ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN aeromonas hydrophila PHÂN lập từ cá TRA (pangasianodon hypophthamus) bị BỆNH XUẤT HUYẾT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN LƯƠNG MỸ THUẬN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TỪ CÁ TRA (Pangasianodon hypophthamus) BỊ BỆNH XUẤT HUYẾT Cần Thơ, 2009 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN LƯƠNG MỸ THUẬN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TỪ CÁ TRA (Pangasianodon hypophthamus) BỊ BỆNH XUẤT HUYẾT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH Cần thơ, 2009 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM ƠN Được làm hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp mong muốn sinh viên Để hoàn thành tốt luận văn trình học tập, phấn đấu với hướng dẫn nhiệt tình thầy anh chị Đầu tiên tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn đến quý thầy cô khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt thầy cô môn Sinh học Bệnh Thủy sản truyền đạt kiến thức quý báo suốt trình học nghiên cứu trường Xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Đặng Thị Hồng Oanh tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện đóng góp nhiều ý kiến quý báo suốt thời gian thực đề tài hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp Xin gởi lời cảm ơn đến cô Bùi Thị Bích Hằng nhiệt tình quan tâm động viên suốt thời gian làm cố vấn học tập Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Thu Hằng, cô Trần Thị Tuyết Hoa, chị Nguyễn Trúc Phương, chị Nguyễn Hà Giang anh Lê Hữu Thôi bạn lớp bệnh học thủy sản K31, đặc biệt bạn Mai Thị Loan lớp BHTS-K31 nhiệt tình quan tâm giúp đỡ động viên suốt thời gian thực đề tài i LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR phát vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh xuất huyết” thực nhằm chuẩn hóa phương pháp PCR phát A hydrophila Đồng thời so sánh với kết định danh phương pháp sinh hóa truyền thống kit API 20E Đề tài thực chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập trực tiếp từ cá tra bị bệnh xuất huyết quan (gan, thận tỳ tạng) tỉnh (Cần Thơ, Vĩnh Long, Đồng Tháp), A hydrophila định danh phương pháp sinh hóa truyền thống kit API 20E sau trữ glycerol (50%) -20oC Sau phục hồi môi trường đặc trưng (Aeromonas agar + Ampicillin) tách sang NA nuôi tăng sinh NB, DNA chiết tách theo Bartie et al (2006), chiết tách cách (chiết tách từ vi khuẩn nuôi NB vi khuẩn đĩa NA pha loãng với nước muối sinh lý) Phản ứng PCR khuếch đại DNA theo Panangala et al (2007) có chỉnh sữa Đặng Hoàng Oanh ctv (2008) Kết điện di sản phẩm PCR mẫu DNA chiết tách từ NB mẫu DNA chiết tách cách pha lỗng với nước muối sinh lý, có diện vi khuẩn A hydrophila, tất vạch vị trí 209 bp Điện di sản phẩm PCR chủng A hydrophila mà không qua bước chiết tách DNA, không chiết tách nên phản ứng PCR không khuếch đại DNA A hydrophila, kết mẫu không vạch điện di Phản ứng PCR xác định độ nhạy giới hạn thấp phát A hydrophila 1ng/µl (hàm lượng DNA) Phương pháp PCR với hàm lượng thành phần hóa chất tham gia phản ứng đoạn mồi đặc trưng cho phép phát A hydrophila vạch (209 bp), thử tính đặc hiệu với chủng (Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, E ictaluri, Pseudomonas putida, Eschericchia coli) ii LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi Chương 1: GIỚI