Giáo trình di truyền và chọn giống thủy sản

Ịrs PHẠM THANH LIÊM G THÚY YÊN - E H DI TRUYEN VA CHỌN GIỐNG THUYSẢN W NHÀ XUẤT BÁN NÔNG NGHIỆP TS PHẠM THANH LIÊM, TS DƯƠNG THỦY YÊN VÀ TS BÙI MINH TÂM Giáo trình DI TRUỲÊN VÀ CHỌN GIỐNG THỦY SẢN ■ NHÀ XUẤT BẢN NÔNG NGHIỆP MỤC LỤC Trang Lời giới th iệ u vii CHƯƠNG CÁC KHÁI NIỆM c BẢN VỀ DI TRUYỀN HỌC 1 Gen nhiễm sắc th ể 1.1 Gen 1.2 Nhiễm sắc thể 1.2.1 Sổ lượng cùa N S T 1.22 Hình thái phân loại NST Pi truyền M endel .4 Gián ph ân Oiảm phân Sự xác định giới tín h 11 5.1 Cơ chế xác định giới tính c 11 5.2 Cơ chế xác định giới tính giáp xác .13 CHJ'ONG II DI TRUYỀN CÁC TÍNH TRẠNG CHẤT LƯỢNG 15 Oen nằm nhiễm sắc thể th n g 15 1.1 Gen thể tính trội hồn tồn 15 1.2 Trội khơng hồn to àn 17 1.3.Cộng gộp (additive action) 19 r i truyền tính trạng 20 Fai nhiều gen NST thường 21 3.1 Khơng có tương tác át c h ế 21 3.1.1 Tương tác bồ trợ 21 3.12 Cộng hợp 22 3.2.Tương tác át chế 23 3.2.1 Tương tác át chế trộ i 24 3.22 Tương tác át chế lặn 26 3.23 Ảnh hưởng tích lũy hai g e n 27 3.24 Tương tác gen trộ i 28 3.25 Tương tác gen lặn 28 3.25 Tương tác trội lặn 29 ri truyền liên kết với giới tính 30 l Gen liên kết với NST giới tính Y (Y-linked g en ) 30 4.2.Gen liên kết với NST X 31 4.3.Kiểu hình giới hạn bời giới tính .33 (en đa alen 33 Niiều tính trạng (Pleiotropy) 34 Nức ngoại (penetrance) độ biểu (expressivity) 36 liên kết gen 37 111 CHƯƠNG III DI TRUYỀN HỌC QỤẦN T H Ê 39 Những khái niệm di truyền quần th ể 39 1.1 Quần thể di truyền quần th ể 39 1.2 Tần số alen, tần số kiểu gen ti lệ đồng hợp/dị hợp quần th ể 39 1.3 Định luật H a rd y - W einberg 40 Phương pháp xác định tần số alen tần số kiểu gen 41 2.1 Gen NST thường 41 2.1.1 Trội khơng hồn tồn cộng gộp 41 2.1.2 Trội hoàn to àn 44 2.1.3 Hai nhiều gen qui định tính trạng riêng b iệ t 45 2.1.4 Gen át chế 47 2.2 Gen liên kết với giới tín h 48 2.2.1 Gen liên kết với NST Y 48 2.2.2 Gen liên kết với X 49 2.3 Xác định tần số alen tần số kiểu gen dựa marker di truy ền .52 Sự thay đổi tần số alen quần th ể 54 3.1 Đột biến (mutation) 54 3.2 Di nhập gen (migration) 54 3.3 Lạc dòng di truyền (genetic drift) .55 3.4 Chọn lọc tự nhiên 56 CHƯƠNG IV DI TRUYỀN CÁC TÍNH TRẠNG SỐ LƯỢNG .59 Đặc trưng tính trạng số lượng .59 Sự biến động tính trạng số lượng 60 Biến động di truyền cộng gộp chọn lọ c 62 3.1 Hệ số di truyền (heritability) .63 3.2 Chọn lọc 69 3.2.1 Không chọn lọc (no selection) 70 3.2.2 Chọn lọc trực tiếp 71 3.2.3 Chỉ số chọn lọc (selection index) 72 Biến động di truyền tính trội V d 74 Biến động môi trường VE 74 5.1 Tăng trưởng đột ngột (shooting) 75 5.2 Ảnh hưởng phóng đại (magnification effects) .75 5.3 Ảnh hưởng thời gian sinh sản kéo d i .76 5.4 Ảnh hường mẹ (maternal effects) .76 5.4.1 Tuổi kích thước m ẹ 77 5.4.2 Kích thước trứng 77 5.5 Chăm sóc đa chiều (Multiple nursing) 78 5.6 Thả nuôi quần thể (communal stocking) .78 Biến động tương tác kiểu ẹen môi trư ng 79 CHƯƠNG V CÁC PHƯƠNG PHÁP CAI THIỆN DI TRỰYỀN C Á .82 Thuần hóa di nhập giống (domestication & introduction) .82 1.1 Thuần hóa 82 1.1.1 