Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.

Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ THÙY VÂN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ SINH TỔNG HỢP CYCLOOLIGOMER DEPSIPEPTIDE CỦA NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG TẠI KHU BẢO TỒN THIÊN NHIÊN COPIA VÀ VƯỜN QUỐC GIA XUÂN SƠN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ THÙY VÂN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ SINH TỔNG HỢP CYCLOOLIGOMER DEPSIPEPTIDE CỦA NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG TẠI KHU BẢO TỒN THIÊN NHIÊN COPIA VÀ VƯỜN QUỐC GIA XUÂN SƠN Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9.42.01.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS DƯƠNG MINH LAM GS TS NGÔ SỸ HIỀN HÀ NỘI - 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân tơi Các kết cơng bố luận án trung thực, xác Tơi xin chịu trách nhiệm hồn tồn số liệu, nội dung trình bày luận án Hà Nội, ngày 27 tháng năm 2022 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thùy Vân ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: - Thầy PGS.TS Dương Minh Lam, người thầy kính mến ln tận tình hướng dẫn, dạy bảo, động viên tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt công việc luận án - Thầy GS TS Ngô Sỹ Hiền, người thầy theo sát bên tơi, bảo tận tình có góp ý vơ q báu q trình nghiên cứu - Quý thầy cô môn Công nghệ sinh học - Vi sinh, TS Trần Thị Thúy, PGS TS Đoàn Văn Thược, TS Phan Duệ Thanh, ThS Tống Thị Mơ, CN Phạm Thị Hồng Hoa góp ý, hỗ trợ tinh thần suốt q trình tơi thực nghiên cứu - Quý thầy cô PTN Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa học - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội; Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp nhiều việc thực luận án - GS TS Trương Xuân Lam giúp đỡ định loại mẫu côn trùng thu thập khu vực nghiên cứu - Phòng Sau đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh - Đại học Sư phạm Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi trình thực luận án - Ban Giám đốc Học viện Cảnh sát nhân dân, Lãnh đạo Khoa Kỹ thuật hình động viên tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu - Gia đình nhỏ, đồng nghiệp, bạn bè ln u thương, động viên, tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành khóa học Hà Nội, ngày 27 tháng năm 2022 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thùy Vân iii MỤC LỤC Trang phụ bìa LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Nấm nấm ký sinh côn trùng .5 1.1.1 Giới thiệu nấm 1.1.2 Nấm ký sinh côn trùng 1.2 Nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide 1.2.1 Cyclooligomer depsipeptide 1.2.2 Đa dạng nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide 18 1.2.3 Con đường sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide nấm 24 1.3 Nhu cầu dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide 26 1.3.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy 26 1.3.2 Độ pH 28 1.3.3 Nguồn cacbon 29 1.3.4 Nguồn nitơ .30 1.4 Tách chiết, tinh nghiên cứu cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng .31 1.4.1 Tách chiết 32 1.4.2 Tinh 33 1.4.3 Nghiên cứu cấu trúc 34 1.5 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 35 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Nguyên vật liệu đối tượng nghiên cứu 42 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 42 2.1.2 Hóa chất thiết bị 42 2.1.3 Môi trường 43 2.2 Phương pháp nghiên cứu 43 2.2.1 Phương pháp vi sinh vật học 43 2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 49 2.2.3 Phương pháp tách chiết tinh cyclooligomer depsipeptide 52 2.2.4 Các phương pháp phân tích .55 2.2.5 Phương pháp toán học .56 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57 3.1 Đa dạng nấm ký sinh côn trùng phân lập từ mẫu