôm sú dùng nghiên cứu mẫu tơm có kết dương tính với WSSV phương pháp Nested-PCR (bộ kit IQ2000) 12 ao thuộc huyện Phú Tân (1 ao), Đầm Dơi (2 ao), Thới Bình (2 ao), Tắc Vân (3 ao), Tân Thành (4 ao) DNA ly trích từ tơm bị nhiễm WSSV sử dụng PCRgenotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 Bằng phương pháp PCR-genotyping sử dụng cặp mồi ORF94-F ORF94-R cho thấy có khác biệt số vùng lặp lại thuộc ORF94 gen WSSV ao thu ao Kết PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 mẫu tôm thu Cà Mau xác định kiểu gen WSSV tương ứng với 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 vùng lặp lại (Bảng 4.3) (Hình 4.4) Trong 6, vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao so với vùng khác 24,6%, tiếp sau vùng lặp lại chiếm 20,5%, vùng lặp lại chiếm 13,9%, vùng lặp lại chiếm 10,9%, 10 vùng lặp lại chiếm 3%, thấp có vùng lặp lại chiếm 1,5% 29 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 4.3: Kết phân tích nhóm vùng lặp lại thuộc ORF94 ao tôm thu Cà Mau Số vùng lặp lại thuộc ORF94 Số mẫu phân tích ao CM1 CM2 CM3 CM4 CM5 CM6 CM7 CM8 CM9 CM10 CM11 5 5 10 5 1 CM12 1 M 10 507 bp 453 bp Hình 4.4: Kết điện di khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 mẫu WSSV thu Cà Mau M: Thang DNA 1kb plus Giếng 1-5 thuộc ao CM1 có vùng lặp lại Giếng 6-10 thuộc ao CM2 có vùng lặp lại Kết đạt tương tự nghiên cứu Wongteerasupaya et al., (2003) xác định 12 kiểu gen WSSV Thái Lan nhờ vào số lần lặp lại trình tự 54 bp thuộc ORF94 từ đến 20 lần, lần lặp lại chiếm nhiều 32% Ngân hàng gen ghi nhận số vùng lặp lại WSSV Thái Lan WSSV Đài Loan vùng lặp lại Và Tran Thi Tuyet Hoa et al, (2005) nghiên cứu tôm nuôi Việt Nam phương pháp PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 cho kiểu gen WSSV phân lặp tơm bệnh đốm trắng có số vùng lặp lại từ đến vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao 30 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Theo kết nghiên cứu Lê Vân Hải Yến, (2006) xác định số vùng lặp lại thuộc ORF94 mẫu tôm thu Sóc trăng 5, 7, 8, 12, kiểu gen có vùng lặp lại chiếm nhiều 50%, Trà Vinh 5, 8, vùng lặp lại kiểu gen có vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao 57,1%, khơng có mẫu có vùng lặp lại Kết có khác biệt lớn kết nghiên cứu Triệu Thanh Tuấn, (2006) sử dụng PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 mẫu tôm thu Cà Mau Bạc Liêu phân lập kiểu gen tương ứng WSSV, từ đến 16 vùng lặp lại kiểu gen có vùng lặp lại chiếm tỷ lệ cao (48,8% Bạc liêu, 68,4% Cà Mau) khơng có mẫu có 6, vùng lặp lại mẫu tôm thu Bạc Liêu vùng lặp lại mẫu tôm thu Cà Mau Pradeep et al., (2007), sử dụng ADN ly trích từ tơm hậu ấu trùng, tơm ni có nhiễm WSSV Ấn Độ để xác định số vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94, ORF125 Đối với ORF94, có 13 kiểu gen tìm thấy với số vùng lặp lại từ đến 16 Trong vùng lặp lại chiếm cao 11,3% khơng có mẫu có số vùng lặp lại 11 lần 15 lần tìm thấy Theo bảng 4.1 cho thấy ao CM1, CM3, CM4 thuộc xã Tân Thành, thành phố Cà Mau ao gần Trong CM1 thả giống miền Trung, CM3, CM4 có nguồn giống Cái Nước Khi so sánh số vùng lặp lại ao tôm nhiễm WSSV cho thấy ao CM1, CM3, CM4 có vùng lặp lại Kết