Khái niệm 82 1.1.2 Kết hóa 83 1.1.3 Ý nghĩa CỊ trình h ó a 84 1.1.4 Những vấn đề cần lưu ý trước hóa: 86 1.1.5 Các bước tiến trình hóa 87 1.1.6 Các phương thức áp dụng trình h ó a 87 1.1.7 Những trở ngại q trinh thn hóa đơi tượng thủy s ả n 88 1.2 Di nhập g iố n g 89 1.2.1 Một số khái n iệ m 89 1.2.2 Mục đích di nhập giống 90 1.2.3 Tác động cá nhập nội .90 1.2.4 Hiện trạng lồi cá tơm nhập nội Việt N am 92 Đánh giá dòng (strain evaluation) 95 Chọn lọc (Selection) .97 3.1 Các phương pháp chọn lọc 97 3.1.1 Chọn lọc cá thể (Mass selection) 97 3.1.2 Chọn lọc quần thể (Family selection) 97 3.2 Một số kết đạt phương pháp chọn lọ c 100 3.3 Tác dụng kéo theo (correlated responses) chọn lọc gián tiếp (indirect selection) .101 Các phương pháp la i 102 4.1 Giao phối cận huyết (inbreeding) 102 4.1.1 Mục đích cùa giao phối cận h u y ế t 102 4.1.2 Những ảnh hưởng tiêu cực giao phôi cận h u y ê t .103 4.2 Lai chéo loài (intraspecific crossbreeding) .103 4.3 Lai xa khác loài (interspecific hybridization) 104 Sinh sản đơn tính nhân tạo đa bội th ể 110 5.1 Sinh sản đơn tính nhân tạo (Gynogenesis) hay mẫu sinh nhân tạo 110 5.2 Sinh sản đơn tính đực nhân tạo hay phụ sinh nhân tạo (A ndrogenesis) 113 5.3 Đa bội thể (Polyploidy) 114 Chuyển giới tính cá (Sex-reversal) 116 6.1 Phương pháp dùng hormon chuyển giới tín h 116 6.1.2.Cơ sở khoa học 116 V 6.1.2 Phương pháp thực h iệ n 117 6.2 Chuyển đổi giới tính bàng phương pháp lai xa khác lo i 118 6.2.1 Cơ sở khoa học 118 6.2.2 Một số công thức lai cho tỉ lệ cá đực cao cá rô phi .118 6.2.3 Ưu nhược điểm phương pháp lai x a 119 6.2.4 Nghiên cứu ứng dụng phương pháp lai xa thay đổi giới tính cá Việt N am 119 6.3 Sản xuất cá siêu đực phương pháp kết hợp sử dụng hormone lai tạ o 120 6.3.1 Cơ sở khoa học 120 6.3.2 Phương pháp sản xuất cá rô phi siêu đ ự c 120 6.3.3 Ưu nhược điểm cùa phương pháp sản xuất cá siêu đực 122 CHƯƠNG VI CONG NGHỆ DI TRUYEN TRONG THỦY SẢN 126 Phản ứng chuỗi (Polymerase chain reaction, P C R ) 126 1.1 Nguyên tắc chung P C R .126 1.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng P C R 128 1.3 Nồng độ chất phản ứng PCR 128 1.3.1 Nồng độ enzyme Taq polym erase 128 1.3.2 Nồng độ Deoxynucleoside triphosphate (dNTP) 129 1.3.3 Nồng độ ion Mg2+ 129 1.3.4 Nồng độ DNA khuôn mẫu .130 1.3.5 Nồng độ m i 130 1.3.6 Dung dịch đệm (b u ffer) 130 1.3.7 Chất ổn định hoạt tính enzyme 131 Một số kỹ thuật sinh học phân từ ứng dụng thủy sản .131 2.1 ứ n g dụng kỹ thuật A llozym e 132 2.2 Kỹ thuật phân tích đa hình khuếch đại ngẫu nhiên RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 132 2.3 Kỹ thuật phân tích đa hình chiều dài đoạn phân căt giới hạn RFLP (Retrict Fragment Length Polym orphism ) 133 2.4 Kỹ thuật phân tích đa hình độ dài đoạn khuếch đại - AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 134 2.5 Kỹ thuật phân tích trình tự g e n 135 2.6 Kỹ thuật phân tích m icrosatellite 137 vi LỜI GIỚI THIỆU t 'X i truyền học khoa học nghiên cứu tính di Ê ầ truyền biến dị cùa sinh vật, tìm hiểu qui luật Ể s tương đồng khác cá thể có quan