THIỆU Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình ni thủy sản Việt Nam 2.2 Nguyên nhân tình hình dịch bệnh thủy sản 2.3 Các thời kỳ phát triển bệnh 2.4 Sơ lược bệnh cá tra 2.5 Sơ lược vi khuẩn A hydrophila gây bệnh cá tra 2.6 Phương pháp PCR 2.6.1 Khái niệm PCR 2.6.2 Các nhân tố ảnh hưởng tới phản ứng PCR 11 2.6.3 Ứng dụng kỹ thuật PCR thủy sản 12 2.6.4 Đối chứng 13 2.6.5 Hạn chế PCR 13 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 15 3.1.1 Thời gian 15 3.1.2 Địa điểm 15 3.1.3 Nội dung thực 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu 15 3.2.1 Thiết bị - Dụng cụ 15 3.2.2 Hóa chất thí nghiệm 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Thu mẫu, bảo quản vận chuyển 16 iii LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 3.3.2 Nguồn vi khuẩn 16 3.3.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn 17 3.3.4 Phương pháp phục hồi nuôi tăng sinh vi khuẩn 18 3.3.5 Phương pháp PCR 18 3.3.6 Thí nghiệm xác định độ nhạy qui trình PCR 20 3.3.7 Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu qui trình PCR 21 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Kết phân lập vi khuẩn A hytrophila cá tra bị bệnh xuất huyết 22 4.2 Kết phục hồi vi khuẩn 23 4.3 Phát vi khuẩn A hydrophila phương pháp PCR 24 4.4 Độ nhạy phương pháp PCR phát A hydrophila 26 4.5 Tính đặc hiệu phương pháp PCR phát A hydrophila 27 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30 5.1 Kết luận 30 5.2 Đề xuất 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 PHỤ LỤC 34 PHỤ LỤC 35 PHỤ LỤC 37 iv LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Trình tự đoạn mồi sử dụng qui trình PCR (Panangala et al., 2007) 16 Bảng 3.2: Nguồn gốc chủng vi khuẩn sử dụng cho đề tài 17 Bảng 3.3: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại qui trình PCR phát A hydrophila 19 Bảng 4.1: Bảng kết thu mẫu cá tra bị bệnh 22 v LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Ngun lý kỹ thuật PCR 10 Hình 4.1 Cá tra bị bệnh xuất huyết (xoang bụng, hậu môn, nắp mang xuất huyết mắt lồi đục) 22 Hình 4.2 Hình dạng khuẩn lạc A hydrophila môi trường Aeromonas agar + Ampicillin 23 Hình 4.3Hình khuẩn lạc A hydrophila mơi trường NA…………… 23 Hình 4.4 Hình nhuộm gram vi khuẩn A hydrophila 24 Hình 4.5 Kết điện di sản phẩm PCR chủng A hydrophila 25 Hình 4.6 Kết điện di sản phẩm PCR, không qua chiết tách DNA chủng A hydrophila 26 Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm PCR phát A hydrophila xác định độ nhạy phương pháp 27 Hình 4.8 Kết điện di sản phẩm PCR xác định tính đặc hiệu phương pháp phát A hydrophila 28 vi LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Chương GIỚI THIỆU Ngày nghề nuôi thủy sản đặc biệt cá tra đồng sông Cửu Long (ĐBSCL) mạnh hàng đầu nuôi tỉnh như: Đồng Tháp, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long,… Xuất phát từ nhu cầu kinh tế, thị trường nước, đòi hỏi phải đáp ứng sản lượng cá thịt lớn Nên mật độ diện tích ni cá tra ngày tăng đáng kể Năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất 292.800 tấn, thu kim ngạch xuất 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất thủy sản nước Trong tháng đầu năm 2007, diện tích ni cá tra tồn vùng ĐBSCL lên đến 3.642 ha, tăng 1.256 so với năm trước, sản lượng cá tra đạt 380.489 tấn, khối lượng cá tra xuất 173.100 tấn, đạt kim ngạch xuất 462,4 triệu USD, tăng 