TCVN15-Steroid

H­íng dÉn chung DỰ T HẢ O TC VN TCVN 1 | 13 TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA DỰ THẢO TCVN MỸ PHẨM – PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH CÁC STEROID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG (TLC) VÀ SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HP[.]

TCVN … TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN DỰ THẢO TC VN TCVN MỸ PHẨM – PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH - ĐỊNH TÍNH CÁC STEROID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP TH ẢO MỎNG (TLC) VÀ SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HPLC) D Ự Cosmetics – Analytical methods - Identification of steroids by thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) | 13 TCVN … Lời nói đầu TCVN xây dựng sở tham khảo ACM 007 - Identification of steroids in cosmetic products by TLC and HPLC thực nghiệm TCVN Viện Kiểm nghiệm Thuốc Thành phố Hồ Chí Minh biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng D Ự TH ẢO TC VN cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố | 13 TCVN … TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN Mỹ phẩm – Phương pháp phân tích - Định tính steroid phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Cosmetics – Analytical methods - Identification of steroids by thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) A ĐỊNH TÍNH STEROID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG (TLC) TC VN Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp sắc ký lớp mỏng để định tính steroid (bao gồm hydrocortison acetat, dexamethason, betamethason, betamethason 17-valerat triamcinolon acetonid) mỹ phẩm Nguyên tắc TH ẢO Sau chiết steroid ethyl acetat (đối với mẫu thử dạng lỏng) methanol (đối với mẫu thử dạng cream), steroid tách phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC xác định đèn UV bước sóng 254 nm, sử dụng chất chuẩn tương ứng Thuốc thử Tất thuốc thử sử dụng phải loại tinh khiết phân tích có chất lượng tương đương D định khác Ự Nước sử dụng phải nước khử ion nước có độ tinh khiết tương đương, trừ có quy CẢNH BÁO: Cơng việc phân tích phải tiến hành mơi trường phịng thử nghiệm phù hợp, trang bị bảo hộ cá nhân (ví dụ: kính bảo hộ, quần áo bảo hộ lao động, găng tay) 3.1 Dicloromethan 3.2 Ethyl acetat 3.3 Nước tinh khiết 3.4 Methanol 3.5 Anisaldehyd 3.6 Acid sulfuric đậm đặc 3.7 Dung dịch acid hydrocloric, 0,5 M | 13 TCVN … 3.8 Dung dịch amonium hydroxyd, 0,5 M 3.9 Acid acetic băng 3.10 Dung môi khai triển, dicloromethan – methanol – nước (95 : : 0,2) (tt/tt/tt) 3.11 Chất đối chiếu: 3.11.1 Hydrocortison acetat (RS) 3.11.2 Dexamethason (RS) 3.11.3 Betamethason (RS) 3.11.4 Betamethason 17-valerat (RS) 3.11.5 Triamcinolon acetonid (RS) TC VN 3.12 Dung dịch chuẩn đối chiếu Cân xác khoảng 10 mg chất chuẩn đối chiếu vào bình định mức 10 ml (4.4) riêng biệt, thêm ml methanol (3.4) siêu âm phút, tiếp tục thêm methanol (3.4) vừa đủ đến vạch, trộn 3.13 Dung dịch chuẩn đối chiếu hỗn hợp TH ẢO Cân xác khoảng 10 mg chất chuẩn đối chiếu vào bình định mức 10 ml (4.4), thêm ml methanol (3.4) siêu âm phút, tiếp tục thêm methanol (3.4) vừa đủ đến vạch, trộn Hút ml dung dịch vào bình định mức 10 ml (4.4) thêm methanol (3.4) vừa đủ đến vạch 3.14 Thuốc thử phát (chỉ pha dùng) Lấy xác 50 ml acid acetic băng (3.9) vào bình định mức 100 ml (4.4) thêm 0,5 ml Ự anisaldehyd (3.5), 11 ml acd sulfuric đậm đặc (3.6), lắc nhẹ nhàng D Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: 4.1 Cân phân tích, cân xác đến 0,1 mg 4.2 Đèn soi tử ngoại, 254 nm 4.3 Silica gel 60 F254, 10 cm x 20 cm; bề dày 