hệ họ hàng Trài qua kỷ hình thành phát triển, khoa học di truyền đạt nhiều thành tựu tiến vượt bậc Các nhà khoa học dựa vào lý luận di truyền bàn qui luật dí truyền đặc hữu đoi tượng, đế xây dựng chương trình chọn giống tạo giống vật ni phục vụ cho mục đích mong muốn người Mãi trước năm 1970, có cơng trình nghiên cứu ve di truyền cá, vài thập niên gần đây, lĩnh vực phát triển mạnh Nhiều tính trạng cùa lồi cá ni cài thiện tốc độ sinh trưởng, hệ so chuyển hóa thức ăn, khả kháng bệnh, khả thích ứng với điều kiện mơi trường nước xấu, hình dạng thể, ti lệ chất lượng thịt Các chương trình chọn giong ứng dụng thủy sàn bao gom hóa - di nhập giống, chọn lọc, kỹ thuật lai tạo, điều khiển giới tính, đa bội thể kỹ thuật di truyền nham nâng cao chắt lượng lồi thủy sản ni Trong thực tế, nghiên cứu di truyền lồi cá ni quan tâm hom khía cạnh dinh dưỡng, quản lý sức khỏe chất lượng nước Nhiều người nuôi cá cho rằng, di truyền chi lĩnh vục d n h ch u cá c nhà kh o a học, nh n g hụ lạ i q u a n tâ m n h icu đôn suy giảm chất lượng giong vấn để có liên quan đến di truyền Vì vậy, giáo trình biên soạn với mục đích giúp cho sinh viên thủy sản, nhà quàn lý trại giong tương lai, (i) nhận thức di truyền sớ khoa học việc chọn giống, việc làm thường xuyên cùa người quàn lý trại giống; (ii) thay rõ di truyền lĩnh vực khó hiểu chi dành riêng cho nhà di truyền học; (iii) hiểu rõ chất lượng giống thủy sàn phụ thuộc nhiều vào chương trình sinh sản làm quản lý chât lượng cá ni Với mục đích trên, khái niệm di truyền cô điên, di truyền quần thể, di truyền số lượng đến di truyền phân tử trình bày ngắn gọn, đọng; song song minh họa, thi dụ trích dẫn trực tiếp từ két nghiên cứu, phát cá động vật thủy sàn khác Giáo trình khơng chi tài liệu học tập dành riêng cho sinh viên đại học ngành Nuôi trồng thủy sản Bệnh học thủy sản mà cỏn tài liệu tham khảo cần thiết cho sinh viên học viên Cao học ngành học khác có liên quan đến nuôi quản lý nguồn lợi thủy sản Ngoài ra, tài liệu tham khảo cho nhà nghiên cứu, nhà quàn lý giống nguồn lợi thủy sản Giảo trình biên soạn lần đầu khơng tránh khỏi thiếu sót, tác giả mong nhận góp ý cùa sinh viên độc giả để giáo trình cải tiến, hồn thiện hom NHĨM BIÊN SOẠN nay, kỹ thuật RAPD, AFLP microsatellite ứng dụng cho mục đích này, kỹ thuật AFLP cho hiệu cao Việc định danh xác lồi, dịng hay lai khía cạnh quan trọng việc lựa chọn cá bố mẹ RFLP, RAPD, AFLP microsatellite công cụ đắc lực cho việc định danh phân loại Các tính trạng tăng trưởng sinh sản tính trạng số lượng điều khiển nhiều gen Xác định gen qui định tính trạng số lượng (QTL) quan trọng cần thiết cho nhà chọn giống Chi thị phân tử sử dụng để xác định QTL, việc chọn lựa bố mẹ sau sê tiến hành bàng phương pháp chọn lọc nhờ hỗ trợ chi thị phân tử (MAS marker assisted selection ) (Liu Cordes, 2004) Các nghiên cứu sau cho thấy ứng dụng cùa kỹ thuật phân tò đinh loại, nghiên cứu quần thể phả hệ 2.1 ửng dụng kỹ thuật Allozyme Kỹ thuật dựa đa hình (khác cấu trúc kích thước phân tử) nhóm enzyme có chức (gọi isozyme) mã hóa bời hay nhiều