32% lượng 38,9% kim ngạch so với kỳ năm 2006 (Báo Cần Thơ, 2007) Hiện nghề nuôi cá tra chủ yếu ni thâm canh ao đất, chi phí đầu tư thấp nghề nuôi cá tra bè, mức độ thâm canh cao lên đến (50-60 con/m2 ao), làm nẩy sinh nhiều vấn đề dịch bệnh khó quản lý tốt mơi trường nước ao ni Ở Việt Nam, đầu năm 2006 tỉnh An Giang Đồng Tháp cá chết bệnh mủ gan lên đến 60% (Tài ngun mơi trường Việt Nam, 2006; trích lược Lương Trần Thục Đoan, 2006) Cá tra lồi cá kinh tế có dịch bệnh gây tỉ lệ chết cao, nên có nhiều nghiên cứu bệnh cá tra triển khai như: nghiên cứu bệnh đốm trắng nội tạng (Lê Thị Bé Năm, 2002), bệnh mủ gan (Lương Trần Thục Đoan, 2006), bệnh trùng dưa ( Lê Thành Đen, 2006), bệnh vàng da (Phạm Thanh Hương, 2006), nghiên cứu khả gây bệnh Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila (Ngô Minh Dung, 2007), bệnh trắng gan, trắng mang (Phan Khắc Huy, 2008),… Bệnh xảy cá tra nhiều tác nhân ký sinh trùng, vi khuẩn, nấm, dinh dưỡng,…Trong vi khuẩn tác nhân gây bệnh nghiêm trọng, khó điều trị gây tỷ lệ hao hụt cao cá tra Các loại bệnh tác nhân vi khuẩn gây bệnh đỏ mỏ, đỏ vây, xuất huyết đường ruột, trắng gan trắng mang, trắng da trắng đuôi,… Bệnh xuất huyết (còn gọi bệnh đốm đỏ) vi khuẩn Aeromonas bệnh phổ biến xuất quanh năm cá tra (Ngô Minh Dung, 2007) Hiện phương pháp chuẩn đốn vi khuẩn nói chung A hydrophila nói riêng, gây bệnh cá tra nước ta dựa vào dấu hiệu bên phương LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com pháp sinh hóa truyền thống sử dụng kit API 20E, khơng cho phép phát sớm xác tác nhân gây bệnh Cũng Ngô Minh Dung (2007) gây cảm nhiễm vi khuẩn A hydrophila E ictaluri cá tra, sau tái định danh vi khuẩn phương pháp sinh hóa truyền thống khoảng tuần để đọc kết quả, hàng loạt đề tài nghiên cứu Lương Trần Thục Đoan (2006), Tiết Ngọc Trân (2007), Lê Minh Đương (2007) sử dụng kit API 20E để kiểm tra vi khuẩn khoảng ngày để có kết Cụ thể Nguyễn Trúc Phương (2008) ứng dụng phương pháp PCR kiểm tra kết định danh vi khuẩn sau dùng phương pháp sinh hóa truyền thống kit API 20E để định danh E ictaluri cá tra, kết luận phương pháp PCR cho phép phát sớm xác vi khuẩn cần ngày, Nguyễn Hà Giang (2008) ứng dụng phương pháp PCR phát A hydrophila sau định danh chưa cho kết tốt Do để chẩn đốn nhanh xác vi khuẩn A hydrophila cá giúp cho người nuôi phát kịp thời, hạn chế đến mức thấp thiệt hại vi khuẩn gây ra, ứng dụng phương pháp PCR Nên đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR phát vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh xuất huyết” thực nhằm góp phần vào việc chuẩn hóa phương pháp phát vi khuẩn A hydrophila gây bệnh cá tra Mục tiêu nghiên cứu Thực chuẩn hóa phương pháp PCR phát A hydrophila phân lập từ cá tra bị bệnh xuất huyết Nội dung nghiên cứu - Thực chuẩn hóa phương pháp PCR phát A hydrophila phân lập từ cá tra bị bệnh xuất huyết - Xác định độ nhạy phương pháp PCR phát A hydrophila - Xác định tính đặc hiệu phương pháp PCR phát A hydrophila LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com khuẩn định danh phương pháp sinh hóa truyền thống kít API 20E sau trữ glycerol (50%) Kết phục hồi vi khuẩn môi trường đặc trưng Aeromonas agar + Ampicillin, quan sát hình dạng khuẩn lạc nhuộm gram thấy phù hợp với kết định danh Định danh A hydrophila phương pháp sinh hóa truyền thống hay kít API 20E phương pháp