KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY TĂNG SINH VÀ TẠO MÀNG NGUYÊN BÀO SỢI TRÊN NÈN MÀNG POLYMER SINH HỌC PHB V Giáo viên hướng dẩn TS Đỗ Minh Trung Sinh viên thực hiện Nguyễn Thành.
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC ĐỀ TÀI : NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY TĂNG SINH VÀ TẠO MÀNG NGUYÊN BÀO SỢI TRÊN NÈN MÀNG POLYMER SINH HỌC PHB-V Giáo viên hướng dẩn : TS Đỗ Minh Trung Sinh viên thực : Nguyễn Thành Cơng Lớp : YD.13 Khóa luận tổt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC ĐẬT VẤN ĐÈ PHẦN I: TÒNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan nguyên bào sợi 1.1 Nguyên bào sợi 1.2 ứng dụng nguyên bào sợi Các thành tựu đạt từ nuôi cấy nguyên bào sợi Việt Nam 1.3 Các loại polymer sinh học 10 Polyhydroxyalkanoatcs - PHA 10 2.1 2.2 Polyhydroxybutyrate - PHB 11 2.3 Poly (3-hydroxybutyratc-co-3-hydroxyvalcrate) - PHB-V 12 2.4 ứng dụng cùa polyhydroxybutyrate 13 Tổng quan bỏng vết thương mạn tính 14 3.1 Thực trạng bỏng vết thương mạn tính 14 3.2 Tình hình nghiên cứu điều trị bóng vết thương mạn tính 19 3.2.1 Các phương pháp điều trị bỏng: 20 3.2.2 ứng dụng PHB y học tái tạo điều trị vết thương bóng 23 PHÀN II: VẬT LIỆU VÀ PHUƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 25 L VẬT LIỆU NGHIÊN củu 25 1.1 Đối tượng nghiên cứu 25 1.2 Hóa chất vật tư tiêu hao 25 1.3 Máy móc thiết bị nghiên cứu 25 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 26 2.1 Nuôi cấy tăng sinh tế bào 26 2.2 Bảo quán tế bào 26 2.3 Giải đông tế bào .26 2.4 Xác định mật độ tế bào 27 2.5 Tạo màng PHB-V 27 SVTH: Nguyền Thành Cơng GVHD: TS Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội 2.6 Nuôi cấy tế bào màng PHB-V 28 2.7 Địa điểm nghiên cứu 29 2.8 Xừ lý số liệu 29 PHẦN III: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Kct nuôi cấy tăng sinh tế bào nguyên bào sợi 30 3.2 Ket tạo màng PHB-V khảo sát điều kiện tạo màng tế bào nguyên bào sợi màng PHB-V 31 3.2.1 Tạo màng PHB-V 31 3.2.2 Kết quà kháo sát điều kiện tạo màng nguyên bào sợi màng PHB-V 32 3.2.2.1 Kết kháo sát nuôi cấy nguyên bào sợi màng PHB-V nồng độ khác 32 3.2.2.2 Kết nuôi cấy nguyên bào sợi màng PHB-V 0,75% thể tích khác 35 3.2.2.3 Kct nuôi cấy tăng sinh nguyên bào sợi màng PHB-V có mật độ tế bào ban đầu khác 37 3.2.2.4 Tạo màng tế bào nguyên bào sợi màng PHB-V 40 KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 SVTH: Nguyền Thành Công GVHD: TS Đồ Minh Trung Khóa luận tổt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CHŨ VIÉT TẮT ĐC Đối chứng EGF Epidermal growth factor Yếu tố tăng trưởng biểu bì HA H ydroxyal kanoates HB Hydroxybutyrate MCL-PHA Medium-chain-length-PHA PBS Phosphate buffered saline Dung dịch muối đệm photphat PHA Polyhydroxyalkanoates PHB Polyhydroxybutyrate PHB-V Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) PHV Polyhydroxyvalerate FBM Fibroblast Basal Medium FBS Fetal bovine serum Huyết bào thai bò Rtase Reverse Transcriptase SCL-PHA Short-chain-length-PHA TLR3 