KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài NGHIÊN CỬU PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA METAGENOME HỆ VI KHUÂN TRONG DẠ CỎ DÊ Người hướng dẫn TS Nguyễn Thị Trung Sinh viên thực hiện Nguyễn Bảo Hân 1302 K20 HÀ NỘI 2017 VIỆN.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỬU PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA METAGENOME HỆ VI KHUÂN TRONG DẠ CỎ DÊ Người hướng dẫn :TS Nguyễn Thị Trung Sinh viên thực :Nguyễn Bảo Hân :1302.K20 HÀ NỘI-2017 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CổNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA METAGENOME HỆ VI KHUÁN TRONG DẠ CỎ DÊ Giáo viên hướng dẫn : TS.Nguyễn Thị Trung Sinh viên thực : Nguyễn Bảo Hân Lóp : 1302 - K20 Hà Nội-2017 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT I DANH MỤC HÌNH II DANH MỤC BÁNG III LỜI MỞ ĐẦU A Lý chọn đề tài B Mục tiêu c Ý nghĩa thực tiễn PHẦN I TÔNG QUAN Tống quan chung tiêu hóa sổ động vật nhai lại 1.1 1.1.1 Khái niệm động vật nhai lại 1.1.2 Cấu trúc hệ tiêu hóa động vật nhai lại 1.1.2.1 Cấu trúc chung hệ tiêu hóa động vật nhailại 1.1.2.2 Cấu trúc hệ tiêu hóa dê 1.1.2.3 Sự nhai lại 1.1.3 1.2 Cấu trúc hệ vi sinh vật hệ tiêu hóa cùa động vật nhai lại 1.1.3.1 Vi khuẩn 1.1.3.2 Động vật nguyên sinh 1.1.3.3 Nấm 10 Tổng quan DNA metagenome 10 1.2.1 Các khái niệm DNA metagenome 10 1.2.1.1 Khái niệm metagenome 10 1.2.1.2 Khái niệm metagenomic 11 Nguyễn Bào Hân - K20.1302 Khóa luận tốt nghiệp 1.2.2 1.3 Khoa Công nghệ sinh học Khái niệm thư viện DNA metagenome 12 Tống quan tách chiết tinh DNA metagenome 13 1.3.1 Tổng quan số phương pháp tách chiết DNA metagenome 13 1.3.1.1 Phương pháp Repeated bead beating plus column (RBBC) 13 1.3.1.2 Phương pháp Repeated bead beating (RBB) 14 1.3.1.3 Phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP1) 14 1.3.1.4 Phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP2) 14 1.3.1.5 Phương pháp QIAamp® DNA Stool Mini Kit (QIA) 14 1.3.2 Tong quan ve so phương pháp tinh DNA metagenome 15 1.3.2.1 Tinh phương pháp điện di gel 15 1.3.2.2 Tinh bàng cột ly tâm (cột tinh DNA) 15 1.3.2.3 Tinh bàng túi thẩm tích (màng bán thấm) 16 1.3.3 Xác định độ DNA 16 PHÀN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ 18 2.1 Vật liệu nghiên cứu 18 2.1.1 Vật liệu 18 2.1.2 Hóa chất, vật tư nghiên cứu 18 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Thu thập, xứ lý băo quán mầu dịch cỏ dê 20 2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA metagenome 22 2.2.2.1 Phương pháp Repeated bead beating plus column (RBBC) 22 2.2.2.2 Phương pháp Repeated bead beating (RBB) .24 2.2.2.3 Phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP 1) 24 Nguyễn Bào Hân - K20.1302 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học 2.2.2.4 Phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP2).26 2.2.2.5 Phương pháp QIAamp® DNA Stool Mini Kit (QIA) 26 2.2.3 Kiểm tra chất lượng tính tồn vẹn củaDNAmetagenome 27 2.2.4 Nhân bội PCR với cặp mồi 16SrDNAvikhuẩn 29 PHÀN III: KÉT QUẢ VÀ THÁO LUẬN 31 Thu thập mầu vi sinh từ cỏ dê 31 3.1 3.1.1 3.1.1.1 Hình ánh mơi trường sống cúa lồi dê thu mầu 31 3.1.1.2 Thu cỏ dê 33 3.1.2 3.2 Thu mẫu cỏ dê 31 Thu mẫu vi sinh từ cỏ dê 34 Tách chiết DNA metagenome 35 3.2.1 Tách chiết DNA metagenome phương pháp sử dụng hạt thủy tinh (RBB) 36 3.2.2 Tách chiết DNA metagenome bàng phương pháp sứ dụng hạt thúy tinh tinh cột Qiagen (RBBC) 36 3.2.3 Tách chiết DNA mctagenome phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP1) 37 3.2.4 Tách chiết DNA metagenome phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP2) 38 3.2.5 Tách chiết DNA metagenome bàng phương pháp ỌlAamp® DNA Stool Mini Kit (QIA) 39 3.3 Tinh DNA metagenome 40 3.4 Đánh giá chất lượng cùa mẫu 40 3.5 Đánh giá khả tồn chất ức chc polymerase mẫu DNA metagenome 42 Nguyễn Bảo Hân - K20.1302 Khóa luận tốt nghiệp 3.6 Khoa Công nghệ sinh học Tách chiết đú khối lượng DNA metagenome bàng phương pháp PSP1 44 KẾT LUẬN 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 Nguyễn Bào Hân - K20.1302 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ETDA Ethylendiamin Tetraacetic Acid DNA Deoxyribonucleic acid DNase Deoxyribonuclease dNTPs Deoxyribonucleotides OD Optical Density PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction (phán ứng chuồi) PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis RNase Ribonuclease 1-RNA Ribosomal Ribonucleic Acid SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris- acetate- EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine Taq Polymerase Thermus aquaticus TE Tris- EDTA Nguyễn Bảo Hân - K20.1302 I Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo dày kép cùa gia súc nhai lại Hình 1.2 Cấu trúc hệ tiếu hóa dê Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp thu mẫu vi khuấn từ dịch cò dê 21 Hình 3.1 Dê cỏ núi Ninh Bình 31 Hình 3.2 Dê Bách Thào 32 Hình 3.3 Dê Lai Boer 33 Hình 3.4 Hình thái vị trí lấy mẫu 33 Hình 3.5 Hình thái mầu vi sinh vật thuđược từ vùng tương ứng có dê .34 Hình 3.6 DNA mctagcnomc tách chiết phương pháp sử dụng hạt thúy tinh RBB 36 Hình 3.7 DNA metagenome tách chiết phương pháp sử dụng hạt thùy tinh RBB tinh cột Qiagen 37 Hình 3.8 DNA metagenome tách chiết phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP1) 38 Hình 3.9 DNA metagenome tách chiết phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP2) 38 Hình 3.10 DNA metagenome tách chiết phương pháp QIAamp® DNA Stool Mini Kit (QIA) 39 Hình 3.11 Sản phẩm PCR khuếch đại gcn mã cho 16s rDNA mẫu DNA thu từ phương pháp tách chiết khác 43 Hình 3.12 Kết điện di kiểm tra mẫu DNA metagenome tách phương phápPSPl 45 Nguyễn Bào Hân - K20.1302 II Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Báng 2.1 Các thiết bị nghiên cứu sứ dụng đề tài 19 Bàng 2.2 Trình tự mồi 16s rDNA 29 Báng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 30 Bang 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 30 Bàng 3.1 Đặc điểm thức ăn tìm thấy khoang, giá trị pH nhiệt độ 35 Báng 3.2 Nồng độ độ tinh cứa DNA metagenome sứ dụng phưoug pháp tách chiết khác 41 Bàng 3.3 Kết quă đo quang phổ 10 mầu