phổ biến, dùng phương pháp cho kết quả, nhiên phương pháp sinh hóa truyền thống nhiều thời gian dùng kít API cần vài ngày Vi khuẩn sau phục hồi tiến hành kiểm tra, thấy kết vi khuẩn gram âm, di động, có dạng hình que ngắn (hình 4.4) Kết phù hợp với kết ghi nhận Ngô Minh Dung (2007) phân lập A hydrophila sau gây cảm nhiễm cá tra Hình 4.4 Hình nhuộm gram vi khuẩn A hydrophila 4.3 Phát vi khuẩn A hydrophila phương pháp PCR PCR cơng cụ giúp phát nhanh xác mầm bệnh vi sinh vật tôm, cá Với phương pháp PCR cần khoảng ngày nhanh chóng phát A hydrophila, mà kết lại xác, DNA A hydrophila bắt cặp với mồi đặc trưng vạch vị trí 209 bp Cũng tương tự đề tài Nguyễn Trúc Phương (2008) dùng phương pháp PCR để xác định kết định danh E ictaluri, cho kết nhanh xác Đề tài ứng dụng phương pháp PCR để phát A hydrophila nhằm kiểm tra tính xác kết định danh phương pháp sinh hóa truyền thống góp phần vào việc chuẩn hóa phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn A hydrophila gây cá tra Nghiên cứu thực phản ứng PCR cách chiết tách mẫu lấy mẫu từ khuẩn lạc 24 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Kết phản ứng PCR mẫu DNA chiết tách từ vi khuẩn nuôi môi trường NB sau 18-24 giờ, 28-30oC trình bày (hình 4.5) Từ kết (hình 4.5) cho thấy 14 mẫu chiết tách đối chứng dương vạch vị trí 209 bp, đối chứng âm không vạch Theo kết nghiên cứu Panangala et al., (2007) ứng dụng phương pháp multiplex-PCR để phát đồng thời loài vi khuẩn quan trọng (E ictaluri, Flavobacterium columnare A hydrophila), cho kết phát A hydrophila (209 bp) 10 11 12 13 14 15 16 M 209 bp Hình 4.5 Kết điện di sản phẩm PCR chủng A hydrophila - Giếng M: thang đo DNA - Giếng 1: đối chứng âm (nước cất) - Giếng 2: đối chứng dương - giếng DNA chiết tách từ NB (giếng 3-9) + Giếng 3: chủng CA (t); Giếng 4: chủng SD (t); Giếng 5: chủng CA (tt); Giếng 6: chủng TN (tt); Giếng 7: chủng TN (g); Giêng 8: chủng TN (t); Giếng 9: chủng SD (tt) - giếng DNA chiết tách pha loãng vi khuẩn với nước muối sinh lý (giếng 10-16) + Giếng 10: chủng CA (t); Giếng 11: chủng SD (t); Giếng 12: chủng CA (t); Giếng 13: chủng TN (tt); Giếng 14: chủng TN (g); Giếng 15: chủng TN (t); Giếng 16: chủng SD (t) Chứng tỏ có diện A hydrophila tất 14 mẫu khơng có sản phẩm phụ, nhiên giếng số 7, 8, 12, 13 số 14 mẫu vạch chưa rõ giếng cịn lại, hàm lượng DNA chiết tách không đủ Nồng độ mẫu đoạn mồi sử dụng cho phản ứng 20 ng/µl 10 µM N ếu 25 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com có điều kiện nên tiến hành thử giảm thành phần hóa chất tham gia phản ứng PCR, để tiết kiệm chi phí mà mang lại kết tốt Kết PCR mẫu lấy trực tiếp từ khuẩn lạc chủng vi khuẩn, không qua bước chiết tách trình bày (hình 4.6) Qua kết (hình 4.6) cho thấy mẫu khơng vạch 209 bp, mẫu vi khuẩn không qua bước chiết tách DNA nên kết điện di sản phẩm PCR không vạch M 209 bp Hình 4.6 Kết điện di sản phẩm PCR, không qua chiết tách DNA chủng A hydrophila Giếng 1: chủng CA (t); Giếng 2: chủng SD (t); Giếng 3: chủng CA (tt); Giếng 4: chủng TN (tt); Giếng 5: chủng TN (g); Giêng 6: chủng TN (t); Giếng 7: chủng SD (tt) 4.4 Độ nhạy phương pháp PCR phát A hydrophila Để xác định giới hạn thấp hàm lượng DNA vi khuẩn mà phương pháp PCR phát Xác định pha loãng acid nucleic làm tinh Kết PCR xác định độ nhạy phương pháp thể qua (hình 4.7) Dựa vào kết (hình 4.7) cho thấy có mẫu