2644-3230-1-PB

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH TẠP CHÍ KHOA HỌC HO CHI MINH CITY UNIVERSITY OF EDUCATION JOURNAL OF SCIENCE KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ ISSN: 1859-3100 Tập 15, Số (2018): 165-172 NATURAL SCIENCES AND TECHNOLOGY Vol 15, No (2018): 165-172 Email: tapchikhoahoc@hcmue.edu.vn; Website: http://tckh.hcmue.edu.vn ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA TĂNG TRƯỞNG THỰC VẬT BA VÀ NAA ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO TỪ LÁ CÂY CÁT TƯỜNG HỒNG IN VITRO Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn Lương Thị Lệ Thơ*, Nguyễn Hà Phương Thảo Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh Ngày nhận bài: 21-8-2018; ngày nhận sửa: 31-8-2018; ngày duyệt đăng: 21-9-2018 TÓM TẮT Cát Tường hồng lồi hoa kiểng có giá trị thương phẩm cao khó thích nghi với mơi trường tự nhiên nên việc nhân nhanh giống invitro cần thiết Mơ sẹo ngun liệu khởi đầu có khả biệt hóa thành rễ, chồi phơi để tạo hoàn chỉnh giúp nhân nhanh giống Kết nghiên cứu cho thấy mơi trường MS có bổ sung BA mg/l kết hợp với NAA mg/l cho phát triển sẹo tốt Từ khóa: Cát Tường hồng, mơ sẹo, chất điều hịa tăng trưởng thực vật ABSTRACT Effect of plant growth hormone BA and NAA on the ability to produce callus from leaf of Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn in vitro Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn is species of high value commercial flowers but it difficult to adapt to the natural environment therefore the rapid invitro multiplication is necessary Callus is the starting material capaple of differentiation into roots, shoots and embryos to create complete plants to multiply seedlings Result indicated that MS medium supplemented with 2mg/l BA and mg/l NAA for best callus growth Keywords: Eustoma grandiflorum, callus, plant growth regulators Mở đầu Cát Tường hồng Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn loài hoa kiểng mang nhiều ý nghĩa may mắn, biểu tượng viên mãn, an lành nên có giá trị thương phẩm cao Đây lồi thực vật ơn đới, nguồn gốc từ miền Tây nước Mĩ [1] Ở nước ta, Cát Tường hồng sản xuất nhiều Đà Lạt Tuy nhiên, việc sản xuất đa phần mang tính tự phát nên diện tích trồng khơng rộng, sản lượng chất lượng hoa không đạt hiệu mong muốn Bên cạnh đó, nhu cầu chơi hoa Cát Tường ngày tăng; vậy, số lượng chất lượng hoa sản xuất không đủ đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng [1] * Email: tholtl@hcmue.edu.vn 165 TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM Tập 15, Số (2018): 165-172 Mô sẹo đám tế bào khơng phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh thường tạo xáo trộn q trình tạo quan Do đó, non hay mảnh thân non trưởng thành dễ cho mô sẹo điều kiện nuôi cấy mô [2] Mô sẹo phát triển khơng theo quy luật có khả biệt hóa thành rễ, chồi phơi để tạo hồn chỉnh Do đó, nghiên cứu này, chúng tơi muốn tìm hiểu ảnh hưởng chất điều hịa tăng trưởng thực vật BA NAA đến khả tạo mô sẹo từ Cát Tường hồng in vitro Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn” nhằm góp phần nhân nhanh giống Cát Tường hồng đạt chất lượng số lượng đáp ứng nhu cầu thị hiếu người tiêu dùng Vật liệu Các mẫu non cô lập từ Cát Tường hồng in vitro tuần tuổi ni cấy ống nghiệm Phịng Thí nghiệm G005 - Bộ mơn Sinh lí Thực vật – Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh Phương pháp 3.1 Tạo Cát Tường hồng in vitro từ đoạn thân mang chồi Các đoạn thân mang chồi cắt rời khỏi nhánh, rửa vòi nước xà phịng sau rửa lại với nước cất Tiếp tục lắc mẫu với cồn 900 khử trùng dung dịch HgCl2 Sau cấy mẫu vào ống nghiệm chứa môi trường MS bổ sung BA mg/l Sự nuôi cấy thực điều kiện chiếu sáng 2500 ± 500 lux (12 giờ/ngày), độ ẩm 60% ± 5%, nhiệt độ 22oC ± 2oC Mỗi thí nghiệm lặp lại lần, lần khúc cắt 3.2 Khảo sát ảnh hưởng BA NAA riêng lẻ hay kết hợp nồng độ khác tạo mô sẹo từ Cát Tường hồng in vitro Chọn non từ mẫu Cát Tường hồng in vitro tuần tuổi, cắt đường vng góc với gân Sau đó, cấy vào môi trường MS bổ sung BA (0,5 mg/l, mg/l, 1,5 mg/l, mg/l 2,5 mg/l) riêng lẻ hay phối hợp với NAA (0,5 mg/l; mg/l) Theo dõi ghi nhận phát sinh mô sẹo, tỉ lệ sẹo, cân trọng lượng mô sẹo nghiệm thức sau tuần nuôi cấy Sự nuôi cấy thực điều kiện tối, độ ẩm 60% ± 5%, nhiệt độ 22oC ± 2oC Mỗi thí nghiệm lặp lại lần, lần mẫu in vitro 3.3 Quan sát hình thái giải phẫu Những biến đổi tế bào học trình cảm ứng tạo sẹo theo dõi sau thực lát cắt tay, nhuộm kép với đỏ carmin xanh metylen quan sát kính hiển vi quang học vào ngày thứ 3, 7, 10, 14 tính từ lúc bắt đầu ni cấy 3.4 Xử lí số liệu Các số liệu xử lí thống kê chương trình Statistical Product and Services Solutions (SPSS), phiên 20 dùng cho Windows Sự khác biệt có ý nghĩa mức xác suất p = 0.05 (p: probability) giá trị biểu mẫu tự khác 166 TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM Lương Thị Lệ Thơ tgk Kết 4.1 Tạo Cát Tường hồng in vitro từ đoạn thân mang chồi Sau tuần nuôi cấy mơi trường MS có bổ sung BA mg/l giúp cho phát triển chồi từ đoạn thân mang chồi Cát Tường hồng tốt với số chồi số non nhiều, non có màu xanh tươi (Ảnh 1, Bảng 1) Bảng Ảnh hưởng BA 1mg/l đến phát triển đoạn thân mang chồi Cát Tường hồng Eustoma Grandiflorum (Raf.) Shinn Tuần Số chồi ; Số lá/ chồi Số chồi Số lá/chồi Số chồi Số lá/chồi Số chồi Số lá/chồi Số chồi Số lá/chồi BA mg/l 1.67 ± 0.13 d 1.58 ± 0.55 a 2.17 ± 0.19 d 4.5 ± 0.15 cd 2.67 ± 0.37 d 6.0 ± 0.36 d 2.67 ± 0.37 d 7.46 ± 0.37 bd Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p = 0,05 Ảnh Cây Cát tường hồng in vitro Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn sau tuần ni cấy mơi trường MS có bổ sung BA mg/l 4.2 Ảnh hưởng BA đến khả tạo mô sẹo từ mẫu Cát Tường hồng in vitro Sau tuần nuôi cấy mẫu Cát Tường hồng in vitro môi trường MS, 100% mẫu cấy khơng tạo sẹo, dần có màu xanh nhạt, thiếu sức sống chết (Ảnh 2a, Bảng 2) Trên mơi trường MS có bổ sung BA riêng lẻ nồng độ khác (0,5 mg/l; mg/l; 1,5 mg/l; mg/l; 2,5 mg/l) sau tuần nuôi cấy 100% mẫu cấy từ Cát Tường hồng in vitro có tác dụng kích thích tạo mơ sẹo sẹo phát triển chậm nhanh bị chai tuần thứ Ở tất mẫu cấy, bên cạnh việc tạo sẹo cịn kích thích tạo chồi, nhiên chồi phát triển yếu, có màu trắng nhạt ngắn (Ảnh 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, Bảng 2) 167 TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM Tập 15, Số (2018): 165-172 Bảng Ảnh hưởng BA đến khả tạo sẹo trọng lượng mô sẹo từ mẫu Cát Tường hồng in vitro sau tuần nuôi cấy Nồng độ BA (mg/l) Đối chứng 0,5 1,5 2,5 Tỉ lệ tạo sẹo (%) Tuần Tuần a ± 0.00 00 ± 0.00a 75 ± 0.08b 97 ± 0.03b 91 ± 0.07c 95 ± 0.05b 100 ± 0.00c 100 ± 0.00b c 98 ± 0.02 100 ± 0.00b 88 ± 0.06bc 100 ± 0.00b Trọng lượng sẹo (mg) Tuần Tuần a 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00a 0.09 ± 0.02b 0.09 ± 0.02b 0.06 ± 0.02b 0.09 ± 0.01b 0.07 ± 0.01b 0.09 ± 0.01b 0.13 ± 0.01c 0.17 ± 0.01c b 0.06 ± 0.00 0.11 ± 0.01b Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p = 0,05 2a 2d 2b 2c 2e 2f Ảnh Khả tạo sẹo từ mẫu in vitro môi trường MS bổ sung BA nồng độ khác 2a Môi trường MS; 2b Môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/l; 2c Môi trường MS bổ sung BA mg/l; 2d Môi trường MS bổ sung BA 1,5 mg/l; 2e Môi trường MS bổ sung BA mg/l; 2f Môi trường MS bổ sung BA 2,5 mg/l Độ tuổi yếu tố quan trọng có ảnh hưởng đến khả quang hợp tạo sẹo [2] Dưới tác động cytokinin (hoặc phối hợp với auxin), trình phân chia tế bào dễ xảy xáo trộn dẫn đến hình thành mơ sẹo [5] Chính thế, non có vết thương lá, bên cạnh tăng cường hoạt động phân chia tế bào trình xáo trộn phân chia dễ xảy 168 TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM Lương Thị Lệ Thơ tgk 4.3 Ảnh hưởng BA NAA 0.5 mg/l đến khả tạo mô sẹo từ mẫu Cát Tường hồng in vitro Trên mơi trường MS có bổ sung BA NAA 0,5 mg/l có khả tạo sẹo cao Sẹo tạo sau tuần nuôi cấy (Ảnh 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, Bảng 3) Tuy nhiên qua theo dõi phát triển sẹo phát triển chồi khơng có khác biệt so với nghiệm thức ảnh hưởng BA riêng lẻ (Bảng 2) Bảng Ảnh hưởng NAA 0,5 mg/l phối hợp với BA đến khả tạo sẹo trọng lượng mô sẹo từ mẫu Cát Tường hồng in vitro sau tuần nuôi cấy Tỉ lệ tạo sẹo (%) Trọng lượng sẹo (mg) Tuần Tuần Tuần Tuần a a a ± 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00a 95 ± 0.03b 95 ± 0.03b 0.09 ± 0.01bc 0.13 ± 0.01bc 95 ± 0.03b 95 ± 0.03b 0.06 ± 0.00b 0.09 ± 0.01b 0.08 ± 0.01c 0.11 ± 0.01b 100 ± 0.00b 100 ± 0.00b b b b 100 ± 0.00 100 ± 0.00 0.12 ± 0.01 0.16 ± 0.02c 0.07 ± 0.00b 0.11 ± 0.01b 100 ± 0.00b 100 ± 0.00b Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p = 0,05 Nồng độ NAA (mg/l) Đối chứng 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Nồng độ BA (mg/l) Đối chứng 0,5 1,5 2,5 2a 3b 3c 3d 3e 3f Ảnh Khả tạo sẹo từ mẫu in vitro môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/l phối hợp với BA nồng độ khác sau tuần nuôi cấy 2a Môi trường MS; 3b Môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/l BA 0,5 mg/l; 3c Môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/l BA mg/l; 3d Môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/l BA 1,5 mg/l; 3e Môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/l BA mg/l; 3f Môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/l BA 2,5 mg/l 169 TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM Tập 15, Số (2018): 165-172 4.4 Ảnh hưởng BA NAA mg/l đến khả tạo mô sẹo từ mẫu Cát Tường hồng in vitro Trên môi trường MS có bổ sung BA NAA mg/l mẫu cấy từ Cát tường hồng in vitro có khả sẹo (Bảng 4) Đặc biệt, nghiệm thức mơi trường MS có bổ sung BA mg/l NAA mg/l cho tỉ lệ tạo sẹo cao sẹo phát triển nhanh sẹo có trọng lượng cao sau tuần ni cấy Sẹo có màu vàng trắng, khơng có dấu hiệu bị chai (Ảnh 4e, Bảng 4) Ở nghiệm thức lại có tạo sẹo sẹo phát triển mức trung bình nên cho trọng lượng sẹo thấp Bên cạnh việc tạo sẹo, mẫu cấy tạo chồi, nhiên chồi có màu trắng nhạt phát triển yếu (Ảnh 4b, 4c, 4d, 4f, Bảng 4) Bảng Ảnh hưởng NAA mg/l phối hợp với BA đến khả tạo mô sẹo trọng lượng mô sẹo từ mẫu Cát Tường hồng in vitro sau tuần nuôi cấy Nồng độ NAA (mg/l) Đối chứng 1 1 Nồng độ BA (mg/l) Đối chứng 0,5 1,5 2,5 Tỉ lệ tạo sẹo (%) Tuần Tuần a 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00a b 100 ± 0.00 100 ± 0.00b 93 ± 0.07b 93 ± 0.07b 97 ± 0.02b 97 ± 0.02b 97 ± 0.02b 97 ± 0.02b 93 ± 0.04b 93 ± 0.04b Trọng lượng sẹo (mg) Tuần Tuần a 0.00 ± 0.00 0.00± 0.00a b 0.04 ± 0.00 0.07 ± 0.00b 0.07± 0.00c 0.11± 0.01bc 0.09 ± 0.01c 0.11± 0.01bc 0.14 ± 0.02d 0.18± 0.02d 0.06 ± 0.01bc 0.08± 0.00bc Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p = 0,05 2a 4b 4c 4d 4e 4f Ảnh Khả tạo sẹo từ mẫu in vitro môi trường MS bổ sung NAA 1mg/l phối hợp với BA nồng độ khác sau tuần nuôi cấy 2a Môi trường MS; 4b Mơi trường MS có bổ sung NAA mg/l BA 0,5 mg/l; 4c Môi trường MS có bổ sung NAA mg/l BA mg/l; 4d Mơi trường MS có bổ sung NAA mg/l BA 1,5 mg/l; 4e Mơi trường MS có bổ sung NAA mg/l BA mg/l; 4f Môi trường MS có bổ sung NAA mg/l BA 2,5 mg/l 170 TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM Lương Thị Lệ Thơ tgk Chất điều hòa tăng trưởng thực vật đóng vai trị quan trọng q trình hình thành mơ sẹo, đặc biệt auxin Hiệu ứng auxin tùy thuộc vào loại nồng độ mô thực vật hay môi trường nuôi cấy [2] Ngồi nồng độ với tỉ lệ thích hợp áp dụng mục đích tạo mơ sẹo, phải ý đến phối hợp tỉ lệ auxin cytokinin [5] Tỉ lệ auxin/cytokinin cao kích thích tạo rễ, tỉ lệ thấp kích thích tạo chồi, mức trung gian kích thích tạo mơ sẹo [5] Điều phù hợp với môi trường MS có bổ sung NAA 1mg/l với BA (1,5 mg/l) thúc đẩy kích thích tạo mơ sẹo sẹo phát triển nhanh mơi trường MS có bổ sung NAA 1mg/l phối hợp BA 2,5mg/l thúc đẩy tạo chồi Cytokinin kích thích phân chia tế bào thúc đẩy phiên mã tạo mRNA, kích thích tổng hợp protein enzim đặc hiệu mơ xác định để tạo sẹo với điều kiện có auxin [6] Chính nghiệm thức với tác động riêng lẻ BA lên khả tạo sẹo sau tuần, tỉ lệ tạo sẹo cao sẹo phát triển chậm trọng lượng sẹo thấp nghiệm thức có phối hợp BA NAA Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh có nguồn gốc từ sản phẩm trung gian chu trình đường phân có ảnh hưởng đến khả tạo sẹo phối hợp với chất điều hòa tăng trưởng thực vật ngoại sinh [3] Điều phù hợp với mơi trường MS có bổ sung NAA 1mg/l phối hợp với BA 2mg/l cho tỉ lệ sẹo trọng lượng sẹo đạt cao Có lẽ lượng auxin nội sinh nhiều nên ảnh hưởng đến cân auxin cytokinin tạo sẹo nghiệm thức BA riêng lẻ phối hợp với NAA 4.5 Quan sát hình thái giải phẫu Sau tuần nuôi cấy, mô sẹo giải phẫu nhuộm kép với dung dịch đỏ carmin xanh metylen Kết giải phẫu cho thấy, mẫu có khối sẹo hình thành nơi gần với bó dẫn, cạnh gân gân bên Xuất tế bào tiếp tuyến xếp chồng lên nhau, có tiềm phân sinh Sự cảm ứng tạo sẹo rõ tế bào biểu bì; nhiên, phân chia khối tế bào khơng nhiều, chủ yếu thấy có gia tăng kích thước tế bào nhu mơ (Ảnh 5a, 5b, 5c, 5d) Ảnh 5a Sẹo cắt ngang từ mẫu in vitro mơi trường MS có bổ sung NAA mg/l BA mg/l sau ngày Ảnh 5b Sẹo cắt ngang từ mẫu in vitro mơi trường MS có bổ sung NAA mg/l BA mg/l sau ngày 171 Ảnh 5c Sẹo cắt ngang từ mẫu in vitro mơi trường MS có bổ sung NAA mg/l BA mg/l sau 10 ngày Ảnh 5d Sẹo cắt ngang từ mẫu in vitro môi trường MS có bổ sung NAA mg/l BA mg/l sau 14 ngày TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM Tập 15, Số (2018): 165-172 Kết luận Ở nghiệm thức môi trường MS phối hợp với BA riêng lẻ hay kết hợp với NAA kích thích mẫu non Cát tường hồng in vitro tạo sẹo Ở mơi trường MS có bổ sung BA mg/l kết hợp với NAA mg/l cho phát triển sẹo tốt Các khối sẹo hình thành nơi gần với bó dẫn, cạnh gân gân bên Tuyên bố quyền lợi: Các tác giả xác nhận hoàn toàn khơng có xung đột quyền lợi [1] [2] [3] [4] [5] [6] TÀI LIỆU THAM KHẢO Vũ Thu Diễm, Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, phát triển ảnh hưởng số biện pháp kĩ thuật đến suất chất lượng hoa Cát Tường nhập nội Hà Nội Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp, Viện Di truyền Nông nghiệp, 2012 Bùi Trang Việt, Sinh lí Thực vật đại cương, phần II: Phát triển NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, 2000 W G Hopkins,“Introduction to Plant Physiology,” The University of Westher Ontario, pp.323-350, 1995 Dickmann D.I.,“Photosynthesis and respiration by developing leaves of cottonnood (Populus Deltoides Baite.),” Bot Gaz., 132, pp 253-259, 1971 Metzer J.D., “Hormones and reproductive development,” Plant Hormones Physiology, Biochemistry ang molercular biology Edited by Davies P.J., Kluwer Academic Publishers Dordrech, Boston, London, pp 617-648, 1995 Tom K Scot, “Auxin and root,” Ann, Rev, plant Physiol, 23, pp 235-258, 1972 172