alen locus Kỹ thuật allozyme dùng nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể, phân tích mức độ cận huyết, xâm nhập gen sử dụng lập đồn gen (Liu & Cordes 2004) Ở Việt Nam, kỹ thuật dùng để quan sát đa dạng di truyền dòng cá chép Trung quốc, Bắc Việt Nam, Hungary chép vàng Indonesia ừong đánh giá dòng để chọn giống cá trắm cỏ Trong dòng cá trăm cỏ Viện Nghiên cứu Thủy sản I (Viện I), Nghệ An, Sơn La Trung Quốc quần đàn Sơn La có tỉ lệ phần trăm locus đa hình cao nhất, (chứng tỏ có đa dạng cao nhất) quần đàn Nghệ An Trung Ọuốc khơng có locus đa hình (Phạm Anh Tuấn, 2005) Allozyme dùng để nghiên cứu việc xâm nhập gen lồi Ví dụ, nghiên cứu Thái Lan cá trê vàng dựa chì thị cho thấy 12 tổng số 25 quần thể cá trê vàng (Clarias macrocephalus) tự nhiên có mang alen đặc trưng cá trê phi, chứng tỏ có xâm nhập gen trê phi (C gariepinus) vào cá trê vàng địa (Na-Nakom et a i, 2004) 2.2 K ỹ thuật phân tích đa hình khuếch đại ngẫu nhiên RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Nguyên lý RAPD đa hình đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên mồi đơn phổ biến, khơng mang tính đặc hiệu cho lồi Các mồi đom thường ngăn, có 10 bp nhiệt độ gắn 132 mồi thấp (36 - 40°C) Do đó, nhiều đoạn DNA khuếch đại dễ dàng (Ví dụ, hình 6.2, nhiều băng vạch thể sản phẩm DNA khuếch đại số loài cá lóc sử dụng đoạn mồi OPA3) Tuy nhiên, kết cùa RAPD thường không ổn định mà phụ thuộc nhiều yếu tố thành phần phản ứng PCR, đặc biệt thành phần Mg2' chất lượng DNA khn mẫu Mặc dù có số hạn chế, kỹ thuật RAPD lại đơn giản, tốn chi phí tính đa hình tương đối cao Vì vậy, kỹ thuật sử dụng phố biến, đặc biệt vào năm 1990 Ở Việt Nam, thị RADP dùng để phân tích tính đa hình quần đàn cá tra (3 quần đàn trại giống I quần đàn cá tự nhiên) Ket phân tích dựa 31 đoạn mồi cho thấy quần đàn có tính đa dạng di truyền cao đặc biệt quần đàn tự nhiên Đối với tơm sú thí nghiệm dùng cặp mồi để tính khoảng cách di truyền quần đàn Kết quà minh chứng có tương đồng cao quần đàn tôm sú miền Nam miền Trung Ở nghiên cứu khác cá tram cị cá trơi Ẩn Mirgal, kết phân tích chi thị isozyme RAPD cho thấy mức độ dị hợp trại cá giống thấp (ví dụ mức độ dị hợp dựa RAPD dao động khoảng 0,173 - 0,208) Nhóm nghiên cứu cho ràng đa dạng di truyền thấp lý giải thích chất lượng cá giống giảm (trích Phạm Anh Tuấn, 2005) M M lOOObp — r i — tlr iT Z L _ M 16 17 18 19 ; - ” ” 10 11 12 13 fe d 14 15 ì ;—5 «— — ' 21*22 23 24 2b 26 27 28 29 30 M lOOObp Hình 6.2: Đa dạng cùa lồi cá lóc sử dụng prim er OPA3 Giếng M: DNA ladder lOObp, 1-5: Channa striata, 6-10: c marulioides, 11-15: c lucius, 16-20: c gachua, 21-25: c micropeites, 26-30: c melasoma 2.3 Kỹ thuật phân tích đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn - RFLP (Retrict Fragment Length Polymorphism) Tính đa hỉnh chiều dài phân đoạn DNA cắt giới hạn RFLP khác kích thước phân đoạn tạo cắt 133 DNA enzyme cắt giới hạn (ký hiệu RE, restriction enzyme), có thay đổi trình tự DNA mẫu vị trí nhận biết enzyme Các bước thực sau: đầu tiên, RE cắt DNA tổng số (DNA gen) cách ủ DNA