cho kết (10o, 10-1 10-2) vạch 209 bp, mẫu cịn lại hàm lương DNA thấp không đủ cho phản ứng PCR, nên không vạch sau điện di Hàm 26 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com lượng DNA thấp cho phản ứng PCR để phát A hydrophila (10-2 = ng/µl) 209 bp Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm PCR phát A hydrophila xác định độ nhạy phương pháp Giếng M: thang đo DNA Giếng 1: đối chứng âm (mẫu nước) Giếng 2: hàm lượng DNA 10o ng/µl (10o = 100 ng/µl) Giếng 3: 10-1; Giếng 4: 10-2; Giếng 5: 10-3; Giếng 6: 10-4; Giếng 7: 10-5; Giếng 8: 10-6; Giếng 9: 10-7; Giếng 10: 10-8; Giếng 11: 10 -9 4.5 Tính đặc hiệu phương pháp PCR phát A hydrophila Tính đặc hiệu phương pháp với hàm lượng thành phần hóa chất tham gia phản ứng đoạn mồi đặc trưng phương pháp PCR phát A hydrophila, khơng cho kết dương tính với loài vi khuẩn khác Kết thể (hình 4.8) Ở nghiên cứu Panangala et al., (2007) ghi nhận kết xác định tính đặc hiệu phương pháp m-PCR, 10 chủng vi khuẩn phân lập loài vi khuẩn (E ictaluri, Flavobacterium columnare A hydrophila) thử với 11 chủng gram âm khác chủng gram dương có mặt khắp nơi từ mơi trường ni thủy sản Hình 4.8 cho thấy với hàm lượng thành phần hóa chất tham gia đoạn mồi phản ứng PCR cho phép phát DNA A hydrophila thử với loài vi khuẩn khác (Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, E ictaluri, Pseudomonas putida, Eschericchia coli) Kết có giếng (đối chứng 27 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com dương) mẫu có DNA A hydrophila vạch 209 bp, giếng thử chủng vi khuẩn khác không vạch Giếng (đối chứng âm) không vạch chứng tỏ kết chiết tách DNA không nhiễm tạp 209 bp Hình 4.8 Kết điện di sản phẩm PCR xác định tính đặc hiệu phương pháp phát A hydrophila Giếng M: thang đo DNA Giếng 1: đối chứng âm (nước cất) Giếng 2: đối chứng dương (mẫu DAN chủng A hydrophila) Giếng 3: DNA chủng Vibrio alginolyticus Giếng 4:DNA E ictaluri Giếng 5: DNA Eschericchia coli Giếng 6: DNA Pseudomonas putida Giếng 7: DNA Vibrio harveyi Từ kết điện di sản phẩm PCR xác định độ nhạy tính chuyên biệt phương pháp PCR phát A hydrophila, cho phép phát nhanh sớm mầm bệnh dạng tiềm ẩn Nên kịp thời xử lý ao nuôi hạn chế rũi ro xảy Đây hướng việc chẩn đoán bệnh xuất huyết A hydrophila gây cá tra nuôi Tuy nhiên phương pháp PCR tốn cần thiết phải có máy móc đại phương pháp sinh hóa truyền thống kít API 20E 28 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Phương pháp m-PCR phương pháp đầy hứa hẹn cho việc phát nhanh, nhạy phát đồng thời loài vi khuẩn (E ictaluri, Flavobacterium columnare A hydrophila) gây bệnh cá (theo Panangala et al., 2007) 29 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Đã thực thành cơng phản ứng PCR Có chủng A hydrophila chiết tách acid nucleic (Bartie et al., 2006) cách: (1) chiết tách từ vi khuẩn nuôi NB, (2) chiết tách cách pha loãng vi khuẩn với nước muối sinh lý (0,85% NaCl) Khuếch đại DNA (Panangala et al., 2007 có chỉnh sửa Đặng Thị Hoàng Oanh ctv, 2008), kết PCR khẳng định 14 mẫu DNA (từ cách chiết tách) chủng vi khuẩn định danh A hydrophila vạch 209 bp Với thành phần phản ứng PCR: 1X Buffer, 1,5 mM MgCl 2, 200 µM dNTPs, 2,5U Taq DNA polymerase, 0,4 µM mồi AeroFd, 0,4 µM mồi AeroRs, µl DNA khuôn, nước cất Chu kỳ nhiệt thực phản ứng 95oC phút; tiếp 30 chu kỳ 95oC 30 giây, 60 oC 45 giây, 72 oC 30 giây; cuối 