Toll-like receptor WHO World Health Organization Tổ chức Y tế giới SVTH: Nguyền Thành Cơng GVHD: TS Đồ Minh Trung Khóa luận tổt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội DANH MỤC BẢNG Báng 3.1 Kct quà mật độ tế bào nuôi cấy màng PHB-V nồng độ khác 34 Bàng 3.2 Kết mật độ tế bào nuôi cấy trôn màng PHB-V 0,75% thể tích khác 36 Bảng 3.3 Ket quà nuôi cấy tế bào màng PHB-V mật độ tế bào ban đầu khác 38 SVTH: Nguyền Thành Cơng GVHD: TS Đồ Minh Trung Khóa luận tổt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội DANH MỤC BIẾU ĐÒ Biểu đồ 3.1 Kết mật độ tế bào nuôi cấy màng PHB-V nồng độ khác 34 Biếu đồ 3.2 Ket mật độ tế bào nuôi cấy màng PHB-V 0,75% tích khác 35 Biếu đồ 3.3.a Ket nuôi cấy tế bào màng PHB-V mật độ tế bào ban đầu khác 37 Biếu đồ 3.3.b Kết so sánh nuôi cấy tế bào màng PHB-V mật độ tế bào ban đầu khác 38 SVTH: Nguyền Thành Công GVHD: TS Đồ Minh Trung Khóa luận tổt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Ngun bào sợi Hình 1.2 Cấu trúc khơng gian ba chiều cùa collagen Hình 1.3 Polyhydroxyalkanoates-PHA 10 Hình 1.4 Cấu trúc PHB-V 13 Hình 1.5 Các cấp độ bịng 14 Hình 1.6 Các loại thực vật chữa bỏng 22 Hình 1.7 Trung bì da lợn .23 Hình 2.1 Hình ãnh số máy móc thiết bị nghiên cứu 26 Hình 2.2 Quy trình tạo màng PHB-V 28 Hình 3.1 Hình ảnh kết nuôi cấy tăng sinh nguyên bào sợi 30 Hình 3.2 Hình ảnh kết quã tạo màng PHB-V 32 Hình 3.3 Hỉnh ảnh kết ni cấy tế bào màng PHB-V nồng độ khác .33 Hình 3.4 Hình ảnh màng PHB-V với lớp màng nguyên bào sợi nhuộm Giemsa quan sát vật kính I0X-20X-40X 40 SVTH: Nguyền Thành Công GVHD: TS Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội ĐẬT VẤN ĐÈ Da phận quan trọng Bên cạnh việc đóng vai trị rào cản the chống lại vi khuân vi rút, da cịn trì cân cùa chất giúp điều hòa nhiệt độ cùa thề Tuy nhiên, với phát triền không ngừng công nghệ xã hội, loại tổn thương da có chiều hướng tăng lên mạnh mẽ vết thương tia xạ, vết thương mạn tính tiếu đường, loét điếm tỳ bệnh lý thần kinh, loét bệnh lý mạch ngoại vi Theo Tố chức Y te giới (WHO) ước tính “Gánh nặng Bệnh tật Tồn cầu” cúa năm 2004 có 310.000 người tư vong vi bóng lừa, có 30% tuổi 20 Bỏng liên quan đen lứa nguyên nhân thứ tử vong trẻ em nhóm ti 5-14 Tính tơng thê, tré em có nguy bị tứ vong bỏng cao, với tý lệ toàn cầu 3,9 người chết 100.000 dân Trong số người tồn cầu, trẻ nhị có tỷ lệ tứ vong bòng cao Tý lệ tứ vong quốc gia có thu nhập thấp trung binh cao gấp lần so với quốc gia có thu nhập cao Theo nghiên cứu cúa ủy ban quốc gia phịng chống tai nạn thương tích Cục Y tế dự phòng năm 2007, số lượng tai nạn bòng nước đứng thứ hai chi sau tai nạn giao thông, với khoảng 20.000 đến 25.000 bệnh nhân bởng mồi năm số không ngừng tăng lên theo tìmg năm Theo thống kê Viện Bỏng quốc gia, năm Viện nhận điều trị cho khoảng 4.000 bệnh nhân bông, số lượng nạn nhân trẻ em chiếm 50% tồng số nạn nhân bỏng (khoảng 1.200 - 1.600 bệnh nhân/nãm) khoảng 3% số ca tiếp nhận ca nặng thường khơng qua khói Có nhiều phương pháp điều trị bỏng vết