dự đốn bệnh đốm trắng tơm sú ao kiểu gen WSSV Trong trường hợp WSSV lây nhiễm theo chiều ngang ao vùng Theo Bùi Quang Tề, (2003) cho WSSV lây nhiễm chủ yếu theo chiều ngang Hai ao CM6, CM7 thu ngày, thuộc xã Hồ Thị Kỹ huyện Thới Bình, có số vùng lặp lại khác Theo bảng 4.1 hai ao có nguồn giống khác nhau, ao CM6 thả giống miền Trung, ao CM7 thả giống Gành Hào Kết cho thấy bệnh đốm trắng hai ao có kiểu gen khác nhau, trường hợp WSSV lây truyền qua nguồn tơm giống Theo Tran Thi Tuyet Hoa et al., (2005) cho nguồn gốc lây 31 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com nhiễm bùng phát dịch bệnh đốm trắng tôm từ giáp xác tự nhiên mà từ nguồn giống M 10 615 bp 453 bp Hình 4.5: Kết điện di khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 mẫu WSSV thu Cà Mau Giếng M thang DNA 1kb plus (invitrogen).Giếng 1, 2, thuộc ao CM4 ( giếng có vạch tương ứng vùng lặp lại) Giếng 4,5, thuộc ao CM9 Giếng 7, 8, 9, 10 thuộc ao CM12 (giếng có vạch tương ứng với vùng lặp lại) Trong ao số vùng lặp lại hồn tồn giống 9/12 ao có ao có số vùng lặp lại khác CM4, CM6, CM12 (Hình 4.5) Như bệnh đốm trắng tôm ao cảm nhiễm kiểu gen WSSV (9/12 ao) Đôi ao số vùng lặp lại khác tức có biến đổi kiểu gen WSSV tồn hai vùng lặp lại gen Có trường hợp mẫu có vùng lặp lại thuộc ORF94 (5/60 mẫu) nghĩa tơm có diện hai kiểu gen WSSV Theo Tran Thi Tuyet Hoa et al., (2005) cho cảm nhiễm lúc nhiều kiểu gen WSSV tôm sú phổ biến 4.2.2 Kết PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 Mẫu tôm sú dùng nghiên cứu mẫu tơm có kết dương tính với WSSV phương pháp Nested-PCR (bộ kit IQ2000) 12 ao thuộc huyện Phú Tân (1 ao), Đầm Dơi (2 ao), Thới Bình (2 ao), Tắc Vân (3 ao), Tân Thành (4 ao) DNA ly trích từ tơm bị nhiễm WSSV sử dụng PCRgenotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 tiếp tục sử dụng PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 32 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết phân tích PCR-genotyping sử dụng cặp mồi ORF125-flank Forward ORF125-flank Reverse khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 60 mẫu dương tính với WSSV kiểm tra phương pháp Nested-PCR cho thấy có khác số vùng lặp lại gen WSSV ao thu ao (Bảng 4.4), (Hình 4.6) Kết PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu tôm thu Cà Mau xác định kiểu gen WSSV có (4, 5, 6, 7, vùng lặp lại) với tỉ lệ tương ứng 19%, 24%, 47%, 1,3%, 8,7% Tuy có khác biệt số vùng lặp lại mẫu tôm ao, ao, số tất mẫu phân tích kiểu gen có vùng lặp lại xuất nhiều nhất, chiếm tỉ lệ cao 47% thấp có vùng lặp lại chiếm 1,3% so với vùng lặp lại khác Bảng 4.4: Kết phân tích nhóm vùng lặp lại thuộc ORF125 ao tôm thu Cà Mau Số vùng lặp lại thuộc ORF125 Số mẫu phân tích ao 2 5 5 10 11 12 5 5 Kết phù hợp với nghiên cứu Bui Thi Minh Dieu et al., (2004) sử dụng cặp mồi ORF125-flank Forward ORF125-flank Reverse khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 phân lặp dòng WSSV mẫu tôm thu miền Trung, Việt Nam tương ứng với số vùng lặp lại 5, 6, Tuy nhiên kết có phần khác biệt so với kết nghiên cứu Pradeep et al., (2007), sử dụng ADN ly trích từ tơm hậu ấu trùng, tơm ni có nhiễm WSSV Ấn Độ để xác định số vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94, ORF125 Đối với ORF125, có 11 kiểu gen khác tìm thấy với số vùng lặp lại từ đến 14 Trong số lần 33 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com lặp lại tìm thấy nhiều lần chiếm 47,1%, khơng tìm thấy mẫu có số vùng lặp lại lần 13 lần M 583bp 10 652 bp Hình 4.6: Kết điện di khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu WSSV thu Cà Mau Giếng M thang DNA 1kb Plus Giếng 1-5 thuộc ao CM7 có vùng lặp lại Giếng 6-10 thuộc ao CM8 có vùng lặp lại Ngồi ra, ao số vùng lặp lại mẫu giống (10/12 ao nhiễm WSSV) Đơi ao lại có khác biệt số vùng lặp lại thuộc ORF125 ao CM2, CM4 điều cho thấy có hai kiểu gen khác WSSV Cũng có mẫu lại song song tồn hai vùng lặp lại thuộc ORF125 8/60 mẫu, điều cho thấy hai dịng virut cơng tơm Như cho thấy ao tồn nhiều vùng lặp lại thuộc ORF125 tức có khác biệt kiểu gen WSSV hay nói ao tồn nhiều dịng WSSV gây bệnh cho tơm ni Theo Tran Thi Tuyet Hoa et al., (2005) cho cảm nhiễm lúc nhiều kiểu gen WSSV tôm sú phổ biến 34 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.2.3 Mối liên hệ số vùng lặp lại thuộc ORF94 ORF125 Bảng 4.5: Kết PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 Số ao phân tích PCR-genotyping CM1 CM2 Số vùng lặp lại thuộc ORF94 Số vùng lặp lại thuộc ORF125 vùng lặp lại vùng lặp lại CM3 vùng lặp lại CM4 mẫu có vùng lặp lại mẫu có 10 vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại CM5 CM6 vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có 10 vùng lặp lại vùng lặp lại vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại CM7 CM8 CM9 CM10 CM11 CM12 vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại vùng lặp lại vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại vùng lặp lại vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại Trong ao CM2, CM3 số vùng lặp lại thuộc ORF125 khác (ao CM2 có 5, 6, vùng lặp lại, ao CM3 có vùng lặp lại) đơi có hai vùng lặp lại mẫu Như tơm nhiễm hai dòng WSSV khác (hiện tượng nhiễm kép) Theo Tran Thi Tuyet Hoa et al., (2005) 35 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com cho cảm nhiễm lúc nhiều kiểu gen (genotype) WSSV tôm sú phổ biến Trong số vùng lặp lại hai ao CM2 CM3 thuộc ORF94 lại hồn tồn giống (ao CM2 có vùng lặp lại, CM3 có vùng lặp lại) điều cho thấy có biến đổi số vùng lặp lại thuộc ORF125 mà số vùng lặp lại thuộc ORF94 không thay đổi, ao tồn hai dòng WSSV mà số vùng lặp lại thuộc ORF125 khác cịn số vùng lặp lại thuộc ORF94 giống ngược lại Các ao CM2, CM7, CM10 có số vùng lặp lại thuộc ORF94 giống có vùng lặp lại số vùng lặp lại thuộc ORF125 ao khác (ao CM2 có vùng lặp lại, CM7 có vùng lặp lại, CM 10 có vùng lặp lại) ngược lại ao CM1, CM5, CM8 có số vùng lặp lại thuộc ORF125 giống số vùng lặp lại thuộc ORF94 lại khác ao Kết giống với nghiên cứu Pradeep et al., (2007), sử dụng ADN ly trích từ tơm hậu ấu trùng, tơm ni có nhiễm WSSV, đồng thời sử dụng tôm tự nhiên cua Ấn Độ Nghiên cứu tìm hiểu thay đổi vùng lặp lại WSSV tìm trước đây, bao gồm ORF94, ORF125 ORF75 Kết nghiên cứu cho thấy mẫu có số lần lặp lại ORF có số lần lặp lại khơng giống hai ORF khác 36 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết Luận Xác định có nhóm vùng lặp lại thuộc ORF94 (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 vùng lặp lại) nhóm vùng lặp lại thuộc ORF125 (4, 5, 6, 7, vùng lặp lại) Kiểu gen WSSV có 6, vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao 24,6% ORF94 ORF125 kiểu gen có vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao 47% Số vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 gen WSSV thời điểm thu mẫu, ao khác khác Trong ao số vùng lặp lại gen WSSV thường giống (9/12 ao ORF94, 10/12 ao ORF125), mẫu tồn hai vùng lặp lại (5/60 mẫu ORF94 8/60 mẫu ORF125) Sự khác biệt vùng lặp lại gen WSSV ao tôm bệnh đốm trắng cho thấy, tồn nhiều kiểu gen WSSV khác có khả gây bệnh đốm trắng tôm 5.2 Đề xuất Sử dụng phương pháp PCR-genotyping mẫu tôm sú bố mẹ, sú giống, lồi giáp xác ao nhiễm WSSV để tìm hiểu đường lan truyền phân bố kiểu gen WSSV Thử nghiệm gây cảm nhiễm kiểu gen WSSV khác nhằm xác định độc lực virus gây bệnh đốm trắng 37 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Báo Thương Mại, 2008 Xuất thủy sản Việt Nam nhanh chóng vượt kế hoạch năm 2007 (http://www.baothuongmai.com.vn/article.aspx?article_id=48873) Ngày truy cập 20/02/2008 Bùi Quang Tề, 2003 Bệnh tơm ni biện pháp phịng trị Nhà xuất Nơng Nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh Bùi Quang Tề, 2006 Bệnh học thuỷ sản NXB nông nghiệp, Hà Nội Bui Thi Minh Dieu., Marks, H., Siebenga, J J., Goldbach, R W., Zuidema, D., Duong, T P & Vlak, J M 2004 Molecular epidemiology of White spot syndrome virus within Vietnam J Gen Virol 85:3607-3618 Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007 Bài giảng Nguyên lý kỹ thuật chẩn đoán bệnh Trường Đại học Cần Thơ Huỳnh Văn Tùng, 2006 Đánh giá thông tin liên quan tới quản lý sức khỏe tôm sú (Penaeus monodon) nuôi ĐBSCL Luận văn tốt nghiệp đại học Trường Đại học Cần Thơ Hứa Quyết Chiến, 2004 Bước đầu nghiên cứu thử nghiệm ảnh hưởng chế phẩm SH99 đến khả phòng bệnh virut (WSSV, MBV) cho tôm sú http://www.vietlinh.com.vn/tech/disease/SH.htm Lê Như Nguyệt, 2004 Ứng dụng so sánh phương pháp phát virus đốm trắng (WSSV) tôm sú (Penaeus monodon) kỹ thuật PCR Luận văn tốt nghiệp đại học Trường Đại học Cần Thơ Lê Xuân Sinh, 2003 A Bio-economic Model of a shrimp hatchery in the Mekong River Delta of Vietnam Luận án tiến sĩ Kinh tế nông nghiệp- Đại học Sydney, Autralia 10 Lê Xuân Sinh, 2005 Bài giảng Kinh tế thuỷ sản Trường Đại học Cần Thơ 11 Lê Vân Hải Yến, 2006 Tìm hiểu mối quan hệ kiểu gen WSSV với bệnh đốm trắng tơm sú (P monodon) ni Sóc Trăng Trà Vinh Luận văn tốt nghiệp đại học Trường Đại học Cần Thơ 12 Lightner DV, 1996 A handbook of pathology and diagnostic procedures for diseases of penaeid shrimp World aquaculture Society, Baton Rouge, LA 13 Lo, C.F., C.H Ho, S.E Peng, C.H Chen, H.C Hsu, Y.L Chiu, C.F Chang, K.F Lin, M.S Su, M.S Wang, and G.H Kou 1997 White spot syndrome 38 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com baculovirus (WSBV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other arthropods Dis Aquat Ogr, 27:215-225 14 Marks H, Josyanne J A van Duijse, Zuidema D and Hulten W C, 2005 Fitness and virulence of ancestral white spot