72 oC 10 phút Kết điện di sản phẩm PCR mẫu vi khuẩn trên, lấy trực tiếp từ đĩa NA không vạch Do mẫu vi khuẩn không qua bước chiết tách DNA, nên kết điện di sản phẩm PCR không vạch PCR xác định độ nhạy phương pháp, phản ứng PCR từ chủng A hydrophila pha loãng 10 mẫu với hàm lượng DNA giảm dần cho kết điện di có mẫu (với hàm lượng DNA 100 ng/µl, 10 ng/µl ng/µl) vạch (209 bp) Vậy hàm lượng DNA thấp phát ng/µl mẫu PCR xác định tính đặc hiệu phương pháp thử phản ứng PCR chủng A hydrophila với chủng Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, E ictaluri, Pseudomonas putida, Eschericchia coli Kết có mẫu DNA A hydrophila vach vị trí 209 bp, cịn lại mẫu không vạch Vậy phương pháp PCR với thành phần hóa chất tham gia phản ứng đoạn mồi đặc trưng để phát DNA A hydrophila 5.2 Đề xuất - Nên ứng dụng phương pháp PCR để phát sớm mầm bệnh A hydrophila gây bệnh xuất huyết cá tra, để hạn chế rủi ro xảy - Thực m-PCR phát đồng thời loại vi khuẩn A hydrophila (209 bp) E ictaluri (407 bp) 30 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Báo Cần Thơ 2007 Để sản phẩm cá tra Việt Nam ln tín nhiệm http://www.fistenet.gov.vn/detail.asp (Cập nhật 09/08/2007) Bộ Thủy sản, 2008 Phòng trị số bệnh thường gặp cá tra basa Cập nhật 7/11/2008 Bùi Quang Tề 2006 Bệnh học thủy sản Đặng Thị Hồng Oanh 2007 Ngun lý Kỹ thuật Chẩn đốn Bệnh Thủy sản Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng Nguyễn Thị Muội 2004 Bệnh Học Thủy Sản NXB nông nghiệp, 6:218-223 Đoàn Nhật Phương 2001 Xác đinh LD50 thử nghiệm vaccine phòng bệnh vi khuẩn (Aeromonas hydrophila) cá chép (Cyprinus carpio) Luận văn tốt nghiệp khoa Thủy sản, ĐHCT Hồ Huỳnh Thùy Dương 2003 Sinh học phân tử NXB giáo dục 301 trang Huỳnh Phú Trọng 2008 Xuất thủy sản chạy đua cán đích 4,25 tỷ USD http://www.vietlinh.com.vn ( truy cập 22/8/2008) Huỳnh Thị Phượng Quyên 2008.Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc kháng sinh lên vi khuẩn E ictaluri & A hydrophila khoa Thủy sản Luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 10 Inglis, V., R J Roberts and N R Bromage 1993 Bacterial Disease Of Fish Institute of Aquaculture 312pp 11 Khuất Hữu Thanh 2003 Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen NXB khoa học kỹ thuật 12 Lê Minh Đương 2007 So sánh khả xâm nhập hai dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá tra (Pangasius hypophthalmus) Luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 13 Lê Thành Đen 2006 Sử dụng số hóa chất trị bệnh trùng dưa (Ichthyophthyrius multifiliis) cá tra (Pangasius hypophthalmus) giống Luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 14 Lê Thị Bé Năm 2002 Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng cá tra Luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 31 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 15 Lệ Thu 2008 Tác động biến đổi khí hậu ĐBSCL Báo Cần Thơ http://www.cres.edu.vn ( Cập nhật 9/10/2008) 16 Lương Trần Thục Đoan 2006 Khảo sát xuất vi khuẩn gây bệnh mủ gan ( Edwardsiella ictaluri) quan khác ca tra (Pangasius hypophthamus) Luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 51 trang 17 Ngô Minh Dung 2007 nghiên cứu khả gây bệnh vi khuẩn Edwarsiella ictaluri Aeromonas hydrophila cá tra(Pangasius hypophthalmus) Luận văn đại học Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 18 Nguyễn Hà Giang 