TC3

Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam Số 3(64)/2016 13 I ĐẶT VẤN ĐỀ Công tác khẳng định chủ quyền Quốc gia về các nguồn gen đặc biệt quan trọng khi nước ta đã tham gia công ước về đa dạng si[.]

Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 3(64)/2016 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ LẬP TIÊU BẢN ADN CÁC GIỐNG CHÈ VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR VÀ SCoT Nguyễn Bá Ngọc1, Nguyễn ị anh ủy2 TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, 23 nguồn gen chè Việt Nam đánh giá đa dạng di truyền 16 mồi SSR 45 mồi SCoT (Start Codon Targeted) Trong đó, 16 thị SSR 25 thị SCoT cho đa hình tập đoàn nghiên cứu Kết thiết lâp 16 mẫu tiêu SSR 25 tiêu ScoT 23 nguồn gen chè Trong đó, 13 nguồn gen chè phân biệt 19 alen 15 locut thị (2 locut SSR 13 locut SCoT) Phân tích đa dạng di truyền 23 giống chè sử dụng 41 thị phân tử (SSR SCoT) thu 405 alen, đạt trung bình 9,9 alen/locut Chỉ số đa dạng PIC dao động từ 0,23 -0,98 (trung bình 0,73), chứng tỏ đa dạng cao mặt di truyền locut nghiên cứu Ma trận tương đồng sơ đồ hình biểu diễn mối quan hệ di truyền 23 giống chè xây dựng dựa hệ số tương đồng DICE cho thấy hệ số tương đồng di truyền giống chè dao động từ 0,47 đến 0,79 (trung bình 0,59) phân làm phân nhóm Kết cho thấy thị phát khác biệt di truyền nguồn gen nghiên cứu Từ khóa: Cây chè, thị SCoT, thị SSR, đa dạng di truyền, tiêu ADN I ĐẶT VẤN ĐỀ Công tác khẳng định chủ quyền Quốc gia nguồn gen đặc biệt quan trọng nước ta tham gia công ước đa dạng sinh học Quốc tế (CBD) năm 1994 Bảo hộ tốt quyền tác giả giống vật nuôi, trồng đảm bảo việc chia sẻ cơng lợi ích từ nguồn gen, bảo tồn phát triển bền vững đa dạng nguồn gen eo phương pháp truyền thống, đặc điểm hình thái thường sử dụng để mơ tả đặc tính giống Cơng việc tốn nhiều thời gian gặp phải khó khăn tác động điều kiện môi trường Mọi khác biệt cá thể mã hóa phân tử ADN, tiêu ADN (DNA ngerprint) thực hữu ích cho việc phân biệt, nhận dạng giống Collard Mackill (2009) thiết kế thị cho chè, dựa vào trình tự bảo thủ chứa ba mở đầu ATG thị ScoT (Start Codon Targeted) Ưu điểm thị ScoT đơn giản, tỷ lệ đa hình cao, liên quan trực tiếp tới vùng mã hóa , thị phát triển rộng rãi số trồng quan trọng lúa (Collard and Mackill; 2009), nhãn (Chen et al., 2010), mía (Wu et al., 2013) Hiện chè xác định trồng chủ lực quy hoạch phát triển kinh tế tỉnh trung du miền núi phía Bắc nước ta Có nhiều vùng trồng chế biến chè tiếng Mộc Châu, Nguyên, Hà Giang với giống chè quý chè Shan Hà Giang, chè Tân Cương Nguyên Đây nguồn vật liệu có giá trị lớn chương trình chọn tạo giống chè Tuy nhiên tính tới Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu việc lập tiêu để nhận dạng giống chè q Chính tiến hành nghiên cứu “Phân tích đa dạng di truyền lập tiêu ADN giống chè Việt Nam thị phân tử SSR thị ScoT” II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu - 23 mẫu giống chè Việt Nam lưu giữ Viện Miền núi phía Bắc Mạng lưới Bảo tồn Tài nguyên thực vật (Bảng 1) - Các thị phân tử: 16 cặp mồi SSR (bao gồm 10 cặp mồi SSR thiết kế đặc hiệu cho chè Camellia sinensis (Freeman et al., 2004) cặp mồi thiết kế cho chè hoa Camellia japonica (Ueno et al., 1999) 