syndrome virus isolate from shrimp Virus research 110, 9-20 15 Nguyễn Anh Tuấn, 1995 Hiện trạng, thử thách tiềm nghề nuôi tôm biển giới Việt Nam Hội thảo quản lý dịch bệnh nuôi tôm ĐBSCL 16 Nguyễn Minh Niên, 2004 Hiện trạng nuôi trồng thuỷ sản tỉnh ven biển ĐBSCL Viện NC NTTS II 17 Nguyễn Văn Hảo, 2003 Quản lý sức khỏe tôm nuôi Nhà xuất Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh 18 Nguyễn Văn Hảo, 2004 Một số bệnh thường gặp tôm sú (Penaeus monodon) Các phương pháp chẩn đốn phịng trị Nhà xuất Nơng Nghiệp, TP Hồ Chí Minh 19 Nguyễn Tiến Hưng, 2008 Đất rừng phương Nam: Nuôi tôm sinh thái cho rừng thêm xanh (Kỳ 5) http://www.thiennhien.net/news/140/ARTICLE/5809/2008-06-16.html Ngày truy cặp 05/07/2008 20 Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003 Ứng dụng kỹ thuật mô bệnh học chẩn đốn bệnh đốm trắng tơm sú (P monodon) Luận văn tốt nghiệp đại học Trường Đại học Cần Thơ 21 Phùng Văn, 2005 Năm 2010: Cà Mau xuất tôm đạt tỷ USD http://www.bannhanong.com/home.php?cat_id=13&id=1238&kh= Ngày truy cập 05/07/2008 22 Pradeep B, Shekar M, Gudkovs N, Karunasagar I, Karunasagar I, 2007 Genotyping of white spot syndrome virus prevalent in shrimp farms of India Diseases of Aquatic Organisms 78:189-198 23 Sarathi M, Martin C S, Venkatesan C, Sahul Hameed A S 2007 Oral Administration of Bacterially Expressed VP28dsRNA to Protect Penaeus monodon from White Spot Syndrome Virus 24 Sở Thủy Sản Bạc Liêu, 2005 Báo cáo tổng kết tình hình thực kế hoạch phát triển ngành thủy sản 25 Sở Thủy Sản Sóc Trăng, 2005 Báo cáo tổng kết tình hình thực kế hoạch phát triển ngành thủy sản 26 Sở Thủy Sản Sóc Trăng, 2007 Báo cáo tổng kết năm 2007, kế hoạch khuyến ngư 2008 39 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 27 Tạp chí khuyến ngư Việt Nam số 45 28 Trần Diệu Thắng, 2006 Khảo sát quản lý dịch bệnh nuôi tôm sú (P monodon) thâm canh tỉnh Bạc Liêu Luận văn tốt nghiệp đại học Trường Đại học Cần Thơ 29 Trần Ngọc Hải, 2004 Giáo trình kỹ thuật sản xuất giống ni giáp xác Trường Đại Học Cần Thơ 30 Trần Thị Mỹ Duyên, 2006 Ứng dụng kỹ thuật PCR-genotyping nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) Luận văn tốt nghiệp đại học Trường Đại học Cần Thơ 31 Tran Thi Tuyet Hoa, R A Hodgson, D T Oanh, N T Phuong, N J Preston, and P K Walker 2005 Genotypic variations in tandem repeat DNA segments between ribonucleotide reductase subunit genes of white spot syndrome virus (WSSV) isolates from Vietnam In P Walker, R Lester and M G BondadReantaso (eds) Disease in Asian Aquaculture V.pp339-351 Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila 32 Trần Thị Tuyết Hoa, 2004 Bài giảng Bệnh virus động vật thuỷ sản Trường Đại học Cần Thơ 33 Trần Thị Tuyết Hoa, 2004 Bài giảng Sinh học phân tử Trường Đại học Cần Thơ 34 Triệu Thanh Tuấn, 2006 Khảo Sát mối quan hệ kiểu gen WSSV với bệnh đốm trắng tôm sú (P monodon) nuôi Bạc Liêu Cà Mau Luận văn tốt nghiệp đại học Trường Đại học Cần Thơ 35 Tuyết Anh, 2008 Cà Mau: 39.000 tôm nuôi bị chết http://www.vietlinh.com.vn/dbase/VLTTShowContent.asp?ID=6306 Ngày truy cập 05/07/2008 36 Wang A L, W.