2008 Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định tiêu sinh hóa vi khuẩn Aeromonas hydrophila khoa thủy sản Luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 19 Nguyễn Trúc Phương 2008 Tìm hiểu khác tiêu sinh lý sinh hóa dịng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri xác định phương pháp sinh hóa truyền thống API 20E Luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 42 trang 20 Nông nghiệp, nông sản, thủy sản Việt Nam 2007 Một số bệnh thường gặp cá tra http://agriviet.com/news_detail420-c46-s67-p0-một số bệnh thường gặp cá tra.html Cập nhật 1/5/2007 21 Panangala, S.V., C.A Shoemaker, V.L.V Santen, K Dybvig and P.H Klesius 2007 Multipex-PCR for simultaneous detection of bacterial fish pathogens, Flavobacterium columnare, Edwardsiella ictaluri, and Aeromonas hydrophila Díeases of aquatic organisms, 74: 199-208 (2007) 22 Phạm Đình Đơn 2006 Bảo vệ mơi trường ni trồng thủy sản Đồng sông Cửu Long http://www.vietlinh.com.vn (Cập nhật 26/11/2006) 23 Phạm Thanh Hương 2006 xác định số yếu tố huyết học cá tra (Pangasius hypophthalmus) bệnh vàng da tỉnh Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 24 Phạm Thị Thu Trang 2005 Ứng dụng kỹ thuật PCR chuẩn đoán bệnh đốm trắng tôm sú (Penaus monodon) tôm chân trắng (Penaus vannamie) Luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 39 trang 25 Saitatu, K.S., Wongsawang and K Poonsuk 1982 Red sore disease in carp (Cyprinus carpio L) J Aquat Animal Dis 3: 79-86 (In Thai) In Asian 32 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Fish Health Bibliography and Abstracts I: Southeast Asia Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992 26 Tiết Ngọc Trân 2007 So sánh khả gây bệnh hai dòng vi khuẩn (Edwardsiella ictaluri) gây bệnh cá tra (Pangasius hypophthalmus) cá nheo mỹ Luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 27 Trần Khánh Linh 2007 ĐBSCL: môi trường nuôi thủy sản kêu cứu http://www.monre.gov.vn (Cập nhật 16/11/2007) 28 Trần Thị Ngọc Hân 2006 Khảo sát mô học cá tra (pangasius hypophthalmus) bị bệnh mủ gan điều kiện gây cảm nhiễm Luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 71 trang 29 Trần Thị Tuyết Hoa 2004 Bài Giảng sinh học phân tử Khoa Thủy SảnĐại học Cần Thơ 30 Trần Thị Xô Nguyễn Thị Lan 2005 Cơ sở di truyền công nghệ gen NXB khoa học kỹ thuật 31 Trần Văn Tếch 2008 Khảo sát ký sinh trùng cá tra (Pangasianodon hyphophthalmus) bệnh vàng da Luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 32 Trần Việt Tiên 2007 Ứng dụng phương pháp RT-PCR chẩn đoán virus gây bệnh đầu vàng (YHV) tôm sú (penaeus monodon) ĐBSCL Luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 65 trang 33 Từ Thanh Dung 2005 Bài Giảng Bệnh Học Thủy Sản Đại Cương Khoa Thủy sản – Đại học Cần Thơ 34 Từ Thanh Dung 2008 Bài giảng Bệnh vi khuẩn động vật Thủy sinh Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ 35 Võ Thị Thương Lan 2006 Giáo trình sinh học phân tử tế bào ứng dụng NXB giáo dục 36 Yang B, X-L Song, J Huang, C-Y Shi, Q-H Liu and L Liu 2006 A single-step multiplex PCR for simultaneous detection of white spot syndrome virus and infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp 33 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC Bảng chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá bệnh xuất huyết Địa điểm Đồng Tháp Vĩnh Long