25 thị ScoT (Collard, Mackill, 2009; Jian-Ming Wu, 2013) Viện Di truyền Nơng nghiệp Bộ Nơng nghiệp PTNT 13 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 3(64)/2016 Bảng Danh sách 23 giống chè sử dụng nghiên cứu TT Nguồn gốc, phân bố Tên giống Chè Xuân Sơn Phú Chè Nậm Ngặt Chè Tân Chi Chè Tân Cương Hooc Môn ọ Ký hiệu TT Tên giống Nguồn gốc, phân bố T1 13 PH1 Phú Hà Giang T2 14 Chè Lao Chảy Hà Giang T14 Lạng Sơn T3 15 Chè Gia Vài Hà Giang T15 T4 16 Chè Lũng Phìn Hà Giang T16 Nam Bộ T5 17 Chè TB14 Lâm Đồng T17 Nậm Ty Hà Giang T6 18 Tà Xùa Sơn La T18 Mộc Châu Sơn La T7 19 Chè Suối Giàng Yên Bái T19 Chất Tiền Hà Giang T8 20 Ba Vì Ba Vì T20 Brao cũ Lâm Đồng T9 21 Dền Sáng Hà Giang T21 10 Minh Rồng Lâm Đồng T10 22 Chè Cù Dề Phùng Hà Giang T22 11 Bản Xen Quảng Ninh T11 23 Chè T23 12 Trung du (tím) Phú T12 Nguyên ọ 2.2 Phương pháp nghiên cứu ADN chè tách chiết tinh theo phương pháp CTAB Doyle (1987) Chất lượng nồng độ ADN tổng số xác định máy quang phổ nanodrop Phản ứng PCR thực với tổng thể tích 15 µl, gồm: 5µl ADN, 0,15µM mồi, 0,2 mM dNTPs, 1X dịch đệm PCR, 2,5mM MgCl2 0,25 đơn vị Taq TaKaRa; điều kiện chạy phản ứng: 950C - phút; 35 chu kỳ của: 940C - 15 giây, 550C - 30 giây, 720C - phút; 72 0C - phút; giữ mẫu 40C Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5% đệm TBE, nhuộm EtBr soi đèn UV Các phản ứng lặp lại lần để chắn tính xác thí nghiệm Phân tích số liệu: Các số liệu thống kê tính tốn gồm số alen locut, tần số alen phổ biến nhất, alen (alen xuất giống toàn giống chè nghiên cứu) đa dạng di truyền alen thị SSR thông qua hệ số PIC (Polymorphism Information Content) tính tốn theo phương trình: n PICi=1- ∑j-1 P ij Trong đó: Pij : tần số xuất alen thứ j tương ứng với mồi i Giá trị PIC lớn tức mức độ đa hình 14 am Vè ọ Ký hiệu Hà Giang T13 locus mồi i khuếch đại lớn, tức nhiều alen sinh Sự có mặt hay vắng mặt alen thị SSR ghi nhận cho tất giống chè nghiên cứu, khơng có băng ADN có băng ADN vị trí Số liệu xử lý chương trình NTSYS-pc v 2.1 (Rohlf, 1997) để xây dựng ma trận tương đồng di truyền sử dụng hệ số Dice (Dice, 1945; Nei, 1979) sơ đồ hình biểu diễn mối quan hệ di truyền giống chè nghiên cứu III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Lập tiêu ADN 23 giống chè Việt Nam thị SSR Trong nghiên cứu này, kết phân tích 16 cặp mồi SSR với 23 giống chè thu tổng số 48 alen, đạt trung bình alen/locut, hệ số PIC dao động khoảng từ 0,23 (locut MScjaF25) tới 0,71 (locut CamsinM5) Như vậy, với 16 thị SSR cho đa hình rõ nét, lập 16 tiêu ADN ngerprinting 23 mẫu giống chè Việt Nam Trong số alen thu được, locut CamsinM4 (SSR4) CamsinM6 (SSR6) xuất alen đặc trưng Nguồn gen chè Xuân Sơn (T1) nhận dạng alen locut SSR6 (Hình 1); Nguồn gen Nậm Ty (T6) nhận dạng alen locut SSR4 (Hình 2) Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 3(64)/2016 Hình Tiêu SSR 23 giống chè locut SSR6 Hình Tiêu SSR 23 giống chè locut SSR4 3.2 Lập tiêu ADN 23 giống chè Việt Nam thị ScoT Kết phân tích 45 thị SCoT với 23 giống chè thu 25 thị cho đa hình với tổng số 357 alen, có 17 alen đặc trưng cho giống, alen tiềm cho việc phát triển thị ScoT- SCAR Những thị cho đa hình sử dụng để lập 25 tiêu ADN cho 23 nguồn gen chè Việt Nam Trong tiêu SCoT