thu Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn quốc gia Xuân Sơn 57 3.1.1 Kết phân lập nghiên cứu đặc điểm nấm ký sinh côn trùng Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn quốc gia Xuân Sơn 57 iv 3.1.2 Một số nhận xét đa dạng chủng nấm ký sinh côn trùng Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn quốc gia Xuân Sơn 85 3.2 Khả sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập 87 3.3 Định loại chủng nấm CPA14V đặc điểm hình thái sinh học phân tử .91 3.3.1 Đặc điểm hình thái chủng nấm CPA14V 91 3.3.2 Định loại chủng nấm CPA14V phương pháp sinh học phân tử 93 3.4 Nghiên cứu môi trường điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide chủng nấm C cateniannulata CPA14V 99 3.4.1 Lựa chọn môi trường lên men sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide .99 3.4.2 Ảnh hưởng độ pH môi trường đến sinh trưởng khả sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide chủng C cateniannulata CPA14V .103 3.4.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng khả sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide chủng nấm C cateniannulata CPA14V 104 3.4.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh trưởng khả sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide chủng nấm C cateniannulata CPA14V .106 3.5 Nghiên cứu tách chiết, tinh xác định cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ C cateniannulata CPA14V 108 3.5.1 Tách chiết tinh cyclooligomer depsipeptide từ C cateniannulata CPA14V quy mơ phịng thí nghiệm 108 3.5.2 Xác định cấu trúc hóa học cyclooligomer depsipeptide 114 3.6 Nghiên cứu khảo sát số hoạt tính sinh học cao chiết tổng, phân đoạn chất beauvericin chủng nấm C cateniannulata CPA14V 122 3.6.1 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro .122 3.6.2 Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa 124 3.6.3 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 125 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 128 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 130 TÀI LIỆU THAM KHẢO 131 PHỤ LỤC I v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN: ARN: CDW: COD: CzD: EDTA: FDM: HPLC: IC50: KBTTN: MIC: MM: NCBI: NMR: NRPSs PBG: TLC: TSB: SBR: SDB: UV: VQG: Acid deoxyribonucleotide Acid ribonucleotide (Cell dry weight): Sinh khối khô Cyclooligomer depsipeptide Môi trường Czapek – Dox Ethylendiamin Tetra Acetic Acid Môi trường xác định Fusarium (High Performance Liquid Chromatography): Sắc kí lỏng hiệu cao áp (Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế 50% Khu bảo tồn thiên nhiên (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu Môi trường khoáng tối thiểu National Center for Biotechnology Information (Nuclear Magnetic Resonance): Quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân Nonribosomal peptide synthetases Môi trường dịch chiết khoai tây (Thin Layer Chromatography): Sắc kí mỏng Trypcase Soya Broth Mơi trường Sabouraud Sabouraud Dextrose Broth (Untraviolet and Vissible Spectra): Tia tử ngoại Vườn quốc gia vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số cyclooligomer depsipeptide (COD) phổ biến nấm 11 Bảng 1.2 Khả ức chế sinh trưởng tế bào ung thư số COD 15 Bảng 1.3 Khả kháng khuẩn beauvericin 17 Bảng 1.4 Thành phần số loài thuộc chi Beauveria, Fusarium Isaria sinh tổng hợp COD 19 Bảng 2.1 Môi trường lên men thu nhận COD 43 Bảng 2.2 Các trình tự sử dụng để xây dựng phát sinh loài ba vùng gen ITS, LSU, Rpb1 51 Bảng 2.3 Phương pháp thực nghiệm khảo sát thí nghiệm sau khảo sát tách chiết, tinh COD 53 Bảng 3.1 Thành phần nấm ký sinh côn trùng phân lập 84 Bảng 3.2 Khả sinh tổng hợp COD chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập khu vực nghiên cứu 88 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR CC1 tài liệu tham