DNA metagenome ngầu nhiên tách chiết phưoug pháp PSP1 46 Nguyễn Bào Hân - K20.1302 III Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tơt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU A Lý chọn đề tài Dê số động vật nhai lại sừ dụng nguồn thức ăn chủ yếu cỏ, rơm rạ Đe tiêu hóa nguồn thức ăn nghèo dinh dưỡng này, động vật nhai lại có hệ tiêu hóa phù hợp với dày kép gồm bốn ngăn: cỏ, tố ong, sách múi khế Dạ cò lớn môi trường sinh sống cúa hệ vi sinh vật phong phú Ước tính có khoảng 10" tế bào vi sinh vật gram dịch cỏ, bao gồm vi khuân, tảo, nấm, động vật nguyên sinh virus thuộc nhiều loài chi khác Hệ vi sinh vật tham gia vào chuyển hóa lignocellulose thành đường đơn, cung cấp lượng cho Vì nguồn gcn tiềm cho việc khai khác gcn mã hóa enzyme phân giãi lignocellulose Nghiên cứu metagenome phương pháp phân tích DNA metagenome tất vi sinh vật thu nhận trực tiếp từ mẫu mơi trường tự nhiên Từ đó, nhiều thư viện DNA metagenome cúa vi sinh vật môi trường sống xây dựng nhằm khai thác gcn nghiên cứu đa dạng vi sinh vật, ví dụ mơi trường nước biến, mơi trường đất Đe có kết phân tích liệu DNA metagenome đáng tin cậy, trước hết DNA metagenome tách chiết phái đám báo chất lượng nồng độ Yêu cầu mầu DNA metagenome dùng cho giải trinh tự bàng hệ thống giải trình tự A260/280 phải đạt 1,8 A260/230 1,5, tức mẫu phái protein chất thứ cấp khác, đặc biệt axit formic Nhìn điện di đồ, DNA metagenome phải đảm báo tính tồn vẹn, khơng bị phân cắt, nồng độ phải đạt 50 ng/pl Đồng thời, mẫu DNA metagenome khơng cịn chất ức chế enzyme tổng hợp chuồi ví dụ enzyme polymerase Do Nguyễn Báo Hân - K20.1302 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học Hình 3.7 cho thấy DNA mctagcnomc thu có kích thước lớn 10 kb Sau DNA tách chiết phương pháp sứ dụng hạt thúy tinh RBB, DNA metagenome tinh cột Qiagen Kết nhận băng DNA rõ nét, vệt DNA khơng cịn nhiều màng cùa cột tinh giữ lại chủ yếu DNA kích thước lớn Hình 3.7 DNA metagenome tách chiết bàng phương pháp sử dụng hạt thủy tinh RBB tinh cột Qiagen Đường chạy 1: Lần tách thứ 1, 2: lần tách thứ 2, 3: lần tách thứ 3, M: Thang chuẩn DNA Ikb (Fermentas) 3.2.3 Tách chiết DNA metagenome phương pháp PSP®Spin Stool DMA Kit, protocol (PSP1) Mầu vi sinh vật thu từ cỏ tách chiết DNA metagenome bàng phương pháp PSP1 Kết DNA mctagenomc tách chiết điện di kiểm tra gel agarose 0,8% (Hình 3.8) Ket điện di Hình 3.8 cho thấy DNA metagenome thu có kích thước lớn 10 kb Các băng DNA thu lần tách chiết tập tiling kích thước, rõ nét Khơng thấy vệt DNA bị đứt gãy hình ánh điện di Nguyễn Báo Hân - K20.1302 37 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tơt nghiệp M Hình 3.8 DNA metagenomc tách chiết phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP1) Đường chạy 1: Lần tách thứ 1,2: lần tách thứ 2, 3: lần tách thứ 3, M: Thang chuẩn DNA Ikb (Fermentas) 3.2.4 Tách chiết DNA metagenome phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP2) Mầu vi sinh vật thu từ cỏ tách chiết DNA metagenome phương pháp PSP2 Kết DNA metagcnomc tách chiết điện di kiếm tra gel agarose 