lập có 13 thị khuếch đại 17 alen 12 nguồn gen Phân tích kết nhận thấy thị SCoT12, SCoT21, ScoT28 ScoT46 nhận biết alen hiếm/ nguồn gen Các thị lại nhận biết alen hiếm/ nguồn gen (Bảng 2, Hình 3) Tổng hợp phân tích tiêu SSR SCoT cho thấy, 13 nguồn gen chè Việt Nam phân biệt với với nguồn gen khác 19 alen Giống Chè Lũng Phìn (T16) phân biệt alen locut SCoT; giống Chè Xuân Sơn (T1), chè Nậm Ngặt (T2) Chè Cù Dề Phùng (T20) nhận biết alen (Bảng 3) Các alen ScoT dùng để giải trình tự nhằm xác định trình tự mã nhận dạng cho nguồn gen Bảng Các thị SCoT khuếch đại alen giống chè Việt Nam TT Chỉ thị SCoT3 SCoT10 SCoT11 SCoT12 SCoT13 SCoT18 SCoT21 Alen 1 1 Mẫu có alen T10 T7 T2 T12, T16 T16 T18 T20, T22 TT 10 11 12 13 Tổng Chỉ thị SCoT23 SCoT28 SCoT30 SCoT34 SCoT35 SCoT46 13 Alen 1 17 Mẫu có alen T4 T16 T19 T1 T16 T2, T13 12 Hình Tiêu ScoT 23 giống chè locut ScoT3 15 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 3(64)/2016 Bảng Các nguồn gen chè nhận biết alen locut Nguồn gen có alen TT 10 11 12 13 Ký hiệu T1 T2 T4 T6 T7 T10 T12 T13 T16 T18 T19 T20 T22 Tổng Tên giống Chè Xuân Sơn Chè Nậm Ngặt Chè Tân Cương Nậm Ty Mộc Châu Minh Rồng Bản Xen PH1 Chè Lũng Phìn Tà Xùa Chè Suối Giàng Ba Vì Chè Cù Dề Phùng 13 Alen 3.3 Kết phân tích mối quan hệ di truyền nguồn gen chè nghiên cứu Kết phân tích đa dạng di truyền sử dụng 41 thị phân tử (SSR SCoT) thu tổng cộng 405 alen, locut có từ đến 23 alen, số alen trung bình 9,9 alen/locut, tần số alen phổ biến dao động từ 9,33% (chỉ thị SCoT5) 86,96% (chỉ thị SSR14) Trong tổng số 405 alen thu có 19 alen Các thị thu alen SCoT12, SCoT21, SCoT28 SCoT46 Chỉ số đa dạng PIC locut nghiên cứu dao động từ 0,23 đến 0,98, với giá trị trung bình 0,73 Giá trị PIC trung bình phản ánh mức độ đa dạng chung cho tất locut nghiên cứu Điều chứng tỏ thị sử dụng nghiên cứu cho kết 2 1 1 1 1 19 Chỉ thị CamsinM6, SCoT34 SCoT11, ScoT46 SCoT23 CamsinM4 SCoT10 SCoT3 SCoT12 ScoT46 SCoT12, SCoT13, SCoT28, SCoT35 SCoT18 SCoT30 SCoT21, ScoT46 SCoT21 15 đa dạng cao giống chè Ma trận tương đồng 23 giống chè tính tốn thơng qua hệ số Dice sơ đồ hình thiết lập phương pháp UPGMA thể mối quan hệ di truyền giống chè (Hình 4) Kết phân tích cho thấy hệ số tương đồng di truyền giống chè dao động từ 0,47 đến 0,79 với giá trị trung bình 0,59 Hai giống chè TB14 (T17) - Chè Dền Sáng (T21) có hệ số tương đồng di truyền cao 0,79 Chè Xuân Sơn (T1) chè Bản Xen (T12) xếp nhóm tách biệt với toàn giống chè nghiên cứu Các giống chè cịn lại chia làm nhóm giá trị tương đồng 0,58 Kết cho thấy thị phát khác biệt di truyền nguồn gen nghiên cứu Hình Sơ đồ hình biểu diễn mối quan hệ di truyền 23 giống chè nghiên cứu 16 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 3(64)/2016 IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 4.1 Kết luận - 16 mẫu tiêu SSR 25 tiêu ScoT 23 nguồn gen chè Việt Nam lập, 13 tiêu SCoT có 17 alen 12 nguồn gen; tiêu SSR có alen nguồn gen chè Đây nghiên cứu Việt Nam sử dụng hệ thị ScoT để lập tiêu ADN cho nguồn gen chè địa Các alen SCoT sử dụng để phát trình tự đặc trưng cho nguồn gen tương ứng - Kết phân tích đa dạng di truyền 23 giống chè Việt Nam với 41 thị phân tử (16 thị SSR 25 thị SCoT) thu 405 alen, trung bình 9,9 