Chemical composition, functional properties, antimicrobial mechanism and extraction technology of essential oils from citrus peels and leaves

2 P T L Chi, L H Thanh, V K Chinh, P V Hung, and N T L Phi, “Chemical compositions and antimicrobial of leaf essential oils of different ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Citrus varieties,” presented at the 2nd International Symposium on TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA sustainable Agriculture and Agro-Industry (ISSAA), Nakhonsithammarat, Thailand, 2017 N T P Giau, P T L Chi, and N T L Phi, “Enzyme-assisted vacuum distillation essential oils from Vietnamese Citrus leaves, their chemical compositions, antioxidant and antimicrobial activities,” presented at PHẠM THỊ LAN CHI International VBFoodNet2017 Conference on Safety and Quality in the Food Chain, Hochiminh City, Vietnam 2017 L H Thanh, P T L Chi, and N.T.L Phi, “Chemical composition, Antioxidant and Antibacterial activities of Citrus Limonia Osbeck,” presented at International VBFoodNet2017 Conference on Safety and Quality in the Food Chain, Hochiminh City, Vietnam, 2017 THÀNH PHẦN HĨA HỌC, HOẠT TÍNH ĐẶC TRƯNG, TÁC ĐỘNG LÊN VI SINH VẬT VÀ CƠNG NGHỆ TRÍCH LY TINH DẦU VỎ VÀ LÁ CITRUS P T L Chi, P V Hung, and N T L Phi, “Optimization of extraction condition of essential oil from peel of Citrus limonia Osbeck by response surface method,” presented at the 3rd International conference on sustainable global agriculture and food, Hochiminh City, Vietnam, 2018 Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số chuyên ngành: 62 54 01 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ TP HỒ CHÍ MINH - NĂM 2022 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Tạp chí SCI-E P T L Chi, P V Hung, L H Thanh, and N T L Phi, “Valorization of Citrus Leaves: Chemical Composition, Antioxidant and Antibacterial Người hướng dẫn 1: PGS.TS Phạm Văn Hùng Người hướng dẫn 2: PGS.TS Nguyễn Thị Lan Phi Activities of Essential Oils,” Water and Biomass Valorization, vol 4, pp.4849-4857, 2019 SCI-E, IF = 2.851 N.T.L, Phi, P V Hung, P T L Chi, and N H Dung, “Impact of extraction methods on antioxidant and antimicrobial activities of Citrus essential oils,” Phản biện độc lập: PGS.TS Hoàng Thị Kim Dung Phản biện độc lập: PGS.TS Lê Nguyễn Đoan Duy Journal of Essential Oils Bearing Plants, vol.18, pp 806-817, 2015 SCI-E, IF = 0.854 N.T.L, Phi, P V Hung, P T L Chi, and P D Tuan, “Impact of growth locations and genotypes on antioxidant and antimicrobial activities of Citrus Phản biện: PGS.TS Mai Huỳnh Cang Phản biện: PGS.TS Lê Thị Kim Phụng Phản biện: PGS.TS Bạch Long Giang essential oils in Vietnam,” Journal of Essential Oils Bearing Plants, vol.18, pp.1421-1432, 2015 SCI-E, IF = 0.854 Tạp chí non-SCI P T L Chi, V K Chinh, P V Hung, and N.T.L Phi, “Antimicrobial and antioxidant activities of essential oils extracted from leaves of Vinh orange, Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án họp đường link: http://meet.google.com/vtb-wrbq-wtt vào lúc 13 30 ngày 04 tháng 01 năm 2022 Dao lime and Thanh Tra pomelo in Vietnam,” International Journal of Food Science and Nutrition, vol.3, pp 152-156, 2018 Tạp chí nước P T L Chi, V T T Tuyen, and N T L Phi., “Antioxidant and antimicrobial activities of essential oils of different kinds of Citrus leaves,” Journal of Biotechnology, vol.14, pp 337-342, 2016 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM - Thư viện Đại học Quốc gia Tp.HCM - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM Kỷ yếu hội nghị quốc tế N T L Phi, P T L Chi, and M Sawamura, “Chemical compositions and antioxidant of essential oils of Citrus in Vietnam,” presented at Proceedings of FOOMA Japan 2017, Tokyo, Japan, 2017 A PHẦN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Hiện nay, chất tổng hợp có hoạt tính kháng khuẩn chống oxy hóa sử dụng rộng rãi việc bảo quản thực phẩm Tuy nhiên, hai thập kỷ qua, tác dụng phụ chất tổng hợp đến sức khỏe người dư luận quan tâm Vì vậy, nghiên cứu gần tập trung vào hợp chất an tồn có nguồn gốc tự nhiên thay chất tổng hợp bảo quản thực phẩm Với khả chống oxy hóa kháng vi khuẩn, tinh dầu trích ly từ vỏ Citrus dùng bảo quản thực phẩm tránh vấn đề liên quan đến sức khỏe Citrus loại có múi, thuộc họ Rutaceae, có nguồn gốc trồng rộng rãi vùng nhiệt đới cận nhiệt đới phía nam châu Á Tinh dầu trích ly từ Citrus cơng nhận an tồn mang lại nhiều lợi ích, nhiều nghiên cứu phương pháp trích ly, thành phần hóa học hoạt tính tinh dầu Citrus thực Việt Nam khắp giới Tuy nhiên, nghiên cứu chưa sâu nghiên cứu đánh giá tác động lên chủng vi khuẩn chưa đánh giá có hệ thống nhiều loại chi Citrus nghiên cứu Ngoài ra, tác nhân tạo hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Citrus chưa nghiên cứu Hơn nữa, phương pháp trích ly tinh dầu Citrus thơng thường có nhược điểm ảnh hưởng đến hiệu suất chất lượng tinh dầu Citrus Mục tiêu luận án - Nghiên cứu chi tiết thành phần hóa học, hoạt tính đặc trưng, phương thức tác động lên vi khuẩn đánh giá tác nhân tạo nên hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Citrus Việt Nam tối ưu hóa điều kiện chiết xuất để hạn chế ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu đồng thời tăng hàm lương tinh dầu trích ly Đóng góp luận án - Phương thức tác động tinh dầu Citrus lên vi khuẩn xác định - Phương thức tác động thành phần kết hợp thành phần lên vi khuẩn xác định rõ giúp dự đốn vai trị thành phần hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu - Phương pháp trích ly cải tiến để tăng lượng tinh dầu trích ly hạn chế tối thiểu thay đổi chất lượng tinh dầu B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN PHẦN 1: TỔNG QUAN Tổng quan nguồn gốc đa dạng Citrus; sản lượng Citrus; tinh dầu Citrus, phương pháp tách chiết, hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Citrus tác động tinh dầu lên vi khuẩn trình bày luận án PHẦN 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Mẫu Cam Xoàn Bảng 2.1 Mẫu vỏ Citrus Ký hiệu Tên khoa học Citrus sinensis Osbeck CX Cam Vinh CV Citrus sinensis Osbeck Cam Phú Thọ CPT Bưởi Tân Triều BTTr Citrus hybrid - Citrus reticulata x Citrus maxima Citrus grandis Osbeck Bưởi Thanh Trà BThT Citrus grandis Osbeck Bưởi Đoan Hùng BĐH Citrus grandis Osbeck Chanh Long An CLA Citrus aurantifolia Swingle Chanh Đà Lạt CĐL Citrus limonia Osbeck Chanh Đào CĐ Citrus hybrid – Citrus spp Mẫu Cam Xoàn Bảng 2.2 Mẫu Citrus Tên khoa học Ký hiệu Citrus sinensis Osbeck CX Cam Vinh CV Citrus sinensis Osbeck Bưởi Tân Triều BTTr Citrus grandis Osbeck Bưởi Thanh Trà BThT Citrus grandis Osbeck Bưởi Đoan Hùng BĐH Citrus grandis Osbeck Chanh Long An CLA Citrus aurantifolia Swingle Chanh Đà Lạt CĐL Citrus limonia Osbeck Chanh Đào CĐ Citrus hybrid – Citrus spp 2.2 Sơ đồ nghiên cứu Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 2.3 Phương pháp 2.3.1 Trích ly tinh dầu 2.3.1.1 Phương pháp ép lạnh Tinh dầu ép lớp vỏ thu lại dung dịch nước muối 40%, giữ lạnh Dịch chiết ly tâm 4000g 15 phút Tinh dầu vỏ Citrus khử nước natri sulfat khan 4oC Hiệu suất trích ly tính theo cơng thức: ố ượ Hàm lượng tinh dầu (%) = ố ượ ầ ả ặ ươ x 100 2.3.1.2 Phương pháp lôi nước 200g nguyên liệu nghiền thêm nước cất chưng cất Sau trích ly, tinh dầu tách nước khử nước natri sulfat khan 4°C 2.3.1.3 Phương pháp chưng cất chân không 200g nguyên liệu nghiền thêm nước cất chưng cất chân không Áp suất hệ thống trì 575 mm Hg Tinh dầu thu nhận khử nước natri sulfat khan bảo quản 4°C 2.3.1.4 Phương pháp chưng cất chân khơng có hỗ trợ enzyme Trước trích ly, vỏ Citrus ngâm với nước cất 45oC, pH đạt 4.5 Sau đó, pectinase thêm vào mẫu chứa vỏ Citrus Viscozyme-L thêm vào mẫu chứa Citrus Tiếp theo, mẫu chưng cất chân không áp suất 575mm Hg Tinh dầu thu nhận khử nước natri sulfat khan bảo quản 4°C 2.3.2 Phân tích thành phần tinh dầu Citrus Việc phân tích tinh dầu thực thiết bị GC-MS Agilent 7890A-MS cột DB - 5MS (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm) 2.3.3 Khảo sát khả kháng oxy hóa Hỗn hợp tinh dầu, methanol DPPH ủ 15 phút tối, sau đo độ hấp thu quang phổ bước sóng 517 nm 2.3.4 Khảo sát khả kháng khuẩn 2.3.4.1 Phương pháp khuếch tán Dịch nuôi vi khuẩn (106cfu/mL) trải môi trường thạch TSA Đĩa thạch để khơ 15 phút trước đục lỗ (đường kính 9mm) Tinh dầu Citrus nhỏ vào lỗ, tinh dầu lặp lại lần Các đĩa thạch ủ 37ºC 24 Đường kính vùng