khảo 120 Bảng 3.4 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro cao chiết beauvericin từ chủng nấm C cateniannulata CPA14V 124 Bảng 3.5 Hoạt tính chống oxi hóa in vitro cao chiết beauvericin từ chủng nấm C cateniannulata CPA14V 125 Bảng 3.6 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định in vitro cao chiết beauvericin từ chủng nấm C cateniannulata CPA14V 126 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc số loại cyclooligomer depsipeptide Hình 1.2 Cấu trúc chung liên kết este nhóm carboxyl C-terminus α- hydroxy acid, ß-hydroxy acid hydroxy- acid chuỗi dài .10 Hình 1.3 Cấu trúc Pseudoxylallemycin .12 Hình 1.4 Cấu trúc số diketomorpholine .13 Hình 1.5 Sinh tổng hợp COD 25 Hình 1.6 Con đường sinh tổng hợp beauvericin 30 Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn xác định COD tích lũy theo .56 Hình 3.1 Hình thái mẫu CPA1 58 Hình 3.2 Hình thái mẫu CPA3 59 Hình 3.3 Hình thái mẫu CPA5 60 Hình 3.4 Hình thái mẫu CPA13V 61 Hình 3.5 Hình thái mẫu CPA14V 62 Hình 3.6 Hình thái mẫu CPA15 63 Hình 3.7 Hình thái mẫu CPA16 64 Hình 3.8 Hình thái mẫu CPA31 64 Hình 3.9 Hình thái mẫu CPA40 65 Hình 3.10 Hình thái mẫu CPA44 66 Hình 3.11 Hình thái mẫu XS01 67 Hình 3.12 Hình thái mẫu XS07 68 Hình 3.13 Hình thái mẫu XS12 69 Hình 3.14 Hình thái mẫu XS36 70 Hình 3.15 Hình thái mẫu XS37 71 Hình 3.16 Hình thái mẫu XS38 72 Hình 3.17 Hình thái mẫu XS57 73 Hình 3.18 Hình thái mẫu XS65 74 Hình 3.19 Hình thái mẫu XS66 75 Hình 3.20 Hình thái mẫu XS67 76 Hình 3.21 Hình thái mẫu XS69 77 Hình 3.22 Hình thái mẫu XS71 78 Hình 3.23 Hình thái mẫu XS77 79 Hình 3.24 Hình thái mẫu XS83 80 Hình 3.25 Mối quan hệ phát sinh chủng loại chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập khu vực nghiên cứu 82 Hình 3.26 Sắc ký đồ HPLC UV 203 nm chất chuẩn (A) 90 Hình 3.27 Đặc điểm hình thái chủng Cordyceps sp CPA14V 92 Hình 3.28 Kết xây dựng phát sinh loài dựa vùng gen 94 Hình 3.29 Kết xây dựng phát sinh loài dựa vùng gen LSU 97 Hình 3.30 Kết xây dựng phát sinh loài dựa vùng gen ITS1-5.8S rDNAITS2, LSU Rpb1 98 Hình 3.31 Khả sinh trưởng sinh tổng hợp COD chủng nấm C cateniannulata CPA14V 05 loại môi trường nghiên cứu 100 viii Hình 3.32 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng sinh tổng hợp COD chủng C cateniannulata CPA14V 103 Hình 3.33 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp COD chủng C cateniannulata CPA14V 105 Hình 3.34 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp COD chủng C cateniannulata CPA14V 107 Hình 3.35 Quy trình thu nhận COD (CC1) quy mơ phịng thí nghiệm 111 Hình 3.36 Ảnh hưởng dung môi chiết đến hàm lượng CC1 112 Hình 3.37 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng CC1 113 Hình 3.38 Ảnh hưởng thời gian siêu âm đến hàm lượng CC1 113 Hình 3.39 Phổ LC/MS Q-TOF CC1 114 Hình 3.40 Phổ 1H-NMR CC1 115 Hình 3.41 Phổ 13C-NMR, phổ DEPT, phổ HSQC CC1 117 Hình 3.42 Phổ COSY, phổ NOESY phổ HMBC CC1 119 Hình 3.43 Cấu trúc hóa học, tương tác 1H-1H COSY HMBC (H→C) CC1 121 XXXV XXXVI XXXVII XXXVIII XXXIX XL XLI XLII XLIII XLIV XLV XLVI XLVII XLVIII XLIX ... nấm ký sinh trùng Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn quốc gia Xuân Sơn, lựa chọn nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu đa dạng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide nấm ký sinh côn trùng Khu bảo tồn. .. ký sinh côn trùng Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn quốc gia Xuân Sơn 57 iv 3.1.2 Một số nhận xét đa dạng chủng nấm ký sinh côn trùng Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn quốc gia Xuân. .. dụng cao, đa dạng nấm ký sinh trùng sinh COD ln hướng nghiên cứu bền vững, triển vọng tương lai Việc nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng sinh COD Khu bảo tồn thiên nhiên Copia Vườn Quốc gia Xuân Sơn