alen/locut Chỉ số đa dạng PIC dao động từ 0,23 - 0,98, với giá trị trung bình 0,73, chứng tỏ khả cho đa dạng cao thị phân tử nghiên cứu - Hệ số tương đồng di truyền Dice giống chè nghiên cứu dao động từ 0,47 đến 0,79 với giá trị trung bình 0,59 cho thấy đa dạng cao nguồn gen chè địa Việt Nam Chen, H., X.H He, C Luo, J Zhu, F Li, 2010 Analysis on the genetic diversity of 24 longan (Dimocarpus longan) accessions by SCoT markers Acta Hortic Sin Acta Horticulturae Sinica, 37(10): 1651 -1654 Collard, B.C.Y., D.J Mackill, 2009 Start Codon Targeted (SCOT) Polymorphism: a simple novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants Plant Mol Biol Rep, 27: 86–93 Doyle, J.J., J.L Doyle, 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochem Bull, 19: 11-15 Freeman, S., J West, 2004 Isolation and characterization o ighly polymorphic microsatellite in tea (Camellia sinensis) Molecular Ecology Notes, 4: 324-326 Wu J.M., Y.R Li, L.T Yang, F.X Fang, H.Z Song, H.Q Tang, M Wang, M.L Weng, 2013 cDNA-SCoT: A novel rapid method for analysis of gene di erential expression in sugarcane and other plants AJCS, 7(5): 659-664 Nei M and W.H Li, 1979 Mathematical model for studying genetical variation in terms of restriction endonucleases Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 76(10): 5269-5273 Rohlf F., 1997 NTSYS-pc: numerical taxonomy and multivariate analysis system, 2.1 edn Department of Ecology and Evolution, State University of NY, Stony Brook Ueno, S., H Yoshimaru, 1999 Development and characterization of microsatellite markers in Camellia japonica L Molecular Ecology, 8: 335-346 4.2 Đề nghị Khuyến nghị sử dụng 25 thị ScoT 16 thị SSR nghiên cứu đa dạng di truyền nhận biết nguồn gen chè Việt Nam Genetic diversity evaluation and DNA pro le of Northern Vietnamese tea germplasms by SSR and SCoT markers Nguyen Ba Ngoc, Nguyen i anh uy Abstract Sixteen simple sequence repeat and 45 Start Codon Targeted (SCoT) markers were used to evaluate 23 Vietnamese camellia germplasms in this study All surveyed SSR markers and 25 out of 45 SCoT markers were polymorphic among tea accessions and thus, 16 SSRs and 25 SCoT ngerprints of 23 tea accessions were pro led successfully In this ngerprinting, 13 tea accessions could be distinguished by 19 unique alleles at SSRs and 13 SCoT loci Polymorphic analysis based on 41 markers (SSR, SCoT) revealed a total of 405 alleles, averaging 9.9 alleles per locus Polymorphism Information Content (PIC) ranged from 0.23 -0.98 re exed rather high genetic diversity among studied tea accessions Neighbour joining tree grouping by Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages showed that Dice coe cent among 23 accessions ranged from 0.47-0.79 and averaged at 0.59, which seperated each tea germplasm distingly in groups Key words: DNA ngerprinting, genetic diversity, SCoT markers, SSR markers, tea Ngày nhận bài: 12/4/2016 Người phản biện: TS Trần Danh Sửu Ngày phản biện: 19/4/2016 Ngày duyệt đăng: 26/4/2016 17 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 3(64)/2016 XÂY DỰNG DỮ LIỆU TIÊU BẢN ADN CỦA MỘT SỐ NGUỒN GEN CHUỐI BẢN ĐỊA BẰNG CHỈ THỊ SSR VÀ SCOT Nguyễn ị Lan Hoa1, Nguyễn ị anh ủy2 TÓM TẮT Chỉ thị ADN cơng cụ hữu hiệu đóng vai trị quan trọng việc nhận dạng nguồn gen giống trồng Nghiên cứu sử dụng 46 thị SCoT 13 thị genic-SSR thị PCR-based để xây dựng tiêu ADN 12 giống chuối địa Kết phân tích đa hình với thị SCoT thu 29/46 mồi cho đa hình nguồn gen chuối nghiên cứu, tổng cộng thu 267 băng đa hình Kích thước sản phẩm khuếch đại khoảng từ 200-2000bp Trong đó, mồi ScoT khuếch đại 10 băng đặc trưng giúp nhận dạng nguồn gen Chuối Tây anh Hóa, Chuối Hột, Chuối Trăm nải, chuối Gáo Mười tổng số 13 thị genic-SSR cho đa hình sử dụng thành công để lập tiêu ADN nguồn gen chuối nghiên cứu, kết thu 64 alen từ 10 thị, thị khuếch đại 13 alen mẫu giống tập đoàn nghiên cứu Kết cung cấp thêm thông tin cần thiết cho việc quản lý, nhận dạng, công tác chọn tạo giống chuối Việt Nam Từ khóa: Cây chuối, tiêu ADN, thị ScoT, thị SSR I ĐẶT VẤN ĐỀ Chuối loại ăn nhiệt đới quan trọng nhất, đứng thứ tư giới giá trị xuất sau gạo, bột mỳ sữa Nước ta nằm vùng xuất xứ đa dạng nguồn gen chuối, gồm chuối trồng dạng hoang dại với số lượng giống chuối đa dạng đủ dạng kiểu gen (loài) nhiều dạng khác chưa nhận diện kiểu phân loại Các giống chuối khó nhận diện phân loại chuối có hệ gen phức tạp; kiểu hình biến động lớn mơi trường nên khó áp dụng hệ thống phân loại hình thái Đa phần giống biết đến tên gọi địa phương chưa gọi tên khoa học xác Đây trở ngại công tác phân loại để quản lý nguồn gen chuối nước ta Ngày nay, tiến trình chọn giống chuối bị hạn chế hệ gen phức tạp cách thức nhân giống canh tác chuối đa bội, nhiều kỹ thuật phân tử tế bào ứng dụng chọn tạo giống chuối Sử dụng thi phân tử đánh giá nguồn gen phân tích quần thể có vai trị đầy hứa hẹn cải tiến hiệu chương trình chọn giống chuối Những kỹ thuật phân tích hơndựa polyphenol, isozym, thị phân tử ADN lục lạp, ADN nhân: RFLP, RAPD, AFLP, STMS, IRAP, DArT, rRNA, SEAP sử dụng để giúp củng cố kết nghiên cứu đa dạng phục vụ mục tiêu chọn giống chuối Với phát triển mạnh việc nghiên cứu genome, việc thiết kế thị khuếch đại vùng gen lặp nằm gần vùng gen mã hóa (genic-SRR) phát triển sử dụng hiệu nghiên cứu đa dạng chọn giống chuối Cùng với thị SSR, vùng mã hóa, hệ thị SCoT (Start Codon Targeted) đời dựa phản ứng PCR khuếch đại trình tự bảo thủ chứa ba mở đầu ATG gen có ưu điểm đơn giản, tỷ lệ đa hình cao, chi phí thấp, liên quan trực tiếp tới vùng mã hóa nên gần thị phát triển rộng rãi số trồng ăn quan trọng nhãn (Chen cs., 2010), xoài (Luo cs., 2011)… Do hiệu mức độ sẵn sàng hai loại thị này, nghiên cứu này, sử dụng hai loại thị EST-SSR SCoT cho công tác lập tiêu ADN cho 12 nguồn gen chuối địa Việt Nam II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu - Nguồn gen: 12 mẫu giống chuối địa lưu giữ Viện khoa học kỹ thuật Nơng-Lâm nghiệp Miền núi phía Bắc ơng tin thu thập tham khảo giống chuối ghi nhận Bảng Các thị phân tử - 13 thị genic-SSR nằm 11 NST chuối thiết kế vùng coding protein liên quan đến hình thành tính kháng điều kiện bất thuận trồng theo chế: bảo vệ (defence) kháng (resistance), dựa trình tự transcriptom hệ gen lưỡng bội M acuminata, M balnisiana tam bội M acuminata Cavendish (Passo MA, 2013) Trung tâm Tài nguyên thực vật; Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn 18