Cần Thơ Kí hiệu ao Tên hộ nuôi Bệnh SĐ2 Phan Văn Điền Xuất huyết CA1 Huỳnh Văn Khuê Xuất huyết CS2 Nguyễn Thị Hoà Xuất huyết TN1 Lê Thành Nhân Xuất huyết TN2 Lê Thành Nhân Xuất huyết Dấu hiệu bệnh lý Sưng hầu, phù mắt Xuất huyết nội quan Xoang bụng có chứa chất dịch màu hồng Gan có màu vàng, dịch xoang bụng có mùi Thành bụng xuất huyết Cơ bị lt, vây trắng nhạt xuất huyết Xuất huyết mặt thành bụng, nội quan Xoang bụng chứa chất dịch có mùi hôi Phù mắt, xuất huyết hầu, xuất huyết vi Xuất huyết bụng Gan có màu vàng Xuất huyết vi, hậu môn, hầu Xuất huyết thành bụng nội quan Xoang bụng chứa chất dịch có màu vàng mùi hôi Chủng vi khuẩn SĐ2.1T SĐ2.2T CA1.2T CA1.3TT CS2.3T TN1.1T TN2.1G TN2.4TT 34 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập Chỉ tiêu kiểm tra Nhuộm Gram Hình dạng Sinh sắc tố Di động Sinh catalaza Sinh oxidaza Phản ứng lên men yếm khí Phản ứng lên men hiếu khí Arginine Lysine Ornithine Mọc môi trường Aeromonas Sinh gas từ glucose Thuỷ phân aesculin Sinh ureaza Sử dụng citrate Sinh amylaza Sinh indole Phản ứng VP Thuỷ phân tween 80 Tạo nitrit từ nitrat Mọc 0% NaCl Mọc 3% Mọc 6% Mọc 7% Mọc 10% Mọc thạch TCBS Kháng với 0/129 Sử dụng Arabinose Cellobiose Galactose Glycerol Lactose Mannitol Trehalose Sucrose Glucose A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 Que Que Que Que Que Que Que Que ngắn ngắn ngắn ngắn ngắn ngắn ngắn ngắn + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + - + + - + + - + + - + + - + + - + + - + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 35 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Salicin Xylose + - + - + - + - + - + - + - + - Ghi chú: (+): phản ứng dương tính A1: TN1.1T A3: TN2.4TT A5: SĐ2.1T A7: CA1.2T (-): phản ứng âm tính A2: TN2.1G A4: SĐ2.2T A6: CS2.3T A8: CA1.3TT 36 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC Kết kiểm tra tiêu sinh hóa kít API 20E STT Chỉ tiêu ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND 10 VP 11 GEL 12 GLU 13 MAN 14 INO 15 SOR 16 RHA 17 SAC 18 MEL 19 AMY 20 ARA A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + - Ghi chú: (+): Phản ứng dương tính - A1: TN1.1T - A3: TN2.4TT - A5: SĐ2.1T - A7: CA1.2T - ONPG: ortho-nitrophenyl galactosidase - ADH: arginine dihydrolase - LDC: lysine decarboxylase - ODC: ornithine decarboxylase - CIT:citrate - H2S: sinh H 2S - URE: urea - TDA: tryptophane deaminase - IND: indole - VP: phản ứng Voges-Proskauer (-): Phản ứng âm tính - A2: TN2.1G - A4: SĐ2.2T - A6: CS2.3T - A8: CA1.3TT - GEL: gelatin - GLU: glucose - MAN: mannitol - INO: inositol - SOR: sorbitol - RHA: rhamnose - SAC: sucrose - MEL: melibiose - AMY: amygdaline - ARA: arabinnose 37 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 38 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com ... chuẩn hóa phương pháp PCR phát A hydrophila phân lập từ cá tra bị bệnh xuất huyết Nội dung nghiên cứu - Thực chuẩn hóa phương pháp PCR phát A hydrophila phân lập từ cá tra bị bệnh xuất huyết -... Đề tài ? ?Ứng dụng phương pháp PCR phát vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh xuất huyết? ?? thực nhằm chuẩn hóa phương pháp PCR phát A hydrophila Đồng... khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh xuất huyết? ?? thực nhằm góp phần vào vi? ??c chuẩn hóa phương pháp phát vi khuẩn A hydrophila gây bệnh cá tra Mục tiêu