Bài 4

Bài :TINH SẠCH BROMENLAIN BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL I Cơ sở lý thuyết Bromelin tên gọi chung cho enzyme phân giải protein chứa nhóm sulfhydryl tách chiết chủ yếu từ mô thực vật thuộc họ Bromeliaceae, tiêu biểu dứa Hai loại bromelin công nhận bromelin tách chiết từ thân ( stemvbromelin – SBM –EC 3.4.22.32 ) từ trái ( fruit bromelin – FMB – EC 3.4.22.33 ) Ngoài ra, bromelin cịn tách chiết từ phụ phẩm dứa vỏ, lõi, lá, chồi (Ketnawa,2011) Bromelin tách chiết từ thân có trọng lượng phân tử khoảng 26- 37 kDa, hoạt động tốt khoảng pH tối ưu 6-7 khoảng nhiệt độ tối ưu 50-60 0C Trong đó, bromelin tách chiết từ trái có trọng lượng phân tử khoảng 24,5- 32 kDa, hoạt động tốt khoảng pH tối ưu 3-8 khoảng nhiệt độ tối ưu 37-700C Tuy nhiên, số nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử bromelin có chênh lệch nhỏ, bromelin phân tử khoảng 23,4-35,73 kDa, tái khoảng 31kDa, dứa cịn có loại protease khác ananain (23,42-23,43 kDa), cososain (23,56-24,51 kDa) Điểm đẳng điện bromelin thân trái pH = 9,5 4,6 Bromelin bảo quản -200C giữ nguyên hoạt tính thời gian định Bromelin tách chiết từ dứa cách nghiền nhuyễn, xay, ly tâm loại bỏ mảnh vỡ tế bào Sau đó, dịch enzyme thô tinh nhiều phương pháp khác kết tủa, trích ly hai pha lỏng, lọc màng, hệ thống micelle ngược ( reverse micellar system ), kỹ thuật sắc kí Với hoạt tính phân giải protein tốt, bromelin ứng dụng thương mại rộng rãi công nghiệp thực phẩm đồ uống, làm mềm thịt, mỹ phẩm dệt may Bên cạnh đó, bromelin nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trị liệu khả ức chế ngưng tụ tiểu huyết cầu, chống phù nề, chống huyết khối tiêu sợ huyết, kháng viêm, chống hoạt động khối u, tăng cường hấp thu loại thuốc, hỗ trợ tiêu hóa,tăng cường làm lành vết thương, II Nội dung thực hành Nguyên liệu - Chọn dứa chín vừa, tươi, rửa sạch, để khơ - Cân 1kg vỏ, lít nước xay máy sinh tố - Lấy khăn sữa em bé lọc lấy dung dịch Thẩm tích: Mục đích: loại muối (NH4)2SO4 khỏi dịch tủa protein Cách tiến hành: - Hút dịch enzyme cho vào túi thẩm tích, kép chặt hai đầu túi Treo túi thẩm tích chứa dịch enzyme ngập cốc 1000ml lạnh chứa - nước cất Thực thẩm tích: đặt cốc trêm máy khuấy từ nhiệt độ 040C Cứ sau 30 phút, thay nước cất, đồng thời hút 500μl dịch cốc cho vào 200μl BaCl2 5%, quan sát tượng kết tủa để kết thúc q trình thẩm tích (thịi ểm không tạo kết tủa) Sắc ký lọc gel: Mục đích: loại bỏ protein tạp dịch kết tủa protein  Cách tiến hành: 3.1 Nguyên tắc Kỹ thuật lọc gel Sephadex dùng để tách phân tử có kích th ước trọng lượng phân tử khác cách cho chúng qua cột gel Những phân tử có kích thước đủ nhỏ lọt vào bên lỗ gel bị trì hỗn di chuyển chậm qua cột, phân tử lớn nằm kẹt kẽ hở hạt gel di chuy ển nhanh giải phóng khỏi cột sớm phân tử nhỏ 3.2 Dụng cụ hóa chất Dụng cụ Cột gel sephadex Ống nghiệm (được tẩy trùng sulfo-cromic sấy khơ) Hóa chất Dung dịch NaN3 0,02% Gel Sephadex G50: cân lượng gel khơ thích hợp (1g gel khơ nở khoảng 12-15ml) ngâm 500 ml NaN3 0,02% 2h để gel trương nở hồn tồn sau nhồi vào cột Dung dịch đệm phosphate pH 7,6: trộn 1770 ml dung dịch Na2 HPO4 1/15M 230 ml dung dịch KH2PO4 1/15M Đo chỉnh lại pH cho 3.3 Tiến hành thí nghiệm Cân 1g gel G50 bỏ vào cột sắc kí Pha NaN3 0,02 % ( cân 1g pha thành 50 ml) Cho gel vào cột sắc kí