thương mạn tính dùng thuốc kích thích phát triến tế bào, dùng oxy cao áp, tia laser hiệu thấp, can thiệp phẫu thuật thường thất bại áp dụng sức khỏe bệnh nhân không cho phép phẫu thuật Các bác sĩ Viện SVTH: Nguyền Thành Công ĩ GVHD: T.s Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội Bóng quốc gia nghiên cứu áp dụng thành công phương pháp ghép nguyên bào sợi đồng loại nuôi cấy điều trị cho bệnh nhân bị vết loét mãn tính bệnh lý sau xạ trị ung thư Đây phương pháp áp dụng Việt Nam Với công nghệ này, chi cần phần da nhó, sau ni cấy, tế bào da có the tạo mảnh da với diện tích theo ý muốn đe ghép cho bệnh nhân Vì thế, điều trị cà vết loét rộng Đế điều trị vết thương, vết bỏng hiệu quá, bên cạnh việc tạo nguồn ứng dụng nguyên bào sợi việc kết hợp với vật liệu giá thể (màng sinh học) vô quan trọng Giá vừa vật liệu đế te bào sinh trướng phát triền tạo thành lófp màng tế bào bền chắc, dề dàng sử dụng che phú vết thương Hiện Poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) - PHB-V, biết đến nguồn cung cấp vật liệu sinh học có nhiều tiềm ứng dụng, có tự phân hủy, khơng độc hại, có tương thích sinh học cao có thê tông hợp từ vi khuân Do vậy, PHB-V ứng dụng nhiều lĩnh vực khác dược phấm vật liệu che phú Những đặc tính mong muốn mớ tiềm có the ứng dụng PHB-V vào y học, sứ dụng vật liệu có tính tương thích sinh học khơng độc hại thích hợp cho việc tạo vật liệu cấy ghép người Xuất phát từ vấn đề em tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy tạo màng nguyên hào sợi màng polymer sinh học PHB-V" với mục tiêu sau: Mục tiêu nghiên cứu: Nuôi cấy tăng sinh nguyên bào sọi Tạo màng nguyên hào sợi màng polymer sinh học PUB- V SVTH: Nguyền Thành Công GVHD: T.s Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội PHẦN I: TÓNG QUAN TÀI LIỆU Tong quan nguyên bào sọi 1.1 Nguyên bào sợi Nguyên bào sợi tế bào mơ liên kết thể, chịu trách nhiệm việc tạo chất ngoại bào, collagen Chất ngoại bào, collagen tạo nên khung cấu trúc đóng vai trị quan trọng việc tái tạo mơ động vật FIBROBLAST Hình ỉ Nguyên bào sợi (Nguồn: https://vn 123rf.com) Sự xuất nguyên bào sợi thay đồi tùy thuộc vào chức khu vực hoạt động cùa chúng Các nguyên bào sợi lấy từ địa điếm cụ thể “nhớ” vị trí chức ban đầu chúng cấy ghép vào vị trí khác thể Chức nguyên bào sợi trì tính tồn vẹn cấu trúc cho mơ liên kết Chúng làm điều bàng cách tiết tiền chất cần thiết cho hình thành mô liên kết sợi khác Các ngun bào sợi có nguồn gốc từ trung mơ Chúng có khả tăng trưởng mạnh loại tế bào chiếm ưu mô liên kết cùa thể, SVTH: Nguyền Thành Công GVHD: T.s Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội 0.75% 0.5% 1% Hình 3.3 Hình ảnh kết ni cấy tế hào màng PHlì-Vcác nồng độ khác (0.5, 0,75, 1, 1,25 %: nguyên bào sợi khảo sát nuôi cay màng PHB V nồng độ khác nhau; ĐC; Mau đối chứng nuôi cấy nguyên bào sợi đỉa nhựa) SVTH: Nguyền Thành Cơng 33 GVHD: T.s Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội Biểu đồ kết quà đếm tế bào khảo sát nuôi cấy tăng sinh tạo màng