TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12371-2-3:2019 QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT PHẦN 2-3: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI VI KHUẨN CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP MICHIGANENSIS (SMITH) DAVIS ET AL Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma Part 2-3: Particular requirements for Clavibacter michiganensis subsp michiganensis (Smith) Davis et al Lời nói đầu TCVN 12371-2-3: 2019 Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ cơng bố Bộ tiêu chuẩn TCVN 12371 Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật gồm phần sau: - Phần 1: Yêu cầu chung - Phần 2-1 : Yêu cầu cụ thể Plum pox virus - Phần 2-2 : Yêu cầu cụ thể vi khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al - Phần 2-3 : Yêu cầu cụ thể vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp michiganensis (Smith) Davis et al QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT PHẦN 2-3: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI VI KHUẨN CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP MICHIGANENSIS (SMITH) DAVIS ET AL Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma Part 2-3: Particular requirements for Clavibacter michiganensis subsp michiganensis (Smith) Davis et al Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn đưa yêu cầu quy trình giám định vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp michiganensis (Smith) Davis et al gây bệnh thực vật Tài liệu viện dẫn Tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 12371-1: 2019, Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật Phần 1: Yêu cầu chung Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thơng thường phịng thử nghiệm thiết bị sau: 3.1 Bình tam giác 3.2 Đĩa petri 3.3 Túi nilong 3.4 Máy chu trình nhiệt (PCR) Hóa chất Chỉ sử dụng hóa chất loại tinh khiết phân tích, trừ có quy định khác 4.1 Cồn 70 % 4.2 Nước cất vô trùng 4.3 Agarose Lấy mẫu bảo quản mẫu 5.1 Lấy mẫu Lấy mẫu theo TCVN 12371-1:2019 (điều 5.1) 5.2 Bảo quản mẫu Bảo quản mẫu giám định sau giám định sau: + Thân, cành, lá, quả, rễ bảo quản tươi, ép khô ngâm mẫu theo TCVN 12371-1: 2019 (điều 5.2.1.1) + Hạt theo TCVN 12371-1: 2019 (điều 5.2.1.2) Phát bệnh Trên lá, vết bệnh ban đầu đốm màu xanh nhợt có dạng giọt dầu phần phiến gân Các vết nhanh chóng khơ tạo vết chết hoại có màu trắng Khi bệnh từ phiến xâm nhiễm vào hệ thống mạch dẫn số chết phía kép bị héo rũ Trên thân cây, triệu chứng bệnh sọc vàng, thân bị nứt dọc theo đốt thân Bó mạch nhiễm bệnh có màu vàng sậm nâu Trên quả, triệu chứng thường đốm nhỏ lồi lên, vết bệnh có viền quầng trắng Các vết bệnh phát triển to có màu nâu tâm vết bệnh tạo dạng “mắt chim” Trên hạt, bệnh không biểu triệu chứng Khi kiểm tra lô hàng cần ý nước mà vi khuẩn có phân bố (xem phụ lục A) loài mà vi khuẩn gây hại (xem phụ lục A) Giám định bệnh 7.1 Giám định ELISA 7.1.1 Phân lập nuôi cấy làm môi trường nhân tạo Bước 1: Khử trùng bề mặt mẫu bệnh Phần mô nghi nhiễm bệnh (cành, thân, ) rửa vòi nước chảy Nhúng mẫu dung dịch cồn 70 % (4.1) 30 giây đến 60 giây tùy kích thước mẫu Bước 2: Tách chiết vi khuẩn Tách chiết vi khuẩn từ mô (lá, thân, quả): cắt đoạn mô khử trùng bề mặt ngâm 100 ml nước cất vô trùng 30 phút nghiền nhỏ mô 10 ml nước cất vô trùng (4.2) Tách chiết vi khuẩn từ hạt: Hạt cho vào bình tam giác (3.1) có chứa 20 ml dịch chiết hạt (xem phụ lục D) lắc mạnh tay 20 đến 30 giây Sau đó, đưa bình tam giác (3.1) có dịch chiết hạt lên máy lắc lắc 36 đến 48 với tốc độ 150 vòng/phút Bước 3: Phân lập Trang ml dịch chiết thu môi trường NGA (Nutrient Glucose Agar) (xem phụ lục B) YPGA (Yeast Peptone Glucose Agar) (xem phụ lục B) chứa đĩa petri (3.2) Đặt đĩa petri nhiệt độ 26 °C ngày Bước 4: Nuôi cấy làm Chọn khuẩn lạc vàng sáng, có bóng mờ, có rìa trịn cấy truyền sang đĩa có mơi trường đặc hiệu Đặt đĩa petri nhiệt độ 26 °C ngày 7.1.2 Chuẩn bị dịch mẫu Có thể chuẩn bị dịch mẫu từ mô bệnh từ khuẩn lạc nuôi cấy làm vi khuẩn - Mẫu mô (quả, thân, lá): lấy mẫu nhỏ mô (quả thân lá) ngâm ml nước cất khoảng 15 đến 20 phút Sau nước chứa vi khuẩn ly tâm 13 000 vòng/phút phút thu kết tủa vi khuẩn Hòa tan kết tủa vi khuẩn thu ml dung dịch đệm chiết mẫu - Khuẩn lạc nuôi cấy làm vi khuẩn: Hòa tan phần khuẩn lạc (xem 7.1.1) ml dung dịch đệm chiết mẫu 7.1.3 Quy trình thực ELISA Bước 1: Nhỏ vào giếng ELISA 100 µl dịch mẫu (xem 7.1.2) chuẩn bị Bước 2: Bọc giếng túi ni-lông (3.3) ủ 37°C qua đêm (khoảng đến giờ) Bước 3: Sau đó, nhỏ thêm vào giếng 200 µl dung dịch đệm cố định mẫu Bước 4: Bọc giếng túi ni-lơng (3.3) ủ 30 phút nhiệt độ phịng Bước 5: Rửa giếng đệm rửa ba lần sau loại đệm rửa cách vỗ nhẹ giếng giấy thấm Bước 6: Thêm vào giếng 100 µl kháng thể Bước 7: Bọc giếng túi ni-lơng (3.3) ủ nhiệt độ phịng Bước 8: Rửa giếng đệm rửa tám lần sau loại đệm rửa cách vỗ nhẹ giếng giấy thấm Bước 9: Thêm vào giếng 100 µl Enzym gắn Bước 10: Bọc giếng túi ni-lơng ủ nhiệt độ phịng Bước 11: Rửa giếng đệm rửa tám lần sau loại đệm rửa cách vỗ nhẹ giếng giấy thấm Bước 12: Thêm vào giếng 100 µl đệm chất Ủ nhiệt độ phòng 7.1.4 Đọc kết quả: Đọc kết mắt thường máy đọc bước sóng 405 nm 7.2 Giám định PCR 7.2.1 Phân lập nuôi cấy làm môi trường nhân tạo Thực theo điều 7.1.1 7.2.2 Tách chiết DNA Thực theo điều 7.1.3.2 TCVN 12371-1: 2019 7.2.3 Nhân gen Đoạn mồi sử dụng PSA-4: 5'-TCA TTG GTC AAT TCT GTC TCC C -3' PSA-R: 5'-TAC TGA GAT GTT TCA CTT CCC C -3' Chu trình nhiệt: 94 °C 2,5 phút 94 °C 30 giây 63 °C 20 giây Lặp lại 30 chu kì 72 °C 45 giây 72 °C 10 phút 7.2.4 Đọc kết Sản phẩm điện di gel agarose % (4.3) Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước 270 bp 7.3 Kết luận Mẫu giám định kết luận loài Clavibacter michiganensis subsp michiganensis (Smith) Davis et al khi: - Phương pháp ELISA cho kết dương tính - Phương pháp PCR cho kết dương tính Báo cáo kết Nội dung phiếu kết giám định gồm thông tin sau: - Thơng tin mẫu giám định - Tên lồi - Phương pháp giám định - Người giám định/cơ quan giám định Phiếu giám định chi tiết tham khảo phụ lục B Phụ lục A (Tham khảo) Thông tin chung A.1 Tên khoa học vị trí phân loại Tên tiếng Việt: Bệnh thối loét cà chua Tên khoa học: Clavibacter michiganensis subsp michiganensis (Smith) Davis et al Tên khác: Corynebacterium michiganense pv michiganense (Smith) Dye & Kemp Corynebacterium michiganense (Smith) Jensen Vị trí phân loại: Lớp: Actinobacteria Bộ: Actinomycetales Họ: Microbacteriaceae Giống: Clavibacter A.2 Phân bố Trong nước: Bệnh chưa có Việt Nam Trên giới: Châu Á: Israel, Turkey, Armenia, Azerbaijan, China, India, Indonesia, Iran; Japan, Korea, Syria, Lebanon, Thailand; Châu Phi: South Africa, Egypt, Kenya, Madagascar, Togo, Uganda, Zambia, Morocco, Tanzania; Tunisia; Zimbabwe, Republic of the Congo; Châu Mỹ: Canada, USA, Mexico, Uruguay, Belize, Costa