ức chế đo thước đo đơn vị mm 2.3.4.2 Phương pháp pha loãng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu Tinh dầu Citrus pha loãng thành nồng độ khác Sau đó, tinh dầu thêm vào dịch nuôi vi khuẩn (106cfu/mL) môi trường lỏng TSB Các ống nghiệm ủ 24 37°C Sau ủ, nồng độ tinh dầu, lấy 100µl trải mơi trường thạch TSA ủ 24 để xác định MIC 2.3.5 Xác định tác động tinh dầu lên vi khuẩn 2.3.5.1 Sự thay đổi tính thấm màng tế bào Sự thay đổi tính thấm màng tế bào vi khuẩn thể hiên qua thay đổi độ dẫn điện tương đối Dung dịch S aureus ly tâm 10 phút 1500g Tế bào S.aureus rửa dung dịch glucose 5% độ dẫn điện gần với độ dẫn điện glucose 5% Độ dẫn điện đo máy Extech EC400 (Taiwan) Các tế bào coi tế bào vi khuẩn đẳng trương Dung dịch glucose 5% thêm vào tinh dầu Citrus nồng độ 21 mg/mL đo độ dẫn điện, ký hiệu L1 Tinh dầu Citrus 21 mg/mL thêm vào dung dịch vi khuẩn đẳng trương, ủ 37℃ Độ dẫn điện đo hai lần ký hiệu L2 Độ dẫn điện vi khuẩn dung dịch glucose 5% đun sôi phút sử dụng làm đối chứng ký hiệu L0 Tính thấm màng tế bào tính theo công thức: Độ dẫn điện tương đối (%) = 100 𝑥 (2.1) 2.3.5.2 Sự thay đổi tính tồn vẹn màng tế bào Tính tồn vẹn màng tế bào đánh giá cách đo giải phóng thành phần tế bào bao gồm axit nucleic vào dịch tế bào Dung dịch S aureus ly tâm 15 phút 3000g Tế bào rửa PBS (0.1 M, pH 7.4) Tinh dầu Citrus nồng độ 21 mg/mL thêm 100 mL dịch vi khuẩn rửa lắc ủ 37oC Sau đó, hỗn hợp ly tâm 6000g phút Phần dung dịch thu nhận, pha loãng với PBS, đo độ hấp thụ bước sóng 260 nm Các mẫu đo độ hấp thu quang phổ bước sóng 260 nm 2.3.5.3 Sự thay đổi điện màng tế bào Tinh dầu Citrus nồng độ 21mg/mL thêm vào dung dịch chứa S aureus (106 cfu/mL) ủ Rhodamine 123 pha với PBS để thu dung dịch gốc mg / mL Mẫu chứa tinh dầu vi khuẩn rửa hai lần PBS sau Rhodamine123 thêm vào để đạt nồng độ cuối 2μg/mL Sau để bóng tối 30 phút, mẫu rửa hoàn toàn rửa lại PBS Mẫu đo máy đo phổ huỳnh quang (Synergy HT, USA) Mẫu kích thích 480 nm phát xạ thu 530 nm Dữ liệu thu nhận biểu thị cường độ huỳnh quang trung bình (MFI) 2.3.5.4 Chụp kính hiển vi điện tử SEM Tinh dầu Citrus 21mg/mL thêm vào dung dịch chứa S.auereus (106 cfu/mL) ủ 37oC Sau ủ, mẫu ly tâm 1500g 10 phút rửa hai lần dung dịch PBS (0.1 M, pH 7.4) Tế bào vi khuẩn cố định 2.5% glutaraldehyde 4oC Các mẫu khử nước etanol (30%, 50%, 80%, 90%, 100%), sau thay ethanol bằng 100% rượu tertiary butyl Cuối cùng, tất mẫu phủ vàng phút, chụp kính hiển vi điện tử (FESEM, JSM 7401F, JEOL, Nhật Bản) 2.3.6 Tối ưu hóa điều kiện tiền xử lý nguyên liệu trích ly tinh dầu Citrus phương pháp chân khơng có hỗ trợ enzyme Các thí nghiệm đơn yếu tố thực để tìm yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu trích ly Trước chiết, vỏ Citrus ngâm nước cất với nhiều tỷ lệ khác (0.125-0.5 g/mL), ủ với pectinase (200500 U / g) 40-55oC, pH-4.5 30-120 phút Đối với mẫu lá, tỷ lệ 0.15-0.35 g/mL nguyên liệu so với nước, 10-16 U/g nồng độ Viscozyme-L, thời gian ủ 60150 phút khảo sát Tinh dầu vỏ chiết xuất phương pháp chưng cất chân không áp suất 575mm Hg Sau xác định phạm vi biến thông qua thử nghiệm đơn yếu tố, phương pháp đáp ứng bề mặt sử dụng để tìm ảnh hưởng thơng số phản ứng đến hàm lượng tinh dầu trích ly Bảng 2.3 : Ma trận quy hoạch thực nghiệm q trình trích ly tinh dầu vỏ Citrus Yếu Tên biến Đơn Biến Biến Biến Biến tố vị thực thực mã hóa mã hóa A Tỉ lệ nguyên liệu/nước g/mL 0.25 0.5 -1 B Thời gian ủ Min 30 90 -1 C Nồng dộ pectinase U/g 300 500 -1 Bảng 2.4 Ma trận quy hoạch thực nghiệm q trình trích ly tinh dầu Citrus Yếu Tên biến Đơn Biến Biến Biến mã Biến tố vị thực thực hóa mã hóa A Tỉ lệ nguyên liệu/nước g/mL 0.2 0.3 -1 B Thời gian ủ Min 60 120 -1 C Nồng độ ViscozymeU/g 12 16 -1 L CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát tỉ trọng, thành phần hóa học, hoạt tính chống oxy hóa kháng khuẩn tinh dâu vỏ Citrus 3.1.1 Tỉ trọng tinh dầu Tỉ trọng tinh dầu loại vỏ Citrus trình bày Bảng 3.1 3.2 Qua kết ta thấy, tỉ trọng tinh dầu thuộc chi Citrus có giá trị nhỏ (nhẹ nước) 3.1.2 Thành phấn tinh dầu Citrus Các thành phần tinh dầu Citrus trình bày Bảng 3.3 3.4 Tổng cộng có hợp chất tìm thấy mẫu vỏ 15 hợp chất tìm thấy mẫu Thành phần monoterpenes EOs vỏ cam quýt limonene Limonene, β-pinene myrcene ghi nhận hợp chất EO vỏ limonene, β-pinene citronellal hợp chất EO 3.1.3 Hoạt tính chống oxy hóa tinh dầu Citrus IC50 (mg/mL) 100 50 k i b Chanh Chanh Long An Đà Lạt h d c g f e a Chanh Đào Cam Cam Phú Cam Xoàn Vinh Thọ Bưởi Tân Triều Bưởi Đoan Hùng BHT e d Bưởi Đoan Hùng BHT Bưởi Thanh Trà IC50 (mg/mL) Hình 3.1 Giá trị IC50 tinh dầu vỏ Citrus i 20 10 a f Chanh Chanh Long An Đà Lạt h Chanh Đào g b Cam Xoàn Cam Vinh c Bưởi Tân Bười Triều Thanh Trà Hình 3.2 Giá trị IC50 tinh dầu Citrus Cấu tử α-pinene terpinolene CX 0.61± 0.02c 0.32± 0.01d 0.02± 0.00a 2.10± 0.10d 0.15± 0.00b 94.25± 1.37g Tr ٧-terpinene Tr Linalool 0.30± 0.00d Sabinene β-pinene myrcene α-terpinene limonene Bảng 3.3 Thành phần hóa học tinh dầu vỏ (%w/w) CLA CV CPT BTTr BThT BĐH 0.53± 0.59± 1.32± 0.93± 0.33± 1.12± 0.02b 0.03c 0.01f 0.00d 0.00a 0.02e 0.28± 0.15± 0.20± 0.20± 0.16± 2.54± 0.01c 0.00a 0.00b 0.00b 0.00a 0.02g 0.02± 0.14± 0.97± 0.85± 0.29± 14.58± 0.00a 0.00b 0.00e 0.00d 0.00c 0.31h 2.67± 2.16± 2.16± 26.43± 41.95± 0.96± 0.08e 0.05d 0.01d 0.01f 0.02g 0.02a 0.42± 0.33± 0.17± 0.08± 0.00e 0.01d 0.01c 0.00a 94.35± 95.78± 80.55± 58.44± 42.93± 40.29± 1.76h 1.69i 0.06f 0.02d 0.04b 0.38a 0.02± 0.02± 0.03± 0.20± 0.07± 0.57± 0.00a 0.00a 0.00a 0.00c 0.00b 0.00e 0.02± Tr 10.90± 7.63± 0.10± 2.61± 0.00a 0.01f 0.00d 0.00b 0.02c 0.39± 0.43±0 Tr 0.11± 0.04± 0.31± 0.00e 02f 