0,8% (Hình 3.9) M Hình 3.9 DNA metagenome tách chiết phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP2) Đường chạy 1: Lần tách thứ 1, 2: lần tách thứ 2, 3: lần tách thứ 3, M: Thang chuẩn DNA Ikb (Fennentas) Nguyễn Báo Hân - K20.1302 38 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tơt nghiệp Kct điện di Hình 3.9 cho thấy DNA mctagcnomc thu có kích thước lớn 10 kb Tương tự tách phương pháp SPS1, kết thu nhận băng DNA từ phương pháp SPS2 tốt Tuy nhiên, dái kích thước băng DNA từ l-5kb xuất phông bắt màu, chứng tó có DNA bị đứt gãy nhimg số lượng không nhiều 3.2.5 Tách chiết DNA metagenome phương pháp QIAamp® DNA Stool Mini Kit (QIA) Mầu vi sinh vật thu từ có tách chiết DNA metagenome phương pháp QIAamp® DNA Stool Mini Kít (ỌIA) Kết DNA metagenome tách chiêt điện di kiêm tra gel agarose 0,8% (Hình 3.10) M Hình 3.10 DNA metagenome tách chiết phương pháp QIAamp® DNA Stool Mini Kit (QIA) Đường chạy 1: Lần tách thứ 1,2: lần tách thứ 2, 3: lần tách thứ 3, M: Thang chuẩn DNA Ikb (Fcrmcntas) Kct điện di Hình 3.10 cho thấy DNA mctagcnomc thu có kích thước lớn 10 kb Các băng DNA metagenome thu từ lần tách chiết tập trung khơng sắc nét Chứng tó lượng DNA thu không nhiều Nguyễn Báo Hân - K20.1302 39 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học 3.3 Tinh DNA metagenome Ban đầu chúng em dự kiến sứ dụng phương pháp bầy máng tinh kít tinh để tinh DNA metagenome thu Từ kết DNA metagenomc thu nhận phân tích điện di gcl agarose, định không tiếp tục tinh thêm DNA mctagcnomc Thực phương pháp tách chiết mà chúng tơi sử dụng có tới phương pháp sứ dụng cột đê tinh DNA metagenome tách chiết Do đó, hình ảnh điện di (Hình 3.7, Hình 3.8, Hình 3.9 Hình 3.10) cho thấy băng DNA metagenome thu có kích thước lớn hon 10 kb Băng DNA metagenome thu rõ nét, khơng thấy có dải DNA đứt gãy phía Riêng kết Hình 3.9 chi có lượng nhỏ DNA bị đứt gãy, nhiên số lượng tiên đốn khơng nhiều Đối với kết Hình 3.6 DNA metagenome tách bàng phương pháp sử dụng hạt thúy tinh không sử dụng cột tinh chế thi thu nhiều DNA Nhưng DNA metagenome bị đứt gãy khơng cịn ngun vẹn bị lẫn sổ tạp chất Các băng DNA thu tồn trạng thái cưa kéo đuôi thành vệt đen vị trí kb Tuy nhiên, sử dụng cột QIA đế tinh sàn phấm DNA mctagcnomc băng đứt gãy, lần tạp chất bị loại bó, chi có phần DNA tương đối nguyên vẹn thu lại (Hình 3.7) 3.4 Đánh giá chất lưọĩig cùa mẫu Các mẫu DNA metagenome lượng DNA chi số A260/280 A260/230 thu sử dụng phương pháp tách chiết khác kiếm tra máy Nanodrop (Bảng 3.2) Nguyễn Báo Hân - K20.1302 40 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học Bảng 3.2: Nồng độ độ tinh cùa DNA mctagcnomc sử dụng phương pháp tách chiết khác Phương Nồng độ DNA pháp metagenome (ng/pl) RBBC A260/280 A260/230 61,70 ±28,84 1,930 ±0,111 2.097 ± 0,387 RBB 143,5 ±20,51 1,878 ±0,011 1,462 ±0,008 PSP1 149,7 ±29,94 1,921 ± 0,031 1,832 ±0,394 PSP2 195,5 ±98,29 1,893 ±0,001 1,902 ±0,020 QIA 55,93 ± 42,34 1,887 ±0,096 1,797 ±0,677 Nồng độ DNA thu cao đáng kế tách chiết kit PSP, 149,7 195,5 ng/pl cho protocol và phương pháp RBB 143,5 ng/pl