Rica, Cuba, Dominica, Dominican Republic, Grenada; Guadeloupe, Martinique, Panama; Argentina, Brazil, Colombia, Peru, Chile, Ecuador; Châu Âu: France, Greece, Rusian Federation, Switzeland, Czech, Lithuania, Netherland, Belarus, Poland, Romania, Belgum, Bulgaria, Cyprus, Finland, Germany, Hungary, Italy, Ukraine; Châu Đại Dương: Australia, Fiji, Guam, New Caledonia, New Zealand, Tonga A.3 Ký chủ Solanum lycopersicum (Cà chua), Capsicum annuum (ớt), Solanum nigrum (lu lu đực) A.4 Đặc điểm sinh học Nguồn lây nhiễm cà chua thường từ hạt bị nhiễm Bệnh lây lan cho khác hoạt động cắt tỉa đóng gói để trồng; buộc cây, uốn cho leo giàn; ngắt lá, ngắt chồi bên buộc nhà kính, nói chung nước mưa, tưới phun phun chất hóa học Bó mạch bị xâm nhiễm dẫn tới bị cịi cọc, héo làm chết non Mặc dù quần thể vi khuẩn gây bệnh thối loét cà chua giảm nhanh tàn dư thực vật phân hủy đất chúng có khả tồn lâu dài tàn dư chưa bị phân hủy mặt đất nguồn lây nhiễm cho trồng vụ sau Vi khuẩn gây bệnh thối loét cà chua cịn tồn cà chua dại kí chủ khác trở thành nguồn truyền lan bệnh Trên đồng ruộng, vi khuẩn gây bệnh thối loét cà chua lây truyền cạnh nước, hoạt động máy móc giới hoạt động canh tác người làm đất làm cho rìa chết hoại bị đốm Vi khuẩn gây bệnh thối loét cà chua tồn dạng hoại sinh bề mặt cà chua Bệnh gây héo giảm suất Các cà chua non mẫn cảm với bệnh giai đoạn khác Trong điều kiện tự nhiên cà chua cảm nhiễm với bệnh suốt thời kì sinh trưởng Sự khác thời gian ủ bệnh trước triệu chứng bệnh xuất phụ thuộc vào tuổi cây, mức độ kháng, nhiệt độ nồng độ xâm nhiễm Khi điều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển triệu chứng biểu nặng Vi khuẩn tập trung mạch gỗ gây vết nứt Các bó mạch nhiễm bệnh chứa hạt nhớt, vết chai khối vi khuẩn Phụ lục B (Tham khảo) Mẫu phiếu kết giám định Cơ quan giám định ………………………… CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc …………, ngày … tháng … năm 20… PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH Tên hàng hóa: Nước xuất khẩu: Xuất xứ: Phương tiện vận chuyển: Khối lượng: Địa điểm lấy mẫu: Ngày lấy mẫu: Người lấy mẫu: Tình trạng mẫu: Ký hiệu mẫu: 10 Số mẫu lưu: 11 Người giám định: 12 Phương pháp giám định: Theo TCVN 12371-2-3: 2019 “Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp michiganensis (Smith) Davis et al” 13 Kết giám định: Tên tiếng việt: Bệnh thối loét cà chua Tên khoa học: Clavibacter michiganensis subsp michiganensis (Smith) Davis et al Vị trí phân loại: Lớp: Actinobacteria Bộ: Actinomycetales Họ: Microbacteriaceae Giống: Clavibacter TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT (hoặc người giám định) (ký, ghi rõ họ tên) THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ (ký, ghi rõ họ tên, đóng dấu) Thư mục tài liệu tham khảo [1] Bradbury J F, 1986 Guide to Plant Pathogenic Bacteria, C.A.B International, United Kingdom [2] CABI, (2017), Crop Protection Compedium [3] Commonwealth Mycologycal Institute, (1983), Plant Pathologist’s Pocketbook [4] IPPC, (2006), ISPM 27 Diagnostic protocols for regulated pests [5] J.M.waller, M.Bigger and R.A.Hillocks, 2007, Coffee pests, diseases & their management, CAB international [6] TCVN 8597: 2010, Kiểm dịch thực vật - Phương pháp luận việc lấy mẫu chuyến hàng [7] Viện Bảo vệ thực vật, (1997), Tập 1: Phương pháp điều tra dịch hại nông nghiệp thiên địch chúng, Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp