Đang tải... (xem toàn văn)
Graphene và họ graphene gần đây được nghiên cứu rộng rãi như một vật liệu sinh học lý tưởng cho các ứng dụng kỹ thuật mô và vận chuyển thuốc. Tìm ra một phương pháp khả thi để tẩm và kiểm soát phóng thích các hạt nano-graphene oxide (GO) từ màng liên kết chéo genipin - gelatin ứng dụng làm gạc vết thương kháng khuẩn.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 KIỂM SOÁT PHĨNG THÍCH NANO-GRAPHENE OXIDE ỨNG DỤNG TIỀM NĂNG CHO CÁC BĂNG GẠC KHÁNG KHUẨN Nguyễn Trung Hiếu1, Er-Yuan Chuang2 TÓM TẮT Đặt vấn đề: Graphene họ graphene gần nghiên cứu rộng rãi vật liệu sinh học lý tưởng cho ứng dụng kỹ thuật mô vận chuyển thuốc Nhờ đặc tính sinh học tuyệt vời mà chúng khắc phục hạn chế giải pháp dùng gạc vết thương dựa hydrogel đáp ứng yêu cầu chữa lành vết thương mãn tính gạc kháng khuẩn Mục tiêu: Tìm phương pháp khả thi để tẩm kiểm sốt phóng thích hạt nano-graphene oxide (GO) từ màng liên kết chéo genipin - gelatin ứng dụng làm gạc vết thương kháng khuẩn Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Dung dịch tiền gel gelatin – GO pha nồng độ định trước gel hóa nồng độ genipin (Gp) khác Sản phẩm nano gel tạo đánh giá khả hấp thụ nước, tỷ lệ thoát nước, nghiên cứu in vitro khả tương thích sinh học, kháng khuẩn, chữa lành vết thương Bên cạnh đó, khả giải phóng GO với tốc độ phân hủy nano gel nghiên cứu kỹ lưỡng cho ứng dụng tiềm băng gạc kháng khuẩn Kết quả: Các nano gel tạo có khả kiểm sốt phóng thích GO tùy thuộc vào nồng độ Gp nồng độ enzym mô mơi trường vết thương Ngồi ra, hạt GO phóng thích từ nano gel có hoạt tính kháng khuẩn chống lại Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa thông qua cạnh sắc chế bao bọc GO, đồng thời thúc đẩy lấp đầy nguyên bào sợi người thuận lợi cho trình liền vết thương mạn tính Kết luận: Chúng tơi tin việc kết hợp nano GO vào gelatin gel hóa Gp chiến lược khả thi để phát triển băng gạc vết thương đa chức cho u cầu chữa lành vết thương mãn tính Từ khóa: gạc kháng khuẩn, genipin, hydrogel, nano-graphene oxide, vết thương ABSTRACT CONTROLLED RELEASE OF NANO-GRAPHENE OXIDE FOR POTENTIAL APPLICATION AS ANTIBACTERIAL WOUND DRESSINGS Nguyen Trung Hieu, Er-Yuan Chuang * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 26 - No - 2022: 227-234 Background: Graphene and graphene-family have recently emerged as a shining star in biomaterials for tissue engineering and drug carrier applications due to their excellent properties, which could overcome the limitations of current hydrogel – based strategies and fulfill the requirements of antibacterial dressings for chronic wound healing Objective: To develop a feasible method to impregnate GO into genipin - crosslinked gelatin and control the GO particles released from nanocomposite hydrogel for application as antibacterial wound dressings Methods: GGO pre-hydrogel was crosslinked by different genipin (Gp) concentrations The obtained nanocomposite hydrogels were evaluated by water absorption capacity, the in vitro studies of Bộ môn Chấn Thương Chỉnh Hình, Khoa Y, Đại học Y Dược TP HCM Khoa Kỹ Thuật Y Sinh, Đại Học Y Khoa Đ|i Bắc, Đ|i Bắc, Đ|i Loan Tác giả liên lạc: TS.BS Nguyễn Trung Hiếu ĐT: 0909274971 Email: bshieundgd@gmail.com Chuyên Đề Ngoại Khoa 227 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 Nghiên cứu Y học biocompatibility, antibacterial, wound healing Furthermore, the GO release kinetics in accordance with the degradation rate of nanocomposite hydrogels were thoroughly investigated to estimate the potential application as chronic wound dressings Results: The GO release kinetics were depended on the crosslinking degrees and enzymatic levels following degradation rates Most importantly, the released GO particles displayed uniformity and dispersity, retained the antibacterial activity against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa via their sharp edges and wrapping mechanisms, and promoted human fibroblasts migration Conclusion: We highly believe that the incorporation of GO into genipin crosslinked gelatin hydrogels will be a feasible strategy to develop a multifunctional wound dressing for the requirements of chronic wound healing Keywords: antibacterial, genipin, hydrogel, nano-graphene oxide, wound healing gồm ứng suất oxy hóa hóa học, hiệu ứng dao ĐẶT VẤN ĐỀ nano sắc bén mặt vật lý, tế b|o bao Vết thương mạn tính vết thương bọc học chiết xuất lipid tạo điều kiện khơng tiến triển qua c{c giai đoạn bình thường thuận lợi cho việc khỏi trì hỗn q trình lành vết thương cách có trật tự phát triển vi sinh vật kháng GO(2) v| thời gian Có bốn giai đoạn liên tục Dựa tất c{c đặc điểm tích cực GO chồng lấp trình lành vết thương hướng tới việc chữa lành vết thương mãn bình thường gồm giai đoạn cầm m{u, viêm, tăng tính khiến trở thành ứng viên tiềm sinh tái tạo Bất kỳ rối loạn n|o viêm kéo để kết hợp v|o băng gạc vết thương Cho đến dài mức, tăng sinh v| di trú tế bào nay, chưa có nghiên cứu n|o liên quan đến khơng đủ, q trình hình thành mạch bị gián động học hoạt tính sinh học GO giải đoạn nhiễm trùng dai dẳng ảnh phóng cách có kiểm soát từ nano gel tổng hưởng đến lành vết thương v| chuyển thành hợp gelatin - genipin tương ứng với nồng độ vết thương mạn tính Hậu dẫn đến enzym chỗ dịch tiết vết thương cắt cụt chi, nặng thêm bệnh tật tử vong Theo ĐỐI TƢỢNG- PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU báo cáo Trengove cộng sự, mức metalloproteinase (MMP) vết thương mãn Chế tạo nano gel tính cao 30 lần so với vết thương cấp tính Bột gelatin khuấy hòa tan nước (lần lượt 22,8 µg/ml so với 0,76 µg/ml)(1,2) cất 100 vịng/phút, 60°C 60 phút để thu Cho đến chưa có phương ph{p điều trị tối ưu cho c{c vết thương mãn tính khơng lành Trong số chất nano kháng khuẩn, nano bạc có mặt thị trường chăm sóc vết thương v| đạt số thành công mặt lâm sàng Tuy nhiên, hạt nano bạc khơng phải giải pháp hồn hảo việc thay thuốc kháng sinh lo ngại độc tính người v| dễ gây phát triển dòng vi sinh vật kháng bạc Do đó, c{c nanocarbon kháng khuẩn, đặc biệt l| GO thu hút nhiều ý nhà nghiên cứu tính tương hợp sinh học tốt, hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng kháng màng sinh học vi khuẩn(3) C{c chế kháng khuẩn đặc biệt GO bao 228 dung dịch m|u v|ng đồng Dung dịch GO chuẩn bị cách khuấy mạnh bột GO với nước cất 30 phút Sau đó, dung dịch GO l|m cho ph}n t{n đồng sóng siêu }m (Elmasonic P, Đức) 15 phút 37°C Tiếp theo, nhỏ giọt dung dịch GO vào dung dịch gelatin tiếp tục khuấy mạnh 60°C 60 phút Để gel hóa genipin (Gp) v| thu nano gel (3G), bột Gp hịa tan dung mơi etanol nhỏ giọt vào dung dịch gelatin-GO khuấy tiếp phút Đo pH v| điều chỉnh đạt pH sinh lý từ 7,2 ~ 7,4 dung dịch HCl Lấy 500 µL dung dịch tiền gel cho vào giếng đĩa 24 giếng ủ 37°C gel hóa C{c nano gel liên kết chéo Chuyên Đề Ngoại Khoa Nghiên cứu Y học Gp 48 nhiệt độ phịng Sau chúng rửa khử khuẩn etanol 70% 30 phút, rửa lại ba lần PBS để làm etanol Nhóm chứng nghiên cứu dùng gel gelatin - Gp (2Gpx) chế tạo phương ph{p Gelatin cho to|n nghiên cứu cố định w/v% Nồng độ thành phần kh{c c{c nano gel kh{c viết tắt l| 3Gpx (px đại diện cho nồng độ Gp dao động từ 0,1 ~ 3% trọng lượng với nồng độ GO cố định 1% trọng lượng) v| 3GOy (Oy đại diện cho nồng độ GO dao động từ 0,5 ~ 2% trọng lượng với nồng độ Gp cố định 1% trọng lượng)(2) Độ hấp thu nƣớc