nguyên bào sợi màng PHB-V nồng độ Biếu đồ 3.1 Kết mật dộ tế bào nuôi cấy màng PHB-V nồng độ khác Bảng 3.1 Kết mật dộ tế bào nuôi cấy màng PHB- V nồng độ khác Nồng độ PHB-V (%) 0,5 0,75 1,25 ĐC Mật độ tế bào xio6 (n=5) 1,38 1,68 1,46 1,44 1,22 (Mean ± SD) ±0,86 ±0,46 ±0.59 ±0.66 ±0.73 Trong nghiên cứu khảo sát nuôi cấy tế bào màng PHB- V nồng độ khác từ 0,5% 1,25% để tìm nồng độ phù hợp nhất Ket nong độ PHB-V 0,5% số lượng tế bào/giếng đạt là: 1,38 ± 0,86 X1 o6 tể bào; 0,75%: 1,68 ± 0,46 X1 o6 tế bào; %: 1,46 ± 0,59 X1 o6; 1,25%: 1,44 ± 0,66 xio6 tế bào; mầu đối chứng (ĐC) là: 1,22 ± 0,73 X1 o6 tế bào Kết cho thấy nồng độ PHB-V 0,75% có số lượng tế bào cao sau nuôi cấy Trong nghiên cứu này, tất nồng độ màng PHB-V cho kết quă ni cấy có số lượng tế bào cao hon mầu đối chứng SVTH: Nguyền Thành Công 34 GVHD: T.s Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội nuôi cấy thông thường plate nhựa nuôi cấy Kốt thu cho thấy việc sứ dụng màng PHB-V nuôi cấy tăng sinh nguyên bào sợi thu kết quà tốt so với điều kiện thông thường Tuy nhiên đổ tiết kiệm nguyên vật liệu màng tạo có sổ lượng tế bào tối ưu Chính vậy, chúng tơi chọn sử dụng màng PHB-V nồng độ 0,75% cho nghiên cứu 3.2.2.2 Kết nuôi cấy nguyên bào sợi màng PHB-V 0,75% the tích khác Sau thứ nghiệm tạo màng PHB-V nồng độ 0,75% với the tích đổ màng khác từ 6ml, 7ml, 8ml, 9ml, 10ml đĩa petri có đường kính d = 10cm Kết q đánh giá thông qua số lượng tế bào sau ngày nuôi cấy thể biểu đồ 3.2 bâng 3.2 Biểu đồ kết đếm tế bào kháo sát nuôi cấy tăng sinh tạo màng nguyên bào sợi màng PHB-V tích 2,55 10 ĐC The tích màng PHB-V (ml) Biểu đồ 3.2 Kết dộ tế bào ni cấy màng PHB-V 0,75% thể tích khác SVTH: Nguyền Thành Công 35 GVHD: T.s Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội Bảng 3.2 Kết mật độ tế bào nuôi cấy màng PHB- V 0,75% thể tích khác Thể tích màng PHB-V 10 ĐC 2,0 2,05 2.15 2.55 2.15 1,95 ± ± ± ± ± ± 0,365 0,755 0,526 0,772 0,342 0,1 (ml) Số lượng tế bào xio6 (n=5) (Mean ± SD) Màng PHB-V tạo có độ dày khác nhau, khơng phụ thuộc vào nồng độ PHB-V hòa tan dung mơi mà cịn phụ thuộc vào tích đồ màng Độ dày mịng màng PHB-V có ành hưởng đến khả bám dính tăng sinh cùa tế bào hay khơng, chúng tơi tiến hành thí nghiệm tạo màng PHB-V có nồng độ 0,75% với thể tích khác 6ml, 7ml, 8ml, 9ml, 10ml đĩa pctri có đường kính d = 10cm Kết thu màng có độ dày khác Các màng sau hấp tiệt trùng 121°c, 15 phút tiến hành thử nghiệm làm giá thể nuôi nguyên bào sợi đe tìm màng PHB-V 0,75% tích cho kết tăng sinh tế bào tốt Kết thu cho thấy nguyên bào sợi nuôi màng PHB-V 0,75% thể tích 9ml cho kết cao 2,55 ± 0,772 xio6 tế bào; the tích 6ml cho kết thấp ± 0,365 xio6 Các thể tích khác cho kết 7ml: 2,05 ± 0,755 xio6; 8ml: 2,15 ± 0,526 xio6; 10ml: 2,15 ± 0,342 xio6 Tất thể tích cho số lượng tế bào cao mầu đối chứng (ĐC) là: 1,95 ±0,1 xio6 Kết cho thấy việc nuôi cấy tăng sinh nguyên bào sợi màng PHB-V đạt hiệu tốt hơn, tạo tiền đề cho nghiên cứu sau Chính vậy, chúng tơi định chọn tích màng PHB-V 0,75% có kết ni cấy tế bào tốt 9ml đế sứ dụng cho nghiên cứu SVTH: Nguyền Thành Công 36 GVHD: T.s Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội 3.2.2.3 Kết nuôi cấy tăng sinh nguyên hào sợi màng PHB- V có mật độ tế bào ban đầu khác Sau chọn nồng độ thể tích tốt màng PHB-V 0.75% - 9ml, chúng tơi tiếp tục tiến hành thí nghiệm nuôi cấy tăng sinh nguyên bào sợi màng PHB-V có mật độ tế bào ban đầu khác để tìm mật độ tế bào tối ưu cho thí nghiệm sau Các mật độ tế bào sử dụng thí nghiệm là: 3,4 xio4, 3,4 xio5 3,4 xio6 Kết quâ đánh giá thông qua số lượng tế bào sau ngày nuôi cấy thổ biếu đồ 3.3.a, biểu đồ 3.3.b bảng 3.3 Kết nuôi cấy tế bào màng PHB-V Kết nuôi cấy tê bào màng PHB-V nông độ tế bào ban đâu 10’ nồng độ tê bào ban đầu 10s Ongăy —»—10- Ongày 10 ngáy 12 ngày ngây ngày 10 ngày 12 ngày -•-10» -*-ĐC 10* (non-PHBV) —ĐC 10-(non-PHBV) Kết quâ nuôi cấy tế bào màng PHB-V nồng độ tê bào ban đâu 106 15 -*-10* —ĐC 10* (non-PHBV) Biếu đồ 3.3.a Kết nuôi cấy tế bào mùng PHB- V mật độ tế bào ban đầu khác SVTH: Nguyền Thành Cơng 37 GVHD: T.s Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội Biếu đồ 3.3.b Kết so sánh nuôi cấy tế bào màng PHB- V mật độ tế bào ban đầu khác Bủng 3.3 Kết qua nuôi cấy tế bào màng PHB-Vở mật độ tế bào ban đầu khác SLTBxlO6 (n=5) 104 (Mean ± SD) ĐC 104 (Mean ± SĐ) 105 (Mean ± SD) ĐC 10s (Mean ± SD) 106 (Mean ± SD) ĐC 106 (Mean ± SĐ) ngày ngày 1,25 ±0,35 0,75 ±0,35 7,75 ±1.06 6.25 ±0,35 11,75 ±1,06 ±0,7 2,75 ±0,35 1,75 ±0,35 12 ±0,707 ±1.41 12 ±2,12 10 ±1,41 5,75 ±0,35 4,25 ±1,06 11,5 ±1,414 ±0,70 11,75 ±1,06 10,75 ±1,06 7,75 ±1,06 ±0,70 11,5 ±0,707 10,5 ±0,70 11,25 ±0,35 10,75 ±3,18 giò- 0,017 0,017 0,17 0,17 1,7 1,7 10 ngày 12 ngày 10,2 10,2 ±0,35 ±1,06 6,75 7,5 ±1,06 ±0,70 11,25 10,25 ±2,474 ±0,353 9.75 9.5 ±1,06 ±2,12 9.25 11 ±0,70 ±1,06 10,25 9,5 ±1,76 ±0,70 Mật độ tế bào ban đầu cho vào nuôi cấy yếu tố quan trọng ảnh hướng đến thời gian nuôi cấy tạo màng nguyên bào sợi Mật độ tế bào SVTH: Nguyền Thành Cơng 38 GVHD: T.s Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội cao đồng nghĩa với số lượng tế bào lớn Chính vậy, mật độ tế bào cho vào cao thỉ thời gian tạo màng nguyên bào sợi rút ngắn Trong nghiên cứu này, có the de dàng thấy mật độ tế bào ban đầu nuôi cấy 1,7 xio6 cho thời gian tăng sinh che phú hoàn tồn bề mặt ni cấy nhanh ngày với số lượng tế bào 11,25 xio6 Mật độ tế bào ban đầu 1,7 xio4 tăng sinh chậm số lượng tế bào ít, phải 10 ngày có thề che phú gần tồn bề mặt nuôi cấy với số lượng tế bào đếm thời điểm cao 10,25 xio6 tế bào Số lượng tế bào cao đếm 12 xio6 giếng có mật độ tế bào ban đầu 1,7x1 o5 tế bào thời điểm ngày sau nuôi cấy Việc số lượng tế bào cao khơng phái giếng có mật độ tế bào ban đầu cao 1,7 xio6 có the giải thích sau: - Mật độ tế bào 106 nên số lượng tế bào nhiều, sau cấy chuyển từ đìa petri ni cấy sang màng PHB-V tế bào gần che phú kín bề mặt ni cấy Sau ngày, số lượng tế bào màng PHB-V tăng lên nhanh che phủ hoàn toàn bề mặt nuôi cấy mà tế bào tiếp tục phát triến, sinh sôi khiến tế bào mọc chồng chéo lên thành mãng nguyên bào sợi không bám dính nên bật lên khỏi bề mặt ni cấy Khi hút bỏ dịch nuôi cấy đe xứ lý tế bào đem đếm, máng nguyên bào sợi khơng bám dính bị hút theo nên số lượng lớn tế bào bị làm cho kết q đếm tế bào khơng xác hồn tồn Điều giãi thích cho việc sau số lượng tế bào đạt kết quà cao (2 ngày mật độ 106 ngày mật độ 105) ngày sau số lượng tế bào lại giám đi, không phái tế bào bị chết hay bị nhiễm vi khuẩn, vi-rút mà nguyên nhân bề mặt ni cấy khơng cịn để tế bào tiếp tục bám xuống phát triển Còn mật độ 105, số lượng te bào lại khiến cho việc tăng sinh chậm, phải mat 10 ngày để phát triển kín bề mặt ni cay Việc tế bào tăng sinh chậm gây hao phí môi trường nuôi cấy, đồng thời tế bào ban đầu nuôi SVTH: Nguyền Thành Công 39 GVHD: T.s Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội cấy dài ngày có the bị thối hóa biến đổi tính chất, hình thái, khơng đáp ứng mục tiêu cúa nghiên cứu Do đó, thí nghiệm chúng tơi chọn mật độ tế bào ban đầu ni cấy 105 thí nghiệm thời gian ngày tế bào phát triển kín hồn tồn bề mặt ni cấy mà khơng có dấu hiệu bị bật lên màng mật độ 106 3.2.2.4 Tạo màng tế bào nguyên bào sợi màng PHB-V Sau kháo sát điều kiện tối ưu tiến hành nuôi cấy tạo màng tế bào Ket thu ngun bào sợi có bám dính tốt tăng sinh mạnh, sau ngày đạt mật độ 80% diện tích bề mặt màng PHBV Sau cố định nhuộm màng với Giemsa cho thấy PHB-V có lóp tế bào bắt mầu với thuốc nhuộm Ket hình 3.4 Hình 3.4 Hình ánh màng PHB-V với ỉớp màng nguyên bào sợi nhuộm Giemsa quan sát vật kính 10X-20X-40X SVTH: Nguyền Thành Cơng 40 GVHD: T.s Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội Hình ảnh quan sát lớp màng màu xanh sau nhuộm Giemsa Quan sát qua vật kính cho thấy tế bào phát triển dày, kín bề mặt ni cấy liên kết với tạo thành lóp màng nguyên bào sợi Ta có the dễ dàng quan sát bàng mắt thường lóp màng nguyên bào sợi bắt màu xanh thuốc nhuộm Như nuôi cấy màng nguyên bào sợi ưên màng polymer sinh học PHB-V SVTH: Nguyền Thành Công 41 GVHD: T.s Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội KÉT LUẬN Đã nuôi cấy tăng sinh tế bào nguyên bào sợi: - Nuôi cấy nguyên bào sợi môi trường FBM nhiệt độ 37°c, 5% CƠ2 - Sau 24 ni cấy, tế bào có bám dính vào bề mặt đĩa ni cấy, tế bào có dạng hình thoi Sau ngày ni cấy, đạt mật độ khoảng 80% diện tích bề mặt đĩa ni cấy - Ket q có ý nghĩa đạt yêu cầu việc tạo nguồn tế bào làm nguyên liệu để cung cấp cho việc tạo màng tế bào nguyên bào sợi màng PHB-V Đã nuôi cấy tạo dược màng nguyên bào sợi màng polymer sình họcPHB-V: - Đã tạo màng PHB-V, quan sát màng có mầu trắng đục, có độ dai, mềm màng PHB-V sử dụng làm giá đỡ nuôi cấy tế bào - Đã tạo màng nguyên bào sợi màng PHB V: nồng độ tạo màng PHB-V 0,75%, tích đố màng ml, mật độ tế bào sứ dụng cho nuôi cấy tạo màng 3,4 xio5, thời gian nuôi cấy ngày SVTH: Nguyền Thành Công 42 GVHD: T.s Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội KIẾN NGHỊ Ket quà bước đầu kháo sát điều kiện nuôi cấy tạo màng nguyên bào sợi màng polymer sinh học PHB-V Tuy nhiên khuôn khố thời gian có hạn Chính nghiên cứu cần phải đánh giá khả kích úng đánh giá hiệu cùa màng tế bào mơ hình động vật SVTH: Nguyền Thành Công 43 GVHD: T.s Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước: Chu Anh Tuấn (2012) Nghiên cứu tác dụng cùa dịch chiết ngoại bào nguyên hào sợi nuôi cấy từ da người điều trị vết thương mạn tỉnh Báo Y học Thực hành Đinh Văn Hân (2015) Trung hì da lọn điều trị vet thương, vết bóng Đinh Văn Hân (2015) Những điều cần biết vết thương mạn tinh Margie Peden (2008) Báo cáo Thế giới thương tích trẻ em Tơ chức Y tế Thế giới Nhan Ngọc Hiền (2005) Qui trình nuôi cấy nguyên hào sợi người phù hợp diều kiện Việt Nam Nguyễn Viết Lưọng (2010) Tình hình bỏng Việt Nam năm 2008-2009 Tạp chí Y học thực hành Lê Năm, Nguyễn Gia Tiến (2011) Phát triển kỹ thuật công nghệ ứng dụng điểu trị thảm họa hỏng, Bảo Khoa học - Công nghệ Tài liệu nước ngoài: Attia-Vigneau Joan, Legendre Florence, Nguyen Q.T (2008) Evaluation of Adhesion, Proliferation, and Functional Differentiation of Derma! Fibroblasts on Glycosaminoglycan-Coated Polysulfone Membranes Tissue Engineering Part A 14( 10): 1687-97 Baum Jennifer, Duffy Heather s (2011) Fibroblasts and Myofibroblasts: What are we talking about? J Cardiovasc Parmacol, 2011, 57(4), 376-379 10 Brunel Gomes Daiane, Pachekoski Mauricio Wagner, Dalmolin Carla, Agnelli Augusto Marcondes José (2014) Natural additives for poly (hydroxybutyrate - co - hydroxyvalerate) - PHBV: effect on SVTH: Nguyền Thành Công 44 GVHD: T.s ĐỒ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội mechanical properties and biodegradation Mat Res Vol 17 no.5 São Carlos 2014 11 Cammas s, Bear MM, Moine L, Escalup R, Ponchel G, Kataoka K, Guerin p (1999) Polymers of malic acid and 3-alkylmalic acid as synthetic PHAs in the design of biocompatible hydrolyzable devices International Journal of Biological Macromolecules;25:273-282 12 Chaw Su Thwin (2004) Fabrication, characterzation and degradation of PHB and PHB V microsphere for liver cell growth, a thesis submitted for the degree of master of engineering National university of Singapore 13 Guan, Qi (2013) Fabrication and Characterization of PLA, PHBV and Chitin Nanowhisker Blends, Composites and Foams for High Strength Structural Applications Master of Applied Science Mechanical Engineering University of Toronto 14 Hankermeyer, Tjeerdema (1999) Polyhydroxybutyrate: plastic made and degraded by microorganisms Rev Environ Contam Toxicol, 1999, 159, 1-24 15 Kalluri Raghu, Zeisberg Michael (2006) Fibroblasts in cancer Nature rcvicw|canccr 2006, volume 6, 392-401 16 Karlsson Lisa (2009) Differentiation of Human Dermal Fibroblasts a New Tool in Vascular Tissue Engineering Linkoping Studies in Health Sciences Thesis No 99 17 Khan April, Solan Matthew' (2016) Burns: Types, Treatments and More Medically Reviewed by George Krucik, MD, MBA on August 13, 2014 18 Khosravi Darani Poly(hydroxyalkanoate) Bucci K, In Food