Tuy nhiên, DNA tách chiết bang phương pháp RBB sau sử dụng cột tinh QIAgcn (RBB+C) nồng độ DNA mctagcnomc bị giảm hai lần Nồng độ DNA thu từ phương pháp RBBC mẫu DNA metaenome vi khuẩn ruột dê không cao mẫu mà Yu Morrison tách chiết [31] Nồng độ DNA tách chiết trực kít QIAgen thấp so với phương pháp lại, kết quâ tương ứng với kết số nghiên cứu phương pháp tách chiết DNA từ dịch cở động vật nhai lại khác [12], [5] Dịch cỏ dỗ động vật ăn cỏ khác chứa nhiều tạp chất có nguồn gốc từ thực vật tannin, saponin, mimosine nitrate-nitrite Nguyễn Báo Hân - K20.1302 41 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học [16], Trong đó, tannin số hợp chất chứa nhóm phenol tự có ãnh hướng đến hiệu sứ dụng DNA tách chiết cho mục đích sinh học phân tử PCR, cắt giới hạn giải trinh tự ức chế hoạt động enzyme polymerase endonuclease [26], [20] Do đó, ngồi hàm lượng DNA, chất lượng DNA tách chiết cịn xác định dựa chì số A260/230 (xác định có mặt cùa carbohydrate, hợp chất chứa nhóm phenol) A260/280 (cho protein) DNA cho “sạch” số A260/280 1,8 A260/230 2,0 (có thể chấp nhận từ 1,5 đến 1,8) Tất phương pháp tách chiết DNA metagenome sứ dụng cho nghiên cún cho kết số A260/280 1,8 DNA tách chiết đạt tiêu chuẩn hàm lượng carbohydrate hợp chất phenol mẫu, chi có phương pháp RBB cho kết A260/230 thấp (1,462) Điều cho thấy, phương pháp có khả loại bỏ protein trình tách chiết chi phương pháp có sử dụng cột tinh có thê loại bỏ đáng kê hợp chất không mong muốn khác mẫu DNA tách chiết từ cỏ dê Như vậy, DNA tách chiết từ phương pháp RBBC, sử dụng kít thương mại PSP QIAgen đạt tiêu chuấn độ tinh hai số A260/280 A260/230 3.5 Đánh giá khả tồn chất ức chế polymerase mẫu DNA metagenome Đe khẳng định chắn DNA thu có thổ sứ dụng đế giải trình tự phục vụ mục đích khai thác liệu DNA metagenome, tiến hành thực khuếch đại gen mã cho 16S rRNA vi khuẩn bàng PCR với cặp mồi 1527R-27F DNA thu từ phương pháp tách chiết sau đưa nồng độ Kết điện di sán phấm PCR gel agarose tương úng với dự đốn Chúng tơi quan sát thấy có băng sàn phẩm PCR có kích thước khống 1500 bp tất mầu DNA trừ mầu tách chiết phương Nguyễn Báo Hân - K20.1302 42 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tơt nghiệp pháp RBB Điều phàn ánh kết đo chi số A260/230, chứng tỏ mẫu chứa nhiều tạp chất ảnh hướng tới hiệu cúa PCR PSP1 RBBC RBB PC M PC M PC 231 PSP2 23M QIA PC123M Hình 3.11 Sân phấm PCR khuếch đại gen mã cho 16s rDNA cúa mẫu DNA thu từ phưong pháp tách chiết khác Đường chạy 1: Lần tách thứ 1, 2: lần tách thứ 2, 3: lần tách thứ 3, PC: đối chứng dương, M: Thang chuẩn DNA Ikb (Fennentas) Kct quả, DNA mctagcnomc tách từ năm phương pháp có chi số A260/280 đạt 1,8 Mặc dù phương pháp RBB cho nồng độ DNA cao khơng tinh chế nên DNA từ mẫu có chi số A260/230 thấp, chi đạt khoáng 1,4 mầu chất ức chế Taq polymerase Mầu tách từ RBB sau tinh lại cột Qiagen có chi so A260/230 tăng lên đáng kể, đạt khoảng 2,0 khơng cịn chất ức chế Taq polymerase hàm lượng nồng độ DNA metagenome giám 57% đạt gần tương đương với DNA metagenome tách Q1A Phương pháp sừ dụng kit tách