nano gel (SR) Các mẫu đông khô 2Gp1, 3Gpx v| 3GOy, cân trước, ngâm PBS (pH 7,4) 37°C Qua mốc thời gian, mẫu vớt ra, l|m r{o nước giấy thấm cân lại SR tính theo công thức sau: SR (%) = [(Wt - W0) / W0] × 100; Trong Wt v| W0 trọng lượng c}n theo mốc thời gian trọng lượng ban đầu mẫu Thí nghiệm lặp lại ba lần (n=3)(2) Tỷ lệ thoát nƣớc (WVTR) WVTR x{c định cách sử dụng lọ thủy tinh (đường kính 16 mm) chứa nước cất, đậy nắp gel thử nghiệm 2Gp1 3Gp1 (n=3) Các lọ không đậy nắp sử dụng làm nhóm chứng Tất lọ đặt tủ ủ 37ºC v| độ ẩm 95% WVTR ước tính trọng lượng nước qua đơn vị diện tích gel thử nghiệm 24 (2) Độ tan nano gel môi trƣờng men Để mô độ tan gel môi trường men dịch vết thương, c{c mẫu đông khô 2Gp1 v| 3Gpx x{c định trọng lượng, cho ngâm dung dịch thể mơ có chứa collagenase (SBF, pH 7,4) nồng độ kh{c l| 2, 10 v| 20 µg/ml, v| ủ 37°C Môi trường enzym làm ngày Ở khoảng thời gian x{c định, mẫu Chuyên Đề Ngoại Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 lấy v| đông khô 48 cân lại Độ tan nano gel môi trường men thể qua phần trọng lượng lại (WR) gel tính theo cơng thức sau: WR (%) = [(Wi - Wt) / Wi] × 100; Trong Wi v| Wt trọng lượng ban đầu trọng lượng quan s{t mẫu thời điểm t Thí nghiệm lặp lại ba lần (n=3)(2) Giải phóng GO từ nano gel Chất dịch từ mẫu 3Gpx bị tan môi trường men quay ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút để thu lại c{c GO phóng thích Sau ly t}m, GO phóng thích hịa tan lại PBS v| đo mật độ quang (OD) bước sóng 230 nm máy quang phổ V-770 UV-Visible/NIR (Jasco, ST, USA) (n=3) Các nồng độ x{c định trước GO PBS đo OD để thiết lập đường cong chuẩn(4) Hoạt tính kháng khuẩn GO đƣợc giải phóng từ nano gel Hoạt tính kháng khuẩn GO giải phóng từ nano gel chống lại vi khuẩn S aureus (BCRC10781) P aeruginosa (BCRC11864) đ{nh gi{ thí nghiệm đo mật độ quang vi khuẩn OD600 v| đếm khuẩn lạc (CFU) Cấy 500 µL dung dịch vi khuẩn (OD600: 0,07) với nồng độ GO kh{c giải phóng từ nano gel giếng đĩa 24 giếng Đĩa ủ máy lắc 50 vòng/phút 37°C 24 Nhóm đối chứng dung dịch vi khuẩn khơng có GO Sau 24 ủ, dung dịch vi khuẩn giếng đo gi{ trị OD600 v| pha loãng với nước muối 0,85% rối lấy 100 µL trải lên c{c đĩa thạch LB Các khuẩn lạc vi khuẩn ghi lại v| đếm sau ủ 37°C 18 Các thử nghiệm kháng khuẩn lặp lại ba lần (n=3)(5) Kính hiển vi điện tử quét SEM thực để hiểu thêm thay đổi hình thái vi khuẩn tiếp xúc với GO giải phóng từ nano gel Sau cấy với GO, dung dịch vi khuẩn ly tâm hai lần với PBS tốc 229 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 Nghiên cứu Y học độ 6000 vịng/phút phút để loại bỏ hồn tồn môi trường Cố định vi khuẩn dung dịch formalin 10% qua đêm v| sau khử nước loạt dung dịch etanol (30% ~ 95%) Cuối cùng, lấy mẫu giọt nhỏ lên lam kính v| để khơ nhiệt độ phịng phủ lại lớp bột vàng Hình thái vi khuẩn có khơng tương t{c với GO quan sát kính hiển vi S-3500 SEM(5) Thử nghiệm lành vết thƣơng ống nghiệm Tế bào nguyên bào sợi người (CG1475, BCRC, Đ|i Loan) cấy đĩa 12 giếng mật độ x 104 tế bào/giếng Sau 24 ủ, sử dụng đầu pipet 200 µL vơ trùng tạo vết xước trung tâm giếng rửa tế bào chết PBS Các mẫu gel 2Gp1 3GO1 đặt vào giếng ủ với tế bào mơi trường ni cấy có chứa µg/ml collagenase (mơ dịch tiết vết thương bình thường) Mức độ liền kín vết xước tế bào 0, 12 24 ghi lại kính hiển vi Tỷ lệ đóng vết xước 12 so với vết xước x{c đinh tỷ lệ di chuyển tế bào(4) Phân tích thống kê Dữ liệu trình b|y dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) So s{nh nhóm thực phép kiểm Student’s t không ghép đôi cho hai nhóm v| ph}n tích phương sai chiều (ANOVA) cho hai nhóm, phép kiểm Tukey Sự khác biệt kết coi khơng có ý nghĩa (ns) v| có ý nghĩa thống kê với p