0.00b 0.00a 0.00d CĐL 1.74± 0.02h 1.76± 0.02f 6.73± 0.07g 1.68± 0.01b 0.18± 0.00c 53.41± 0.29c 0.21± 0.00c 12.14± 0.21g 0.30± 0.00d CĐ 1.50± 0.02g 1.27± 0.00e 6.10± 0.02f 1.78± 0.02c 0.19± 0.00c 70.56± 0.15e 0.30± 0.00d 10.40± 0.04e 0.17± 0.00c Các ký tự giống hàng sai khác khơng có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0.05) 10 Bảng 3.4 Thành phần hóa học tinh dầu (%w/w) CLA CĐL CĐ CX CV BTTr BThT BĐH f b e g a h c α-pinene 1.30±0.02 0.48±0.02 0.98±0.01 1.50±0.01 0.31±0.00 1.79±0.02 0.53±0.02 0.59±0.02d β-pinene 16.93±0.02f 1.69±0.02a 2.70±0.01b 9.68±0.05e 19.27±0.02g 3.77±0.02c 4.31±0.00d g f e d a myrcene 4.73±0.02 3.9±0.01 1.99±0.02 1.76±0.01 0.32±0.00 0.43±0.07b 0.48±0.02c c d e a b h limonene 13.78±0.09 14.33±0.00 21.87±0.01 12.21±0.01 13.33±0.07 30.11±0.07 26.73±0.10f 28.19±0.08g (Z)-β-ocimene 7.49±0.06f 1.90±0.02b 6.35±0.03e 3.91±0.04d 3.49±0.00c 0.11±0.00a f c g h a e b ٧-terpinene 2.06± 0.01 0.51±0.01 2.59±0.01 4.34±0.02 0.24±0.01 1.18±0.00 0.3±0.00 0.81±0.00d p-cymene 4.94±0.06c 1.51±0.05a 3.27±0.05b f a e d b linalool 5.74±0.01 1.17±0.06 3.09±0.07 1.71±0.02 1.24±0.21 1.55±0.04c b c a citronellal 0.70±0.00 4.16±0.04 0.51±0.00 4.94±0.09d 13.97±0.00e 26.82±0.04f 32.38±0.05g f d terpinen-4-ol 5.74±0.01 1.21±0.04 0.79±0.01c 1.83± 0.01e 0.29±0.00b 0.13±0.00a b c nerol 3.79±0.06 10.37±0.08 1.07±0.00a e c d geranial 5.62±0.08 2.30±0.01 3.29±0.00 17.73±0.08f 1.97±0.01b 1.31±0.02a 1.95±0.02b neral 0.08±0.03a 3.09±0.05e 4.17±0.07f 2.43±0.02d 11.55±0.07g 1.38±0.01b 1.64±0.02c 2.44±0.01d citronellol 1.71±0.01b 3.19±0.04c 1.09±0.01a 4.21±0.09d 4.50±0.05e c f h g d e β1.86±0.02 4.06±0.02 6.76±0.03 4.44±0.07 2.55±0.01 3.37±0.00 0.60±0.00b 0.30±0.00a caryophyllene Cấu tử Các ký tự giống hàng sai khác khơng có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0.05) 11 3.1.4 Hoạt tính kháng khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn tinh dầu vỏ Citrus thể Bảng 3.5 3.6 Kết cho thấy tất các mẫu tinh dầu có khả kháng khuẩn mạnh chủng vi sinh vật kiểm định Riêng tinh dầu cam Xồn khơng cho thấy khả ức chế P.aeruginosa Bảng 3.5 Đường kính vịng kháng khuẩn tinh dầu vỏ (mm) S.aureus CĐ CĐL CLA CX CV CPT BĐH BThT BTTr Streptomycin B.cereus e 24.00 ±0.25 21.67±0.29cd 23.82±0.52e 20.67±0.14ab 20.00±0.00a 20.92±0.14bc 27.17±0.29f 21.58±0.14cd 26.83±0.14f 23.53±0.20e P.aeruginosa f 26.67±0.29 22.42±0.38d 28.17±0.29g 17.17±0.29a 24.17±0.29e 18.42±0.14b 26.17±0.29f 24.83±0.14e 20.42±0.14c 23.60±0.30e e 28.67±0.29 22.33±0.38c 23.33±0.29d 19.00±0.25a 23.58±0.14d 20.58±0.14b 22.33±0.29c 21.83±0.14c 20.08±0.14b 21.50±0.20c S.typhi 28.83±0.29f 23.17±0.14d 26.33±0.29e 17.08±0.14a 23.00±0.00cd 20.33±0.29b 22.58±0.38cd 22.42±0.14c 20.42±0.14b 22.60±0.30cd Các ký tự giống hàng sai khác khơng có ý nghĩa mặt thống kê (p