Cơ sở khoa học và ứng dụng của hệ thống vector biểu hiện Baculovirus trong sản xuất protein tái tổ hợp Cơ sở khoa học và ứng dụng của hệ thống vector biểu hiện Baculovirus trong sản xuất protein tái t.
Cơ sở khoa học ứng dụng hệ thống vector biểu Baculovirus sản xuất protein tái tổ hợp Nội dung Cơ sở khoa học Baculovirus Ứng dụng Baculovirus sản xuất enzyme tái tổ hợp Cơ sở khoa học Baculovirus Phân loại Baculovirus: dsDNA vịng, 80 – 180 kbp mã hóa cho 100 – 180 protein Họ: Baculoviridae Chi: Alphabaculovirus Betabaculovirus Deltabaculovirus Gammabaculovirus Vật chủ Hơn 600 loài: Arthropods, lepidoptera, hymenoptera diptera Vật chủ phổ biến ấu trùng lepidopteran Có khả vào tế bào động vật có vú khơng có khả tái Cấu trúc virion Budded Virus (BV) Occlusion derived virus (ODV) Vòng đời Primary infection of ODV Cơn trùng tiêu hóa ODV Protein polyhedrin ODV tan môi trường ruột côn trùng Nucleocapsids vào tế bào biểu mô Tái nhân BV thoát để lây nhiễm tế bào mô khác Second infection of BV Các pha lây nhiễm Immediately early (0 - 6h) Delayed early (6 - 12h) Late ( 12 - 20h) Very late ( 24 - 48h) Baculovirus sử dụng cho biểu gen Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) polh promotor P10 promotor Nucleocapsids mở rộng chiều dài thích hợp cho chèn DNA ngoại lai Ưu nhược điểm HT Baculovirus An toàn người, động vật thực vật HT biến đổi sau dịch mã chưa hồn thiện ĐV có vú Kích thước hệ gene phù hợp Hoạt tính proteolysis cao Dễ ni cấy mở rộng quy mô Thay đổi cách tiết protein tế bào chủ Mức độ biểu protein cao: polh promotor Hệ thống biến đổi sau dịch mã: glycosylation Nhân giống Baculovirus tái tổ hợp P1 viral stock P2 viral stock P3 viral stock Protein expression Dịch chứa virus tái tổ hợp P1 cấy vào tế bào BmO2 để tạo nhiều virus Đến giai đoạn virus tái tổ hợp P3, virus bảo quản tối độ C sử dụng để lây nhiễm cho tế bào ấu trùng tằm nhằm mục đích thu protein tái tổ hợp Vật liệu phương pháp Lây nhiễm (Infection) M M O I: P3 viral stock (MOI: Multiplicity of Infection) O I: 1: Tiến hành lây nhiễm virus tái tổ hợp P3 với tế bào BmO2 (10 cell/well) ấu trùng tằm f38 silkworm với hệ số lây nhiễm x 10 tương ứng Sau 3,4,5 ngày, tế bào BmO2 ấu trùng f38 thu hoạch Vật liệu phương pháp Đánh giá sơ biểu protein Thu hoạch tế bào BmO2 fat bodies tằm f38 Ly tâm 1000 x g 10 phút 4°C Tách chiết protein nội bào từ pellet từ fat bodies tằm f38 đệm ly giải đồng Dịch sau ly giải ly tâm 18000 x g 30 phút 4°C • Dịch nổi: protein hịa tan • Cặn: protein khơng hịa tan Phân tích sử dụng Western Blot Protein extraction Thành phần đệm ly giải: 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 M NaCl, 1% CHAPS, Complete Protease Inhibitor Cocktail (1 tablet/50 ml, Roche)) Vật liệu phương pháp Tinh protein rMMLRT Quy trình tinh hai bước thực dựa đuôi His Strep tags Tách chiết protein nội bào Đưa dịch ly giải lên cột đồng đệm ly giải HisTrap excel column Thu phân đoạn phân tích điện di SDS PAGE Rửa giải dung dịch đệm Strep Buffer + desthiobiotin Rửa giải dung dịch đệm imidazole (nồng độ 100 – 500mM) Đưa lên cột StrepTrap HP Column Cô đặc phân đoạn thu Đổi đệm thành Strep Buffer Vật liệu phương pháp Các mẫu protein điện di gel SDS-PAGE 10% Phân tích chuyển sang màng polyvinylidene difluoride (PVDF) (Millipore, Milford, MA) Western blot Block skim milk 5% (Wako, Tokyo, Nhật Bản) Ủ với HisProbe-HRP (1: 20.000; Thermo Scientific, Rockford, IL) nhiệt độ phịng Các dải protein phân tích SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific) Vật liệu phương pháp Reverse transcriptase assay Thử nghiệm hoạt tính polymerase rMMLVRT tiến hành cách sử dụng Reverse Transcriptase Assay, kit đo màu (Roche, Suisse) • Phản ứng RT thực 46 mM Tris-HCl, 266 mM KCl, 27.5 mM MgCl2, 9.2 mM DTT, 10 μM Dig- dUTP biotin-dUTP, khuôn/mồi 750mA260nm/ml 37°C 1h • Hỗn hợp phản ứng chuyển vào giếng microplate phủ streptavidin ủ 1h 37 ° C Sau rửa giếng, anti-DIG-POD (200 mU/ml) thêm vào giếng ủ 1h 37 ° C • Sau rửa, chất ABTS thêm vào giếng ủ 1h nhiệt độ phịng Sau đó, đo độ hấp thụ mẫu 405 nm (bước sóng tham chiếu: 490 nm) cách sử dụng đầu đọc BioTek's Synergy™ HTX (Biotek, Winooski, VT) Vật liệu phương pháp Thí nghiệm so sánh hoạt động enzyme phiên mã ngược Một lượng rMMLVRT tinh khiết tương đương với 200 đơn vị/μl MMLVRT chuẩn (NIPPON GENE, Nhật Bản), sử dụng để tổng hợp cDNA từ RNA tổng số tằm RNA tổng số (5 pg, 50 pg, 500 pg, ng, 50 ng, 500 ng), μl mồi đặc hiệu 28S rRNA tằm (2 μM), 10 mM dNTPs dH2O (đến 14 μl) trộn lẫn biến tính phút 65°C RNA/mồi trộn với μl × reaction buffer (250 mM Tris-HCl pH 8,3, 375 mM KCl 15 mM MgCl2), rMMLVRT μl chất ức chế RNase (TOYOBO, Nhật Bản), ủ 42°C (1h) Sau phản ứng RT, enzyme bị bất hoạt 70°C 15 phút Sản phẩm cDNA sau tổng hợp (1 μl) trộn với hỗn hợp phản ứng PCR (10 × PCR buffer (5 μl), mM dNTP (5 μl), 25 mM MgSO4 (3 μl), 10 μM mồi đặc hiệu, U KOD - plus - Neo (TOYOBO, Nhật Bản) dH2O (đến 50 μl)) PCR bắt đầu 95°C phút, sau 30 chu kỳ 95°C (15s), 58 ° C (15s), 68°C (10s) cuối giữ 68°C phút Vật liệu phương pháp Thử nghiệm độ ổn định nhiệt rMMLVRT ủ với RNA tổng số tằm mồi Oligo (dT) 50.0°C, 55.5°C, 61.9°C, 65.1°C 70.4°C 1h cDNA tạo thành dùng làm khuôn cho phản ứng PCR Sản phẩm PCR phân tích điện di gel agarose 1% + nhuộm EtBr Cường độ band điện di phân tích phần mềm Image J Để kiểm tra hoạt tính kéo dài chuỗi protein tinh sạch, chuỗi nặng fibroin đầu 5' khuếch đại PCR từ cDNA tổng hợp Kết Biểu rMMLVRT dòng tế bào BmO2 ngày sau lây nhiễm thời gian biểu tốt rMMLVRT Protein biểu hầu hết tan MMLVRT – C ( đuôi lực đầu C) biểu tốt Kết Mức độ biểu rMMLVRT qua phương pháp tinh rMMLVRT phát kỹ thuật Western Blot B D - tinh sắc ký lực Nikel C E - tinh sắc ký lực Strep tag Hệ thống biểu BVES tạo khối lượng lớn rMMLVRT Kết Xác định hoạt tính rMMLRVT ELISA rMMLVRT (Ec) có hoạt tính cao rMMLVRT – N rMMLVRT – C: Tuy hoạt tính thấp đạt yêu cầu Kết Phân tích độ nhạy rMMLVRT lượng nhỏ RNA rMMLVRT-C có hiệu phiên mã ngược cao so với cấu trúc cịn lại Kết Phân tích tính ổn định hoạt tính rMMLVRT tăng nhiệt độ C - Thể giản đồ vị trí PCR chuỗi fibroin tằm, mũi tên màu đen thể vị trí cặp mồi PCR D - rMMLVRT-N rMMLVRT-C tằm cịn hoạt tính 55.5 độ C, nhiên rMMLVRT (ec) Ecoli bị hoạt tính mức nhiệt Kết luận Thu thành công khoảng 3,10 2,24 mg rMMLVRT-N rMMLVRT-C từ 10 ấu trùng tằm từ BEVS Các hoạt tính enzym rMMLVRT phiên mã ngược so sánh enzym rMMLVRT thương mại tạo hệ thống biểu E.coli Trọng lương phân tử rMMLVRT-N rMMLVRT-C 78,5kDa 78,7 kDa Các rMMLVRT có hoạt tính polymerase DNA nồng độ RNA thấp rMMLVRT biểu BVES thể hoạt tính nhiệt độ cao rMMLVRT sử dụng hệ thống biểu E.coli THANK YOU FOR LISTENING ...Nội dung Cơ sở khoa học Baculovirus Ứng dụng Baculovirus sản xuất enzyme tái tổ hợp Cơ sở khoa học Baculovirus Phân loại Baculovirus: dsDNA vịng, 80 – 180 kbp mã... cDNA tổng hợp Kết Biểu rMMLVRT dòng tế bào BmO2 ngày sau lây nhiễm thời gian biểu tốt rMMLVRT Protein biểu hầu hết tan MMLVRT – C ( đuôi lực đầu C) biểu tốt Kết Mức độ biểu rMMLVRT qua phương... - 48h) Baculovirus sử dụng cho biểu gen Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) polh promotor P10 promotor Nucleocapsids mở rộng