chiết PSPOSpin Stool DNA cho nồng độ DNA metagenome thu cao (từ 149,7 đến 195,5 ng/pl), số A260/280 đạt khống 1,9 A260/230 đạt 1,8-1,9, khơng cịn chất ức chc Taq polymerase tiêu tốn Nguyễn Báo Hân - K20.1302 43 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học thời gian Vi vậy, phương pháp thích họp cho tách chiết DNA metagenome cùa vi khuẩn ruột dê DNA thu từ phưong pháp đủ chất lượng cho việc giải trình tự thiết bị giải trình tự DNA hệ Illumina Tóm lại, phương pháp mang lại hiệu tách chiết định Trong đó, phương pháp RBBC, PSP1, PSP2 QIA cho kết thu DNA đạt tiêu chuân vê độ tinh sạch, có thê sử dụng cho thí nghiệm vê sau PCR, cắt giới hạn giải trình tự Xét hiệu tách chiết, thực phương pháp RBBC cần từ 20 đến 30 phút sử dụng kít tinh thương mại tiêu tốn thời gian hàm lượng DNA thu tương đương cao 3.6 Tách chiết đủ khối lượng DNA metagenome phương pháp PSP1 Đe giải trình tự thiết bị giái trình tự DNA hệ Illumina cần lượng DNA 50 pg Như đố đủ lượng DNA mctagcnomc sứ dụng phương pháp PSP1 đế tách chiết DNA metagenome Các mẫu tách riêng lẻ kiểm tra điện di gel agarose 0,8%, đo nồng độ tính độ trước chuyền chung vào ống lưu trừ Kết Hình 3.12 minh họa số lần tách chiết DNA metagenome vi sinh vật từ dịch cỏ dê phương pháp PSP1 Kết đo nồng độ độ cùa mầu tương ứng trình bày băng 3.3 Nguyễn Báo Hân - K20.1302 44 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp 234 6789 10 M Hình 3.12 Kết điện di kiêm tra mẫu DNA metagenome tách phương pháp PSP1 Đường chạy 1-10: 10 mẫu DNA metagcnomc từ 10 lần tách chiết, chạy pl dịch DNA metagcnome cho giếng, M: Thang chuẩn DNA Ikb (Fermentas) Sản phẩm DNA mctagcnomc hệ vi sinh vật cỏ dê tách chiết lượng lớn phương pháp PSP1, tiến hành điện di kiếm gel agarose 0.8% Nhìn vào hình ảnh kết quà điện di nhận thấy đường chạy 10 mẫu DNA metagenome từ hệ vi sinh vật có dê xuất băng đậm có kích thước Okb Các băng điện di sáng, tập trung bị phân cắt Điều chứng tỏ khơng có DNA bị đứt gãy q trình tinh Như vậy, chúng em tách chiết tinh DNA metagenome gần toàn vẹn Kết đo mầu cho thấy tất các mẫu đạt độ tinh A260/280 1.9 (yêu cầu tối thiếu cao 1.8) Nồng độ DNA cùa mầu thu phần lớn khoảng từ 100 đến 200 ng/pl Tống lượng DNA metagenomic tinh 50 pg Do đó, mẫu DNA metagenome vi Nguyễn Báo Hân - K20.1302 45 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học khuấn cỏ dê đạt tiêu chuấn đế thực trình giải trình tự Bảng 3.3 Ket quà đo quang phổ cúa 10 mẫu DNA metagenome ngẫu nhiên tách chiết phương pháp PSP1 Mẩu Nồng độ (ng/ul) A260/280 214 ± 16,97 1,966 ±0,00071 156,5 ±38,89 1,933 ±0,03111 152,5 ±6,364 1,965 ±0,01485 166,5 ±2,121 1,956 ±0,003536 117,5 ±9,192 1,967 ±0,002121 216 ± 12,73 1,964 ±0,01697 77 ±35,36 1,962 ±0 179 ± 15,56 1,951 ±0,004243 181,5 ± 14,85 1,959 ±0,03465 10 259 ± 21,21 1,963 ±0,007778 Nguyễn Báo Hân - K20.1302 46 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tơt nghiệp KẾT LUẬN Chúng em thứ nghiệm phương pháp khác RBB, RBBC, PSP1, PSP2 QIA đế tách chiết DNA mctagcnomc cúa vi khuẩn cỏ dê Kết cho thấy: I Tất câ phương pháp tách chiết RBB, RBBC, PSP1, PSP2 QIA tách DNA mctagcnomc Các phương pháp tách chiết RBBC, PSP1, PSP2 QIA thu DNA mctagcnomc có nồng độ cao, độ đám bảo Tách chiết kit PSP cho sản phấm DNA có chất lượng đảm báo cho giái trình tự DNA metagenome hệ thống HiSeq 2000 (Illumina) với chì số A260/280 1,893; A260/230 1,902 nồng độ cao đạt 195,5 ng/pl Sử dụng phương pháp PSP1 tách chiết 50 pg DNA mctagcnomc vi sinh vật từ dã cỏ dê đú chất lượng đổ giải trình tự gen Nguyễn Báo Hân - K20.1302 47 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Dô Bách Thào, Wikipedia tiếng Việt (2015) Dê có Wikipedia tiếng Việt (2015) Dê lai Boer, Wikipedia tiếng Việt (2015) Tài liệu tiếng Anh Allen, Eric E., and Jillian F Banfield (2005) "Community genomics in microbial ecology and evolution." Nature Reviews Microbiology 3.6: 489- 498 Chen K, Pachter L (2005) Bioinformatics for Whole-Genome Shotgun Sequencing of Microbial Communities PLoS Comput Biol 1(2): e24 doi: 10.1371/journal.pcbi.OO 10024 Cowan D, Meyer Q, Stafford William, Muyanga s, Cameron R, Wittwer p (2005), Metagenomic gene discovery: past, present and future, TRENDS in Biotechnology, 23(6), 321-329 Cunha IS, Barreto cc, Ct al (2011), Bacteria and Archaea community structure in the rumen microbiome of goats (Capra hircus) from the semiarid region of Brazil, Anaerobe, 17 (3), pp 118-124 Czerkawski JW, and Cheng KJ, (1988), Compartmentation in the rumen, in The rumen microbial ecosystem, Elsevier Science Publishing, London, pp 361- 385 Dehority BA, Grubb AJ, (1980), Effect of Short-Term Chilling of Rumen Contents on Viable Bacterial Numbers, Appl Environ Microbiol 39(2), pp Nguyễn Báo Hân - K20.1302 48 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 376-381 10 Flint HJ, Thomson AM, (1990), Deoxyribonuclease activity in isolated rumen bacteria and rumen fluid Lett Appl Microbiol 11, pp 18-21 11 Handclsman J, Rondon M R, Brady s F, Clardy J, Goodman R M (1998) Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products Chern Biol.-, 5:R245-R249 12 Henderson G, Cox F, Kittelmann s, Miri VH, Zethof M, Noel SJ, Waghom GC, Janssen PH (2013) Effect of DNA extraction methods and sampling techniques on the apparent structure of cow and sheep rumen microbial communities PLoS ONE 9:e74787 13 Hultman J, Auvinen p, (2010), Metagcnomics opens up new frontiers in microbiology, duodecim, 126(11), 1278-1285 14 Jami E, Israel A, Kotser A, Mizrahi I, (2013), Exploring the bovine rumen bacterial community from birth to adulthood, The ISME journal, (6), pp 1069-1079 15 Jenkins T, Wallace R Moate p, Mosley E, (2008), Board-invited review: Recent advances in biohydrogenation of unsaturated fatty acids within the rumen microbial ecosystem, Journal ofanimal science, 86 (2), pp 397-41 16 Kamra D, (2005), Rumen microbial ecosystem, Current science, 89 (1), pp 124-135 17 Kim M, Morrison M, Yu z, (2011), Status of the phylogenetic diversity census of ruminal microbiomes, FEMS microbiology ecology, 76 (1), pp 49- 63 18 Kocherginskaya SA, Aminov RI White BA, (2001), Analysis of the rumen