D z (2015) Packaging: Application Improvements of by Nanotechnology Chern Biochem Eng 29(2): 275-285 19 King Samuel p Burns Statistics Website: Burn Injury 2015 SVTH: Nguyền Thành Cơng 45 GVHD: T.s Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội 20 McAnulty Robin J (2006) Fibroblasts and myofibroblasts: Their source, function and role in disease The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, Volume 39, Issue 4, 2007, Pages 666-671 21 Leonard Hayflick, Moorhead (1961) The serial cultivation of human diploid cell strains Experimental Cell Research 25: 585-621 22 Ornitz David M, Nobuyuki Itoh (2001) Fibroblast growth factors Genome Biology 2001 Vol No 23 Papini R (2004) Management of burn injuries of various depths BMJ 329, pp 158-160 24 Peter Franks J (2008) The burden of chronic wounds in the UK Nursing times, January 2008 25 Potter M, Steinbuchel A (2006) Biogenesis and structure of polyhydroxyalkanoate granules In: J M Shively editor Inclusions in Prokaryotes Berlin: Springer-Verlag: p 110-129 26 Shrivastav Anupama, Kim Hae-Yeong, Kim Young-Rok (2013) Advances in the Applications of Polyhydroxyalkanoate Nanoparticles for Bovel Drug Delivery System Biomed Research International 2013 27 Sinhal Kounteya (2012) 10 lakh Indians suffer from burns every year The times of india, Jun 7, 2012 28 Thwin Su Chaw' (2004) Fabrication, Characterization and Degradation of PHB and PHBV Microspheres For Liver Cell Growth A thesis submitted for the degree of master of engineering department of chemical and biomolccular engineering National University of Singapore 2004 29 Tong H w., Wang M., Lu w w (2011) In Vitro Biological Evaluation of Fibrous PHBV Polymer and CHA/PHBV Nanocomposite Scaffolds Developed for Tissue Engineering Applications Bioceramics Development and Applications, Vol (2011) SVTH: Nguyền Thành Công 46 GVHD: T.s Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội 30 Tracy E Lauren, Minasian A Raquel, Caterson E.J (2016) Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound Adv Wound Care (New Rochelle) 2016 Mar 1; 5(3); 119-136 31 Wang Min, Sultana Naznin (2011) PHBV Tissue Engineering Scaffolds Fabricated via Emulsion Freezing / Freeze-drying: Effects of Processing Parameters International Conference on Biomedical Engineering and Technology 1PCBEE vol.l (2011) SVTH: Nguyền Thành Công 47 GVHD: T.s Đồ Minh Trung ... nuôi cấy tạo màng nguyên hào sợi màng polymer sinh học PHB- V" v? ??i mục tiêu sau: Mục tiêu nghiên cứu: Nuôi cấy tăng sinh nguyên bào sọi Tạo màng nguyên hào sợi màng polymer sinh học PUB- V SVTH:... nguồn tế bào làm nguyên liệu để cung cấp cho việc tạo màng tế bào nguyên bào sợi màng PHB- V Đã nuôi cấy tạo dược màng nguyên bào sợi màng polymer sình họcPHB -V: - Đã tạo màng PHB- V, quan sát màng. .. sứ dụng nguồn tế bào để sử dụng việc nuôi cấy tạo màng tế bào màng PHB- V 3.2 Kết tạo màng PHB- V khảo sát điều kiện tạo màng tế bào nguyên bào sợi màng PHB V 3.2.1 Tạo màng PHB V Sau thực bước