0,25 mm (Merck tương đương) 4.4 Bình định mức, loại A, dung tích 10 ml, 100 ml 4.5 Bình chiết, loại A, dung tích 100 ml 4.6 Bể điều nhiệt 4.7 Bể siêu âm 4.8 Bình sắc ký | 13 TCVN … 4.9 Dụng cụ phun thuốc thử 4.10 Máy ly tâm, quay tốc độ từ 3000 đến 4000 vòng/phút 4.11 Máy lắc 4.12 Máy đo pH 4.13 Màng lọc PVDF, 0,45 µm 4.14 Pipet thủy tinh, với dung tích khác 4.15 Tủ sấy Cách tiến hành 5.1 Chuẩn bị dung dịch thử TC VN 5.1.1 Mẫu thử dạng lỏng: lấy xác khoảng 15 ml (4.14) mẫu thử, trung tính hóa đến pH dung dịch acid hydrocloric 0,5 M (3.7) dung dịch amonium hydroxyd 0,5 M (3.8), chiết lần lần với 20 ml ethyl acetat (3.2), loại bỏ lớp nước, lọc tập trung dịch chiết ethyl acetat, bay cạn bể điều nhiệt (4.6), hịa tan cắn ml methanol (3.4), lọc qua màng lọc 0,45 µm (4.13) TH ẢO 5.1.2 Mẫu thử dạng kem: cân xác khoảng 5000 mg mẫu thử ống ly tâm 20 ml, thêm 20 ml methanol (3.4), làm ấm bể điều nhiệt (4.6) 60 oC khoảng 10 lắc mạnh Ly tâm (4.10) 3000 – 4000 vịng/phút 10 phút, sau để tủ lạnh 10 phút, bay dung dịch phía đến khơ bể điều nhiệt (4.6), hịa tan cắn ml methanol (3.4), lọc qua màng lọc 0,45 µm (4.13) Ự 5.2 Xác định TLC 5.2.1 Điều kiện sắc ký lớp mỏng D Hoạt hóa mỏng (4.3) 100 oC 10 phút Bão hòa bình sắc ký (4.8) với hệ dung mơi triển khai (3.10) 5.2.2 Phân tích mẫu thử Chấm lên mỏng (4.3) 20 µl dung dịch thử; dung dịch chuẩn đối chiếu; dung dịch thử dung dịch chuẩn đối chiếu với tỷ lệ (1:1) Triển khai mỏng sắc ký khoảng 15 cm (tránh ánh sáng) Lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng Quan sát mỏng đèn soi tử ngoại 254 nm (4.2), đánh dấu vị trí vết mỏng Phun thuốc thử phát (3.14) Sấy (4.15) 120 oC 10 phút, quan sát màu vết nhận | 13 TCVN … Đánh giá kết 6.1 Tính giá trị Rf, vết sau sắc ký mẫu thử mẫu chuẩn đối chiếu công thức sau: a: khoảng cách từ tâm vết đến vạch xuất phát b: khoảng cách từ đường dung môi đến vạch xuất phát 6.2 Quan sát vị trí, hình dạng màu sắc, vết sắc ký soi đèn sau phun thuốc thử mẫu thử mẫu chuẩn 6.3 Kết quả, So sánh vết thu từ mẫu thử với vết mẫu chuẩn tương ứng trị số R f màu TC VN sắc sau phun thuốc thử Trường hợp dương tính: Mẫu thử phải cho vết có hính dạng, màu sắc Rf tương ứng với vết mẫu chuẩn đối chiếu Steroid Rf Màu sắc vết sau phun thuốc thử Xanh xám Khoảng 0,15 Xám Triamcinolon acetonid Khoảng 0,29 Nâu Hydrocortison acetat Khoảng 0,39 Vàng Betamethason valerat Khoảng 0,36 Tím đen Ự Betamethason TH ẢO Khoảng 0,17 Dexamethason D Trường hợp dương tính theo phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), thực thêm phương pháp HPLC theo mục B để khẳng định | 13 TCVN … B ĐỊNH TÍNH STEROID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dị PDA để định tính steroid (bao gồm prednison, prednisolon, betamethason, dexamethason, cortison, hydrocortison acetat, mometason furoat, betamethason 17-valerat, triamcinolon acetonid) mỹ phẩm Nguyên tắc Mẫu thử chiết với methanol, làm bay dịch chiết đến khơ, cắn hịa methanol dùng định tính steroid phương pháp HPLC với cột pha đảo đầu dò PDA Thuốc thử TC VN Tất thuốc thử sử dụng phải loại tinh khiết phân tích, dùng cho sắc ký lỏng hiệu cao có chất lượng tương đương Nước sử dụng phải nước khử ion nước có độ tinh khiết tương đương, trừ có quy định khác CẢNH BÁO: Cơng việc phân tích phải tiến hành mơi trường phịng thử nghiệm 3.1 Methanol 3.2 Acetonitril 3.3 Nước 3.4 Pha động Ự tay) TH ẢO phù hợp, trang bị bảo hộ cá nhân (ví dụ: kính bảo hộ, quần áo bảo hộ lao động, găng D Thời gian (phút) Thành phần pha động % Acetonitril Nước 0,00 20 80 2,00 25 75 14,00 30 70 18,00 40 60 20,00 50 50 22,00 70 30 30,00 20 80 45,00 20 80 3.5 Chất chuẩn 3.5.1 Prednison 3.5.2 Prednisolon | 13 TCVN … 3.5.3 Betamethason 3.5.4 Dexamethason 3.5.5 Cortison 3.5.6 Hydrocortison acetat 3.5.7 Mometason furoat 3.5.8 Betamethason 17-valerat 3.5.9 Triamcinolon acetonid 3.6 Dung dịch chuẩn 3.6.1 Dung dịch chuẩn đối chiếu TC VN Cân xác khoảng mg chất chuẩn đối chiếu, xác đến 0,01 mg, cho vào bình định mức 20 ml (4.7), thêm ml methanol (3.1), siêu âm phút, thêm methanol (3.1) đến vạch lắc 3.6.2 Dung dịch chuẩn hỗn hợp Lấy 1ml dung dịch chuẩn đối chiếu (3.6.1) vào bình định mức 10 ml (4.7) điền đầy vói TH ẢO methanol (3.1), lọc qua màng lọc 0,45 µm (4.10) Dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,025 mg/ml Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao, đầu dò PDA, trang bị bơm, bơm mẫu tự Ự 4.1 D động, điều nhiệt cho cột máy tính phân tích liệu 4.2 Cột phân tích HPLC, Phenyl-Hexyl (kích thước 4,6 mm x 150 mm, µm) hay tương đương 4.3 Cân phân tích, cân xác đến 0,1 mg, 0,01 mg 4.4 Máy lắc 4.5 Máy ly tâm, quay tốc độ từ 3000 đến 4000 vòng/phút 4.6 Bể điều nhiệt 4.7 Bình định mức, loại A, dung tích 5, 10, 25 50 ml 4.8 Pipet thủy tinh, với dung tích khác 4.9 Ống ly tâm, 10 ml, có nắp đậy kín 4.10 Màng lọc PVDF, 0,45 µm 4.11 Xylanh, dung tích ml | 13 TCVN … 4.12 Lọ đựng mẫu cho HPLC, loại 1,5 ml tương đương (phù hợp thiết bị sử dụng) Cách tiến hành 5.1 Chuẩn bị dung dịch thử - Cân xác khoảng 1,000 g mẫu thử, xác đến 0,1 mg, vào vào ống ly tâm (4.9), thêm ml methanol (3.1), Làm ấm bể điều nhiệt (4.6) 60 oC 10 phút, lắc mạnh 10 phút, ly tâm 3000-4000 vịng/phút, sau để lạnh 10 phút, lấy dịch bay đến khô bể điều nhiệt (4.6) , hòa tan cắn ml methanol (3.1) - Lọc qua màng lọc 0,45 µm (4.10) (nếu cần ly tâm 10 phút 5.2 Điều kiện sắc ký Chạy theo chế độ gradient (3.4) – Detector: PAD bước sóng 240 nm – Thể tích mẫu bơm: 10 µl – Tốc độ dịng: 0,7 ml/phút – Nhiệt độ buồng cột: 40 oC – Thời gian sắc ký: TC VN – Pha động: TH ẢO 45 phút 5.3 Tương thích hệ thống 5.3.1 Tiêm lần dung dịch chuẩn hỗn hợp, xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) diện tích chiều cao pic RSD phải nhỏ % tất chất đối chiếu phải lớn 1,5 Ự 5.3.2 Độ phân giải đỉnh liền sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp (3.6.2) D 5.3.3 Hệ số bất đối xứng đỉnh khoảng từ 0,9 – 1,5 5.4 Tiêm dung dịch sau: 5.4.1 Các dung dịch chuẩn đối chiếu 5.4.2 Dung dịch chuẩn hỗn hợp 5.4.3 Dung dịch thử Đánh giá kết 6.1 Mẫu thử xác định dương tính với hợp chất steroid khi: - Thời gian lưu pic tương ứng mẫu thử khác biệt không % so với thời gian lưu pic tương ứng sắc ký đồ mẫu chuẩn | 13 TCVN … - Diện tích hay chiều cao pic tương ứng mẫu thử lớn diện tích hay chiều cao pic tương ứng sắc ký đồ có nồng độ ứng với LOD dung dịch chuẩn - Pic phải đáp ứng yêu cầu mục 5.3.2 (nếu cần), mục 5.3.3 phổ PDA pic giống với pic tương ứng sắc ký đồ mẫu chuẩn 6.2 Mẫu thử xác định âm tính với hợp chất steroid diện tích hay chiều cao pic tương ứng mẫu thử nhỏ diện tích hay chiều cao pic tương ứng sắc ký đồ mẫu tự tạo có nồng độ ứng với LOD pha dung dịch chuẩn Ghi chú: thông tin tham khảo D Ự TH ẢO TC VN LOD cho tất steroid dung dịch chuẩn µg/mL tương ứng mẫu thử µg/g Hình sắc ký đồ thơng tin pic dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 | 13 D Ự TH ẢO TC VN TCVN … 11 | 13 D Ự TH ẢO TC VN TCVN … Hình phổ UV pic chuẩn steroid dung dịch chuẩn hỗn hợp 12 | 13 TC VN TCVN … TH ẢO Hình ví dụ sắc ký đồ thông tin pic dung dịch tự tạo với chuẩn hỗn hợp có nồng độ LOD mẫu kem Tài liệu tham khảo [1] ACM 007 - Modified and approved after the final review in Malaysia on November 28th, D Ự 2013, updated on 21st June 2019 13 | 13