-N Wang, L Sun, F.C Li,M.S Guo, L Su and X.M Zhai, 2000 Morphogenesis and Ultrastructure of a Baculovirus in the Juveniles of Penaeus chinensis Asian Fisheries Science 15:229-237 37 Okumura T, Nagai F, Yamamoto S, Oomura H, Inouye K, Ito M and Sawada H, 2003 Detection of white spot syndrome virus (WSSV) from hemolymph of Penaeid shrimps Penaeus japonicus by reverse passive latex agglutination assay using high-density latex particles 38 Vaseeharan B, Jayakumar R and Ramasany P, 2003.PCR-based detection of white spot syndrome virus in cultured and captured crustaceans in Indian Letter in Applied Microbiology, p37, 443, 447 40 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 39 Vlak, J.M., J R Bonami, T W Flegel, G H Kou, D V Lighner, C F Lo, P C Loh, and P J Walker 2002 NIMAVIRIDAE A new virus family infecting aquatic invertebrates ICTV, Paris, 2002 40 Witteveldt J, Carolina C, Cifuentes, Just M Vlak, and Marieălle C W van Hulten 2003 Protection of Penaeus monodon against White Spot Syndrome Virus by Oral Vaccination Joural of virology, Feb 2004, p 2057–2061 Vol 78, No 41 Wongteerasupaya, C., Pungchai P, Withyachumnarnkul, V Boonsaeng, S Panyim, T W Flegel, and P J Walker 2003 High variation in repetitve DNA fragment lengh for white spot syndrome virus (WSSV) isolates in Thailand Dis aquat org 54: 253-275 42 http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR Ngày truy cập 25/02/2008 41 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN VII PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MẪU Ao CM1 CM2 CM3 CM4 CM5 CM6 CM7 Mã số a b c d e a b c d e a b c d e a b c d e PCRIQ2000 (++) (++) (+) (++) (++) (+) (+) (++) (+) (+) (+) (+) (++) (+) (+) (+) (+++) (++) (+) (+) a b c d e a b c d e a b c (+) (+) (++) (++) (++) (+) (+) (++) (++) (++) (+) (++) (++) ORF94 ORF125 vùng lặp lại vùng lặp lại vùng lặp lại vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có 10 vùng lặp mẫu có vùng lặp lại lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại vùng lặp lại vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại vùng lặp lại vùng lặp lại 42 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com d e a b CM8 c d e a b CM9 c d e a b CM10 c d e a b CM11 c d e a b CM12 c d e (++) (++) (+) (+) (+) (+) (+) (++) (+) (+) (+) (+++) (+) (+) (++) (+) (+++) (+) (+) (+++) (+++) (++) (++) (+) (+) (+) (+++) mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có 10 vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại vùng lặp lại vùng lặp lại vùng lặp lại vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có mẫu có vùng lặp vùng lặp lại lại mẫu có vùng lặp lại 43 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... lặp lại vùng lặp lại vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại vùng lặp lại vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại Trong ao CM2, CM3 số vùng lặp lại. .. lặp lại vùng lặp lại CM3 vùng lặp lại CM4 mẫu có vùng lặp lại mẫu có 10 vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp lại mẫu có vùng lặp. .. SẢN TÔ VŨ AN TÌM HIỂU SỰ BIẾN ĐỔI CỦA VÙNG LẶP LẠI THUỘC ORF94, ORF125 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) TẠI CÀ MAU LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY