(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử SSR trong chọn giống bạch đàn lai (e urophylla x e exserta)

i VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ LINH ĐAM NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR TRONG CHỌN GIỐNG BẠCH ĐÀN LAI (EUCALYPTUS UROPHYLLA x E EXSERTA) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, 2017 download by : skknchat@gmail.com ii VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ LINH ĐAM NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR TRONG CHỌN GIỐNG BẠCH ĐÀN LAI (EUCALYPTUS UROPHYLLA x E EXSERTA) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 \ NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS Nguyễn Việt Cƣờng Hà Nội, 2017 download by : skknchat@gmail.com i LỜI CẢM ƠN Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Việt Cường – Trưởng môn Lai giống sinh học hạt phấn trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Nghiên cứu Giống Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, phòng đào tạo sau đại học Viện sinh thái Tài nguyên sinh vật – Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam, thầy giáo tồn thể anh chị em đồng nghiệp tạo điều kiện cho tơi hồn thành tốt chương trình học luận văn Cuối cùng, tơi xin tỏ lịng biết ơn đến gia đình, bạn bè đơn vị công tác giúp đỡ q trình thực luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Linh Đam download by : skknchat@gmail.com ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN………………………………………………………… …….i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU A Ngoài nƣớc 1.1 Những nghiên cứu chọn giống bạch đàn 1.2 Giới thiệu thị SSR số ứng dụng chọn giống 1.2.1 Giới thiệu thị SSR (Simple Sequence Repeat) 1.2.2 Ưu điểm chọn giống thị phân tử 1.2.3 Một số ứng dụng thị phân tử chọn giống B Trong nƣớc 15 1.3 Những nghiên cứu chọn giống bạch đàn Việt Nam 15 1.4 Ứng dụng thị phân tử chọn giống Việt Nam 17 CHƢƠNG II MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Mục tiêu 20 2.2 Nội dung 20 2.3 Vật liệu nghiên cứu 20 2.3.1 Vật liệu sử dụng để sàng lọc cặp mồi SSR đa hình 20 2.3.2 Vật liệu sử dụng để phân tích liên quan cặp mồi SSR với tính trạng sinh trưởng bạch đàn lai 21 2.3.3 Các cặp mồi SSR sử dụng nghiên cứu 24 2.4 Hóa chất thiết bị 24 download by : skknchat@gmail.com iii 2.4.1 Hóa chất 24 2.4.2 Thiết bị 25 2.5 Phương pháp nghiên cứu 25 2.5.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu 25 2.5.2.Phương pháp đo nồng độ quang phổ kế 26 2.5.3 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 26 2.5.4 Phương pháp điện di gel agarose 1% 27 2.5.5 Phương pháp điện di gel polyacrylamide 5% 27 2.5.6 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 29 CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Thu thập thông tin trình tự từ mồi SSR có liên quan đến loài bạch đàn 32 3.2 Sàng lọc cặp mồi SSR để tìm cặp mồi SSR đa hình 34 3.2.1 Tách chiết ADN tổng số điện di kiểm tra 34 3.2.2 Xác định điều kiện PCR tối ưu cho việc nhân đoạn SSR 36 3.2.3 Kết phân tích đa hình điện di gel polyacrylamide 38 3.3 Xác định cặp mồi SSR liên quan đến sinh trưởng nhanh 47 3.4 Kiểm chứng thị có liên quan đến tính trạng sinh trưởng 53 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 Kết luận 59 Kiến nghị 59 PHỤ LỤC 67 download by : skknchat@gmail.com iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Giải thích ADN Acid Deoxyribonucleic AFLP Amplified Fragments Length Polymorphism ARN Acid Ribonucleotide bp Cặp base (base pair) C:I Chloroform : Isoamyl Alcolhol CTAB Cetyl trimethylammonium bromide dNTPs Deoxynucleotide triphosphate EDTA Ethylene Diamin Tetra Acetate OD Optical density 10 PCR Polymerase Chain Reaction 11 RAPD 12 QTL Quantative trait locus 13 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism 14 SSR Simple sequence repead 15 TAE Tris acetic EDTA 16 TBE Tris boric EDTA 17 UV Tia tử ngoại (Ultraviolet) 18 UC Bạch đàn lai Uro Camal 19 UE Bạch đàn lai Uro Eserta Random Amplified Polymorphic ADN download by : skknchat@gmail.com v DANH MỤC HÌNH ẢNH Bảng Nội dung Trang Hình 3.1 Kết điện di ADN tổng số mẫu bạch đàn lai 35 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi SSR 56°C 37 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi SSR 58°C 37 Hình 3.4 Mức độ đa hình số cặp mồi EMBRA 39 Kết điện di sản phẩm PCR mẫu với thị Hình 3.5 EMBRA39 Hình 3.6 Kết điện di dòng bạch đàn lai với EMBRA229 Hình 3.7 Hình 3.8 Kết điện di dòng bạch đàn lai với EMBRA78 gel polyacrylamide 5% Kết điện di dòng bạch đàn lai với EMBRA209 gel polyacrylamide 5% download by : skknchat@gmail.com 46 55 56 56 vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Nội dung Trang 2.1 Danh mục 22 mẫu sử dụng để sàng lọc cặp mồi SSR đa hình 20 2.2 Các dòng bạch đàn lai sinh trưởng nhanh chậm Bầu Bàng Bình Dương (2002-2012) 21 2.3 Các dịng bạch đàn lai sử dụng nghiên cứu 22 2.4 Thành phần phản ứng PCR 26 3.1 Kết đo OD mẫu ADN tổng số 35 3.2 3.3 3.4 Nhiệt độ bắt cặp 205 cặp mồi EMBRA sau tối ưu sử dụng nghiên cứu (chi tiết phụ lục 2) Số alen hệ số PIC 106 cặp mồi có đa hình 53 thị SSR có độ đa hình cao sử dụng để sàng lọc thị SSR liên kết với sinh trưởng nhanh 38 40 42 3.5 Các kiểu gen 104 phân tích thị EMBRA39 43 3.6 Kết điện di cặp mồi liên quan đến sinh trưởng với 60 dòng 47 3.7 Tương quan cặp mồi EMBRA với suất bạch đàn lai 50 3.8 3.9 Các dòng bạch đàn lai thể suất cao thấp trường khảo nghiệm Bầu Bàng Bình Dương (2002-2010) Sự liên kết thị SSR với tính trạng (NS - suất) download by : skknchat@gmail.com 54 54 ĐẶT VẤN ĐỀ Cải thiện sinh trưởng (năng suất) rừng mục tiêu chọn giống quan trọng nhiều chương trình nghiên cứu lâm nghiệp, nhiên suất có hệ số di truyền thấp Năng suất tính trạng số lượng phức tạp thể qua thơng số đường kính chiều cao, tổng hợp nhiều tính trạng khác nhau, ảnh hưởng lớn yếu tố môi trường Sự khác biệt suất phân li hai gen mà phân li nhiều gen, với ảnh hưởng gen nhỏ Tính trạng số lượng khơng phân li thành nhóm cụ thể, ta khơng thể đơn giản sử dụng ngun lí di truyền Mendel để nghiên cứu Các nghiên cứu chọn giống trồng lâm nghiệp nước quốc tế có trợ giúp cơng nghệ sinh học có thành cơng định, nghiên cứu ứng dụng thị phân tử chọn giống bạch đàn (E globulus, E nitens) Bundock cộng 2008; Freeman cộng 2009 cho thấy thị SSRs, RAPDs có tương quan đến sinh trưởng đường kính với mức đóng góp biến dị kiểu hình từ 3,8 đến 17,9%, ngồi tác giả số tính trạng chất lượng mật độ gỗ, hàm lượng xenlulơ, lignin đóng góp cho mức biến dị từ 5,6 - 12,3% [20] [28] Theo Brondani cộng sự, (2006) đồ liên kết cho loài E grandis, số 172 thị có 153 (89%) thị giữ ngun vị trí đồ chung cho Eucalyptus Trong đồ liên kết cho lồi E urophylla có 140 152 (92%) thị giữ nguyên vị trí đồ chung [19] Anand Raj Kumar Kullan cộng (2012) nghiên cứu di truyền tính trạng tăng trưởng, tỷ trọng gỗ biểu gen hai gia đình lai trở lại lồi Bạch đàn urơ Bạch đàn grandis xác định QTL đường kính thân 12 QTL cho tỷ trọng gỗ Các QTLs cho đường kính tỷ trọng gỗ cho thấy mức đóng góp biến đổi kiểu hình 3,1 - download by : skknchat@gmail.com 12,2% Như tính trạng chất lượng lẫn số lượng nghiên cứu đóng góp 18% biến dị cho tính trạng nghiên cứu Một gợi ý Bala R Thumma cộng 2010 nghiên cứu chọn giống truyền thống có trợ giúp công nghệ sinh học (chỉ thị phân tử liên kết với tính trạng sinh trưởng) để tăng hiệu lựa chọn cho tính trạng số lượng có di truyền thấp, suất cách tiếp cận có hiệu Đây hướng đề tài“ Nghiên cứu ứng dụng thị phân tử SSR chọn giống bạch đàn lai (E urophylla x E exserta)” đề xuất thực [41] Luận văn phần đề tài “Nghiên cứu chọn giống bạch đàn lai thị phân tử” giai đoạn 2012-2016, TS Nguyễn Việt Cường làm chủ nhiệm đề tài cộng tác viên đề tài download by : skknchat@gmail.com ... THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ LINH ĐAM NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR TRONG CHỌN GIỐNG BẠCH ĐÀN LAI (EUCALYPTUS UROPHYLLA x E EXSERTA) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Sinh... 1.1 Những nghiên cứu chọn giống bạch đàn 1.2 Giới thiệu thị SSR số ứng dụng chọn giống 1.2.1 Giới thiệu thị SSR (Simple Sequence Repeat) 1.2.2 Ưu điểm chọn giống thị phân tử 1.2.3... 204 lai từ cặp bố mẹ Bạch đàn urơ với lồi Bạch đàn tere, Bạch đàn caman, Bạch đàn liễu, Bạch đàn grandis, Bạch đàn saligna Bạch đàn pellita Trong số cá thể lai từ tổ hợp Bạch đàn urô x Bạch đàn