bacterial diversity under two different diet conditions using Nguyễn Báo Hân - K20.1302 49 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp denaturing gradient gel electrophoresis, random sequencing, and statistical ecology approaches, Anaerobe, (3), pp 119-134 19 Koike s, and Kobayashi Y, (2009), Fibrolytic rumen bacteria: their ecology and functions, Asian-Aust J Anim Sci, 22, pp 131-138 EJ, 20 Kontanis Reed FA, (2006), Evaluation of real- time PCR amplification efficiencies to detect PCR inhibitors J Forensic Sci 51(4), pp 795-804 21 Krause D, Nagaraja T, Wright A, Callaway T, (2013), Board-invited review: Rumen microbiology: Leading the way in microbial ecology, Journal of animal science, 91 (1), pp 331 -341 22 Liggenstoffer AS, Youssef NH, Couger M, Elshahed MS, (2010), Phylogenetic diversity and community structure of anaerobic gut fungi (phylum Neocalỉimastigomycotà) in ruminant and non-ruminant herbivores, The ISME journal, (10), pp 1225-1235 23 Lim s, Seo J, et al (2013), Metagenome analysis of protein domain collocation within cellulase genes of goat rumen microbes, Asian- Australasian journal ofanimal sciences, 26 (8), pp 1144 24 Mcallister T, Bae H, Jones G, Cheng K, (1994), Microbial attachment and feed digestion in the rumen, Journal of animal science, 72 (11), pp 30043018 25 Minato H, Mitsumori M, Cheng KJ, (1993), Attachment of microorganisms to solid substrate in the rumen, in Genetics, Biochemistry and Ecology of Lignocellulose Degradation, K Shimada, s Hoshino, K Ohmiya, K Sakka, Y.Kobayashi, and s Karita, Editors, Uni Publishers, Tokyo, pp 139- 145 26 Porebski s, Bailey LG, Baum BR (1997) Modification of a CTAB DNA Nguyễn Báo Hân - K20.1302 50 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components Plant Mol Biol Rep 15(1), pp 8-15 27 Rainey FA, Ward-Rainey N, Kroppenstedt RM, Stackebrandt E (1996) The genus Nocardiopsis represents a phylogenetically coherent taxon and a distinct actinomycete lineage: proposal of Nocardiopsaceae fam nov hit J Sys Evol Microbiol 46(4), pp 1088-1092 28 Rappe M, Giovannoni s (2003) The uncultured microbial majority Annu Rev Microbiol 57: 369-394 29 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, (2001), Molecular cloning: A laboratory manual, 3th ed., Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 30 Yu z, Morrison M, (2004), Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples Biotechniques 36(5), pp 808-813 Nguyễn Báo Hân - K20.1302 51 ... 3.2.5 Tách chiết DNA metagenome phương pháp QIAamp® DNA Stool Mini Kit (QIA) Mầu vi sinh vật thu từ có tách chiết DNA metagenome phương pháp QIAamp® DNA Stool Mini Kít (ỌIA) Kết DNA metagenome tách. .. mẫu cỏ dê 31 Thu mẫu vi sinh từ cỏ dê 34 Tách chiết DNA metagenome 35 3.2.1 Tách chiết DNA metagenome phương pháp sử dụng hạt thủy tinh (RBB) 36 3.2.2 Tách chiết. .. (Fermentas) 3.2.3 Tách chiết DNA metagenome phương pháp PSP®Spin Stool DMA Kit, protocol (PSP1) Mầu vi sinh vật thu từ cỏ tách chiết DNA metagenome bàng phương pháp PSP1 Kết DNA mctagenomc tách chiết điện