tổng sổ với enzyme nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính enzyme Sản phẩm DNA sau bị cắt enzyme kiểm tra qua điện di gel agarose Tiếp theo, gel chứa DNA chuyển qua màng lai theo phương pháp Suthem blot Sự khác biệt trình tự vị trí cắt enzyme hai cá thể tạo phân đoạn cắt khác v ề sau, qui trình RFLP ban đầu cải tiến Người ta dùng kỹ thuật PCR thay cho kỹ thuật Southern blot, biết trinh tự đoạn DNA (ílankinẹ) nối với locus nghiên cứu, đoạn mồi thiết kế để khuếch đại vùng RFLP ứ n g dụng chủ yếu phương pháp RFLP phân tích đa dạng di truyền quần đàn Ví dụ, nghiên cứu cá tra, Quyền Đình Thi ctv (2005) dùng thị RAPD RFLP (đối với gen ti thể) để đánh giá đa dạng di truyền quần đàn cá trại giống so với cá tự nhiên Nhóm tác giả tìm số chi thị đặc trưng cho quần đàn khoảng cách di truyền đàn cá tương đối cao (0,22 - 0,39) Gần đây, kỹ thuật PCR-RFLP dùng phân loại loài hay phân biệt lai hai lồi Ví dụ, Mohindra et al (2007) dùng enzyme cắt giới hạn gen ND5/6 DNA ti thể (gọi phương pháp mtDNA-RLFP) loài cá trên: c batrachus, c macrocephalus c gariepinus Ở loài, enzyme cắt gen ND5/6 vị trí khác nhau, tạo nên kiểu gen riêng biệt cho lồi Nhờ vậy, phân biệt loài dễ dàng dựa vào xuất băng vạch (kết điện di sản phấm PCR-RFLP) đặc trưng cho loài (Mohindra et al., 2007) Trong phân biệt hai lai (lai “ngược” lai “xuôi”) với hai loài cá trê bố mẹ c macrocephaỉus c gariepinus, người ta thực PCR-RFLP gen ti the (mtDNA) gen ừong nhân (nCDNA) Phương pháp nàỵ phân biệt hai lai với lai có kết RFLP gen ti thể giống với loài mẹ, RFLP gen ừong nhân, lai có băng vạch trung gian hai loài bố mẹ (Hashimoto et al., 2010) 2.4 K ỹ thuật phân tích đa hình độ dài đoạn khuếch đại - AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Kỹ thuật AFLP kỹ thuật kết hợp RFLP PCR Nguyên tắc thực sau: Bộ gene cắt với RE, tiếp theo, gắn 134 đoạn DNA bị cắt với đầu nối (adaptor) enzyme ligase Đoạn adaptor gồm phần: phần trình tự lõi phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme Mồi cùa phản ứng PCR thiết kế dựa trình tự adaptor chứa trinh tự chọn lọc khoảng vài nucleotide Những phân đoạn DNA chứa trình tự adaptor trình tự nucleotide chọn lọc khuếch đại, trình tự chọn lọc làm giảm xuất sản phẩm PCR làm đơn giản q trình phân tích Kỹ thuật AFLP ứng dụng nghiên cứu đa dạng di truyền, xâm nhập gen, phân loại loài, lập đồ gen, Ví dụ, Thái Lan, nghiên cứu dùng phương pháp AFLP đê lập đô gen cá trê vàng (Poompuang & Na-Nakom 2004) Họ dùng 47 tồ hợp đoạn mồi, tạo nên 79 kiểu gen đom bội, từ xây dụng đuợc đồ 134 gen, có 31 tổ hợp gen liên kết Những kết tiếp tục ứng dụng để tìm tính trạng số lượng liên kết, giúp cho việc chọn giống cá trê nhanh chóng hiệu cao hom so với phương pháp chọn lọc truyền thống 2.5 K ỹ thuật phân tích trình tự gen Kỹ thuật phân tích trình tự gen thực gen ti thể (mtDNA) phổ biến gen nhân Do nghiên cứu lâu nhiều đối tượng nên có nhiều loại đoạn mồi phổ biến thiết kế cho mtDNA, chúng dùng cho nhiều loài với hệ thống phân loại khác Phân tích trình tự gen mtDNA (xem sồ gen mtDNA hình 