đổ NaN3 vào ngâm gel 3.4 Chuẩn bị cột Rửa cột HNO3 50% rửa lại nước cất nhiều lần, tráng aceton, để khô Cho vào đáy cột lớp bơng gịn thủy tinh lớp giấy lọc bên để tạo mặt phằng 3.5 Nhồi gel vào cột Đóng khóa cột Dùng becher cho từ từ dung dịch gel ngâm NANO3 0,02% vào cột Gel cho vào cột phải liên tục tránh tượng phân lớp Khi gel cao 10cm mở khóa từ từ lượng nước dư gel chảy bớt Tiếp tục nhồi cột lớp gel cao khoảng 4/5 chiều dài cột Sau nhồi cột xong, cắt miếng giấy lọc đặt lên mặt gel nhằm tránh tượng xáo trộn bề mặt gel cho mẫu vào cột Cho dung dịch đệm(pH=7,6) vào để chạy ổn định cột 15-20 phút Chỉnh tốc độ dòng khoảng 3ml/9phút 3.6 Nạp mẫu vào cột Chọn mẫu Bromelain thu phần I có hoạt tính riêng cao để tiếp tục tinh qua cột gel Sephadex, trước nạp vào cột chỉnh lại nồng độ protein cho thích hợp khoảng 1- 1,5mg/ml Hút 0,5ml dịch Bromelain cho vào cột theo hai cách: Cách 1: Đưa mẫu vào dịng dung mơi Tức đợi lớp dung dịch bên vừa chạm mặt gel, ta dùng pipet cho lượng thể tích mẫu cần thiết vào cột Cách 2: Đợi lớp dung dịch bên vừa chạm bề mặt gel Khóa cột Cho lượng mẫu cần thiết vào cột Mở khóa cho dung dịch chạy tiếp 3.7 Thu mẫu Khi mẫu enzym vừa thấm hết vào bề mặt gel, cho dung dịch đệm liên tục vào cột gel để rửa giải Dịch rửa giải bên hứng vào ống nghiệm Hứng ống nghiệm, ống 3ml Đem xác định hàm lượng protein theo phương pháp Braford hoạt tính Bromelain theo phương pháp Anson Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford: Bảng 1: chuẩn bị ống nghiệm xây dựng đường chuẩn Các ống nghiệm Hóa chất Đơn vị Ống Ống Ống Ống Ống Ống Albumin 0,01% Ml 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Nước cất Ml 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 Nồng độ Albumin mg/ml 10 20 30 40 50 Thuốc thử Bradford ml Lắc Để yên 10 phút Đo độ hấp thụ bước sóng 595nm Chú ý: Ống ống kiểm chứng, ống khác ống thí nghiệm Xác định hoạt tính bromelain theo phương pháp Ansson cải tiến  Nguyên tắc: bromelin enzyme thuộc nhóm protease Khả thủy phân bromelin thực với chất protein (hemoglobin, casein, albumin) tạo sản phẩm tan dung dịch TCA peptide có chứa tyrosin Vi ệc định lượng tyrosin pahnr ứng maufvoiws thuốc thử Folin – Ciocalteu cho biết hoạt động thủy phân enzyme  Cách tiến hành Bảng 2: chuẩn bị ống nghiệm đo hoạt tính bromelain Hóa chất Đơn vị Các ống nghiệm ống ống ống tyrosin mẫu Dung dịch Hb 2% ml 2,5 2,5 Để yên 35,5 C phút Trichloacetic acid 5% ml 5,0 0,0 HCL 0,2N ml 0,0 0,5 Tyrosin 1/400N ml 0,5 0,0 Dịch enzyme bromelain ml 0,0 0,5 Lắc Để yên 35,5 C 10 phút Trichlororacetic acid ml 0,0 5,0 5% Dịch enzyme bromelain ml 0,5 0,0 Lắc Để yên 10 phút 25 C Lọc Dung dịch lọc ml 2,5 2,5 NaOH 0,5N ml 5,0 5,0 Thuốc thử Folin 1/3 ml 1,0 1,0 Lắc Để yên 15 phút Đo OD λ=595nm ODT=? ODM=? không 2,5 5,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,5 2,5 5,0 1,0 ODC=? - Tính kết quả: Hoạt tính enzyme Bromelain biểu thị số µg tyrosin sinh thủy phân hemoglobin enzyme có 1ml dung dịch hay 1mg hỗn hợp chứa bromelain phút 35,50C pH=6,0 Hoạt tính tính theo cơng thức: HT= Trong đó: HT: hoạt tính enzyme bromelin (UI/ml) X1: thể tích dung dịch tyrosin chuẩn (ml) X2: thể tích dung dịch chứa enzyme (ml) ΔODT = ODT - ODC ΔODM = ODM - ODC Xác định hoạt tính riêng bromelain Hoạt tính riêng bromelain tính theo cơng thức sau : HTR= Trong đó: HTR : Hoạt tính riêng bromelain ( UI/g) HT : Hoạt tính enzyme bromelain ( UI/g ) m : Hàm lượng protein ( g) Xác định hiệu suất thu hồi mức độ tinh ( puritrification fold ) Ta chọn phân đoạn để tính hiệu suất thu hồi mức độ tinh phân đoạn Hiệu suất thu hồi mức độ tinh bromelain tính theo cơng thức P=*100 Trong : P : Hiệu suất thu hồi ( %) HTts : hoạt tính bromelain sau tinh ( UI/ ml) HTth: hoạt tính bromelain dịch enzyme thơ PS= Trong : PS : Mức độ tinh HTRts : hoạt tính riêng bromelain sau tinh ( UI/ ml) HTRth : hoạt tính riêng bromelain dịch enzyme thơ ( UI/ ml) III Kết tính toán Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford:  Kết OD Ống OD 0,174 0,274 0,453 0,520 0,715 ĐƯỜNG CHUẨN ALBUMIN 0.8 0.7 f(x) = 0.14x + 0.01 R² = 0.99 OD 595 nm 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Nồng độ Albumin Xác định hoạt tính bromelain theo phương pháp Ansson cải tiến: Bảng :kết đo hoạt tính cải tiến Phân đoạn ODC ODM ODT phút 0,144 0,082 phút 0,001 0,023 14 phút 0,024 0,025 18 phút 0,010 0,048 Ta có: ODT=ODT -ODC ODM=ODM -ODC Hoạt tính đươc tính theo cơng thức: HT=** Trong đó: HT: hoạt tính enzyme bromelain (UI/ml) X1: thể tích dung dịch tyrosin chuẩn (ml) (x1=0,5) X2: thể tích dung dịch chứa enzyme (ml) (x2=0,5) Phân đoạn HT ( UI/ ml) 79,02 14 1,95 Xác định hoạt tính riêng bromelain Ta có: HTR= 18 43,2 9,37 Trong đó: HTR: hoạt tính riêng bromelain(UI/g) HT : Hoạt tính enzyme bromelain(UI/g) m:hàm lượng protein (g) Phân đoạn 454,13 HTR 14 7,1168 18 95,364 18,01 92 Xác định hiệu suất thu hồi mức độ tinh ( puritrification fold ) Hiệu suất thu hồi mức độ tinh bromelain tính theo cơng thức P= ���� × 100 ���ℎ Trong : P : Hiệu suất thu hồi ( %) HTts : hoạt tính bromelain sau tinh ( UI/ ml) HTth : hoạt tính bromelain dịch enzyme thô ( UI/ ml) Phân đoạn Hiệu suất thu hồi ����� PS = 14 18 ����ℎ Trong : PS : Mức độ tinh HTRts : hoạt tính riêng bromelain sau tinh ( UI/ ml) HTRth : hoạt tính riêng bromelain dịch enzyme thô ( UI/ ml) Phân đoạn Mức độ tinh 14 18 IV Yêu cầu thảo luận - Giải thích bước tiến hành đo hoạt tính bromelin: Cho chất protein dung dịch hemoglobin 2% sau để yên 35,50C phút để biến tính protein nhiệt độ Sau cho trichloacetic acid 5%, HCl 0,2N, tyrosin 1/400N, dịch enzyme bromelin lắc đều, để yên 35,50C 10 phút trình enzyme bromelin thủy phân protein Tiếp tục cho trichlororacetic 5%, dịch enzyme bromelin, lắc để yên 10 25 0C lọc để tiếp tục trình thủy phân protein sau l ọc để loại bỏ cặn có nh ững thành phần protein chưa thủy phân, enzyme dư Dung dịch lọc cho thêm NaOH 0,5N thuốc thử Folin1/3, NaOH đệm ki ềm thuốc thử Folin hoạt động tốt Sau tiến hành đo OD đ ọc kết ... theo phương pháp Bradford:  Kết OD Ống OD 0,1 74 0,2 74 0 ,45 3 0,520 0,715 ĐƯỜNG CHUẨN ALBUMIN 0.8 0.7 f(x) = 0.14x + 0.01 R² = 0.99 OD 595 nm 0.6 0.5 0 .4 0.3 0.2 0.1 0 Nồng độ Albumin Xác định hoạt... tiến: Bảng :kết đo hoạt tính cải tiến Phân đoạn ODC ODM ODT phút 0, 144 0,082 phút 0,001 0,023 14 phút 0,0 24 0,025 18 phút 0,010 0, 048 Ta có: ODT=ODT -ODC ODM=ODM -ODC Hoạt tính đươc tính theo cơng... 14 1,95 Xác định hoạt tính riêng bromelain Ta có: HTR= 18 43 ,2 9,37 Trong đó: HTR: hoạt tính riêng bromelain(UI/g) HT : Hoạt tính enzyme bromelain(UI/g) m:hàm lượng protein (g) Phân đoạn 45 4,13