6.3) thường áp dụng phân loại, tìm hiểu mối quan hệ di truyền lồi (cây phân loại) Các gen thường sử dụng Cytochrome b, Cytochrome c subunit (ký hiệu COI C O X ), N A D II dehydrogenase subunit (N D ), Ví dụ, nghiên cứu trơn lồi cá lóc Malaysia (Abol-Munafi et aỉ., 2007), gen Cytochrome b khuếch đại nhờ cặp mồi phổ biến L I4841 and reverse H 15149 (Kocher et a i, 1989) có trình tự sau: L I4841 - ’: AAAAAGCTTCCATCCAACATCTCAGCATGATCAAA H I5149 - ’: AAACTGCACCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA 135 COX2 Lyằ ôy ND3 ATPasđ8 00X3 ATPase6 Hỡnh 6.3: Cỏc gen ty thể thường dùng đề phản loại cá • M 10 11 12 M 1;M 15 16 17 18 19 21 22 23 24 M * •* » ã ; f Hình 6.4: Vệt băng lồi lóc sử dụng gen Cytochrome b Giếng M: GeneRuler lOObp DNA ladder, 1-4: Channa striata, 5-8: c marulioides, 9-12: c lucius, 13-16: c gachua, 17-20: c micropeltes, 21-24: c melasoma Sau khuếch đại, sàn phẩm PCR thu có chiều dài ~ 400 bp (Hình 6.4) Đây chi phần gen Cytochrome b Sau đó, sản phẩm PCR giải trình tự Ket giải trình tự đoạn gen Cytochrome b thể hình 6.5 Trinh tự gen mẫu/lồi nghiên cứu so sánh, phân tích nhờ vào chương trình phân tích trình tự gen MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013) Hình 6.5: Trình tự phần gen Cytochrome b cùa cá lóc 2.6 Kỹ thuật phân tích microsatellite Microsatellite đoạn DNA có trình tự số (thường từ - ) base lặp lặp lại nhiều lần số lần lặp lại từ vài đến hàng trăm lần Chỉ thị có mức độ đa dạng cao phân bố khắp nơi gen tất sinh vật Vì chúng dùng phổ biến nhiều nghiên cứu, đặc biệt nghiên cứu đa dạng di truyền Có nhicu phương pháp phân lập m icrosatcllitc phương pháp khuếch đại trực tiếp cùa đa hình (DALP: Direct amplification of length polymorphism), phương pháp microsatellite kết hợp ngẫu nhiên (RAHM: random hybridizing microsatellites) phương pháp microsatellite khuếch đại ngẫu nhiên (RAM: randomly amplified microsatellites) Sơ đồ theo phuơng pháp RAM thể hình 6.6 137 Hình 6.6: Microsatellite khuếch đại ngẫu nhiên dùng kỹ thuật phân lập R A M Ghi chú: (a) Đọan khuếch đại dùng cặp mồi móc, (b) Chuyển nạp gen mơi trường agar, (c) Chạy trình tự plasm id Các bước phân tích RAM (Hình 6.7 -6 ) sau: - Gen DNA PCR với cặp mồi móc - Chèn véctor vào sản phẩm PCR - Cấy khuẩn lạc - Ly trích plasmid (DNA có cấu trúc vịng) - Chạy trình tự - Thiết kế trình tự cặp mồi - Phân tích microsatellites / Hình 6.7: Ni cấy khẩn lạc cùa PCTB clones với microsatellite ('CAT)ó■ (Ghi chú: Điếm xanh chi cỉone dương điểm trắng chi clone âm) M " s l ó 11 H 16 1" 1S 1020:1 :ỉm 4361b- Hình 6.8: DNA vịng chạy cặp mồi PCTB Ghi chú: Giếng M: DNA kích thước chuẩn (Mix o f Ả DNA H ind III X I 74 DNA Hae III digest); giếng 1-24: DNA vịng m m - — M •/* ?p 27 u - — — ;*> * 33 ?4 y 36 37 38 > J -1 ' 44 J ; 4? 47 M Hình 6.9: DNA vịng có chèn với EcoRI Ghi chú: Giếng M: DNA kích thước chuẩn (Mix o f Ả DNA Hind III X I 74 DNA Hae III digest); giếng 1-47: DNA vòng 139 s 10 11 u m —► Ũ :: f l i c 1? 14 1.' 16 : r 23 24 M t •* I Ĩ •* f - — — //ỉ«/í Ố.70: Kệ/ báng DNA khuếch đại từ DNA vỏng Ghi chú: Giếng M: DNA kích thước chuẩn (Mix o f X DNA Hind III o X174 DNA Hae III digest); giếng 1-24: DNA vịng Ket phân tích trình tự để tìm microsatellite thê sau: 5’G TT G C G T A H H H H r a H H TGTTG ATTG ATGC ATG A GATCAAGGGAAACCTTGCTGCTCCAGTTGCTCTACTGTTTGA TAAAGAGGGTTTGTCGGCTCAGTCGATGTCACAACGCTGTA AAGTTGCTCACTTTCTTCACTGTCTGCCTTAAGAAAGAGAGT G AGTTG A A AA AC AGT AG ATT ATTG AT ACTTT AT ACGC AC AG AGAAGCCGTAGTCATCTTCCTCAGCCTTGTGGCGGACTTGA GGTCT ATG AG ACG AT GGGTTT ACT GCGG AG AG A ACAACAAC AACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACATCATCA TCATCATCATCATT C C A TG T3 ’ Ghi chú: Trình tự bơi xám trình tự anchor trình tự gạch nucleotides lặp lại, trình tự microsatellite ứ n g dụng thị microsatellite phân tích đa dạng di truyền thực rộng rãi nhiều đối tượng sinh vật, bao gồm loài động vật thủy sản giới Ở Việt Nam, số nghiên cứu điển hình như: nghiên cứu Quyền Đình Thi Phạm Anh Tuấn (2004) ước tính khoảng cách di truyền quần đàn tôm sú Kết cho thấy quần đàn tôm Nam có họ hàng gần với quần đàn tơm Trung khác với quần đàn tơm Singapore Tính đa hình quần đàn quần đàn cao, thể qua 83 kiểu gen 83 mẫu Giá trị thơng tin đa hình PIC (polymorphic information content) >0,913 khoảng cách di truyền lớn >0,469 140 Một nghiên cứu khác thực cá tra Ha et al (2009) Nhóm nghiên cứu dùng thị microsatellite để so sánh mức độ đa dạng di truyền đàn cá tra trại giống với đàn cá tự nhiên Trong nghiên cứu này, kết chưa tìm cho thấy mức độ đa dạng di truyền đàn cá nghiên cứu tương đương nhau, chưa có dấu hiệu lai cận huyết xảy đàn cá trại giống Việc ứng dụng chì thị phân tử nói chung microsatellite nói riêng nghiên cứu thủy sản điều kiện nghiên cứu nước ta Song, với đầu tư phủ vào nghiên cứu ngày tăng, ứng dụng rộng rãi kỹ thuật này, chúng mang lại kết nhanh hiệu so với phương pháp đời trước allozym, RAPD, Bên cạnh đó, cần có kết hợp kỹ thuật di truyền cũ với kỹ thuật để thúc đẩy nhanh trình thiện di truyền lồi ni có giá trị kinh tế cao Câu hỏi ôn tập 1- PCR gì? Nêu trình PCR? 2- Nêu kỹ thuật di truyền phân tử ứng dụng kỹ thuật này? Tài liệu tham khảo Abol-Munafi, A B., Ambak, M A., Ismail, p., Tam, B M., 2007 Molecular data from the cytochrome b for the phylogeny o f Channidae (Channa sp.) in Malaysia Biotechnology 6, 2 27 Bartlett, J M s and D Stirling, 2003 PCR Protocols Springer Science & Business Media Ha, H P., Nguyen T T T., Poompuang s., Na-Nakom Ư (2009) Microsatellites revealed no genetic differentiation between hatchery and contemporary wild populations of striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage 1878) in Vietnam Aquaculture, 291, 154—160 Hashimoto D T., Mendonỗa F F., Senhorini J A et al (2010) Identification o f hybrids between Neotropical fish Leporinus macrocephalus and Leporinus elongatus by PCR-RFLP and multiplex-PCR: Tools for genetic monitoring in aquaculture Aquaculture, 298, 346-349 14] Ivanova N V., Zemlak T s., Hanner R H., Hebert p D N (2007) Universal primer cocktails for fish DNA barcodirg Molecular Ecology Notes, 7, 544-548 Kocher T D., Thomas w K., Meyer A et al (1989) Dynamics o f mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers Proceedings o f the National Academy o f Sciences o f the United States o f America, 86, 6196-6200 Liu z J., Cordes JF (2004) DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics Aquaculture, ,1 37 Mohindra, V., R K Singh, M Palanichamy, A G Ponniih and K K Lai, 2007 Genetic identification o f three species of the genus Clarias using allozyme and mitochondrial DNA markers Journal o f Applied Ichthyology, 23, 104-109 Na-Nakom u , Kamonrat w , diversity o f walking catfish, Thailand and evidence o f introduced farmed C-gariepinus Ngamsiri T (2004) Genetic Clarias macrocephalus, in genetic introgression from Aquaculture, 240, 145-163 10 Phạm Anh Tuấn, 2005 ứ n g dụng sinh học phân tử nuôi trồng thủy sản Việt Nam: hịện trạng định hướng Kỷ yếu hội thảo toàn quốc nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ nuôi trồng thủy sản, 22-23/12/2004, Vũng Tàu 11 Poompuang s., Na-Nakom u (2004) A preliminary genetic map o f walking catfish (Clarias macrocephalus) Aquaculture, 232,105-203 12 Quyền Đình Thi, Đào Thị Tuyết Phạm Anh Tuấn 2005 Sử dụng chi thị RADP mtDNA-RFLP để phân tích đa hình quần đàn cá tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi Việt Nam Kỷ yếu hội thảo toàn quốc vế nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ nuôi trồng thủy sản, 22-23/12/2004, Vũng Tàu 13.Tam ura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar s (2013) MEGA6: M olecular evolutionary genetics analysis version 6.0 Molecular Biology and Evolution, 30, 2725-2729 142 GIÁO TRÌNH DI TRUYỀN VÀ CHỌN GIỐNG THỦY SẢN TS PH Ạ M T H A N H L IÊM , T S D Ư Ơ N G T H Ú Y YÊN V À TS BÙI M IN H T Â M Chịu trách nhiệm xuất bản: Giám đốc - Tổng biên tập: TS LÊ QUANG KHÔI Biên tập - Sửa in : Đặng Ngọc Phan Trình bày - bìa : Nguyễn Khánh Hà P h ạm Thị Anh Thư NHÀ XUẤT BẢN NÔNG NGHIỆP 167/6 - Phương Mai - Đống Đa - Hà Nội ĐT: (04) 38523887 - 38521940 Fax: (04) 35760748 E-mail: nxbnn@vahoo.com.vn Website: nxbnongnghiep.com.vn CHI NHÁNH NXB NÔNG NGHIỆP 58 Nguyễn Bỉnh Khiêm Q.l, TP Hồ Chí Minh ĐT: (08) 38299521 - 38297157 Fax: (08) 39101036 E-mail: cnnxbnn@yahoo.com.vn 143 In 300 bản, khổ 16 X 24 cm Nhà in Thành Công 70 Bà Huyện Thanh Quan, quận 3, TP Hồ Chí Minh XNĐKXB so 1268-2015/CXBIPH/4-77/NN ngày 20/5/2015 QĐXB số: 023/QĐ CNNXBNN ngày 25/5/2015.ISBN: 978 604-60-2035-6 In xong nộp lưu chiểu quý 11/2015 144 ... DƯƠNG THỦY YÊN VÀ TS BÙI MINH TÂM Giáo trình DI TRUỲÊN VÀ CHỌN GIỐNG THỦY SẢN ■ NHÀ XUẤT BẢN NÔNG NGHIỆP MỤC LỤC Trang Lời giới th iệ u vii CHƯƠNG CÁC KHÁI NIỆM c BẢN VỀ DI TRUYỀN... tiêu di truyền học quần thể nghiên cứu cấu trúc di truyền quần thể xác định nguyên nhân làm thay đồi cấu trúc di truyền, c ấ u trúc di truyền cùa quần thể mức độ biến đổi di truyền phân bố di truyền. .. chương trình chọn giong ứng dụng thủy sàn bao gom hóa - di nhập giống, chọn lọc, kỹ thuật lai tạo, điều khiển giới tính, đa bội thể kỹ thuật di truyền nham nâng cao chắt lượng loài thủy sản nuôi