(LUẬN văn THẠC sĩ) khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối dưới dạng bào tử của bacillus clausii​

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAM CHANDARA KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN CẤP KHÍ VÀ NHIỆT ĐỘ ĐỂ THU SINH KHỐI DƯỚI DẠNG BÀO TỬ CỦA Bacillus clausii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 download by : skknchat@gmail.com BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAM CHANDARA KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN CẤP KHÍ VÀ NHIỆT ĐỘ ĐỂ THU SINH KHỐI DƯỚI DẠNG BÀO TỬ CỦA Bacillus clausii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: DS Lê Ngọc Khánh Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI – 2013 download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Với tất kính trọng, xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo DS Lê Ngọc Khánh, người động viên, hướng dẫn tơi thời gian làm khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Đàm Thanh Xn tồn thể thầy giáo anh chị kỹ thuật viên môn Công Nghiệp Dược nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian nghiên cứu để hồn thành khóa luận Tơi xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi, dìu dắt tơi suốt q trình học tập trường Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ sống học tập Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng 05 năm 2013 Sinh viên MAM CHANDARA download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.Vi khuẩn Bacillus…………………………………………………………… 1.1.1 Giới thiệu chi Bacillus ……………………………………………7 1.1.2 Vị trí phân loại………………………………………………………….7 1.1.3 Đặc điểm vi khuản Bacillus…………………………………………………7 1.1.4 Bào tử khả hình thành bào tử……………………………… 1.1.5 Ứng dụng vi khuẩn Bacillus…………………………………… 10 1.2 Giới thiệu Bacillus clausii………………………………………….11 1.2.1 Đặc điểm sinh thái sinh lý Bacillus clausii………………………11 1.2.2 Ứng dụng Bacillus clausii………………………………………14 1.3 Các phương pháp ni cấy……………………………………………16 CHƯƠNG 2: : NGUN LIỆU, HĨA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị………………………….…… ………17 2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất……………………………………………… 17 2.1.2 Máy móc, thiết bị………….………….………………….… ……… 17 2.1.3 Mơi trường sử dụng………………………………………………… 17 2.2 Nội dung nghiên cứu…………………………………………… …….18 2.2.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng Bacillus clausii……………18 download by : skknchat@gmail.com 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện cấp khí để thu sinh khối………….18 2.3 Phương pháp nghiên cứu…………………………………………… 18 2.3.1 Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina……………………18 2.3.2 Giữ giống thạch nghiêng…………………………………… 18 2.3.3 Chuẩn bị dịch nhân giống………………………………………….19 2.3.4 Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng xác định lượng sinh khối ướt dịch lên men Bacillus clausii thời điểm khác ………………………………………………………………………19 2.3.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng điều kiện cấp khí lên khả tăng sinh khối ………………………………………………………19 2.3.6 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ lên khả tăng sinh khối ……………………………………………………….20 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………… 21 3.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng Bacillus clausii……………21 3.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện cấp khí nhiệt độ để thu sinh khối dạng bào tử Bacillus clausii so sánh với Bacillus subtilis…………………………………………………………………….23 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng chế độ cấp khí lên khả tăng sinh khối Bacillus clausii so sánh với Bacillus subtilis……………… 23 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên khả tăng sinh khối Bacillus clausii …………………………………………………………….28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………… ……………………….32 TÀI LIỆU THAM KHẢO download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 2.2 Các máy móc thiết bị sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 3.1 Lượng sinh khối thu Bacillus clausii thời 21 điểm khác Bảng 3.2 Ảnh hưởng tốc độ lắc lên khả tăng sinh khối 24 Bacillus clausii nhiệt độ 370C Bảng 3.3 Ảnh hưởng tốc độ lắc lên khả tăng sinh khối 25 Bacillus subtilis nhiệt độ 370C Bảng 3.4 So sánh sinh khối Bacillus clausii Bacillus subtilis 27 tốc độ lắc khác 370C Bảng 3.5 Lượng sinh khối thu nhiệt độ 300C 370C 29 Bacillus clausii Bảng 3.6 Lượng sinh khối thu nhiệt độ 300C 370C 30 Bacillus subtilis Bảng 3.7 So sánh khả tăng sinh khối nhiệt độ 300C 370C Bacillus clausii Bacillus subtilis download by : skknchat@gmail.com 31 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Bào tử Bacillus subtilis Hình 1.2 Bào tử Bacillus anthracis Hình 1.3 Quá trình hình thành bào tử Bacillus clausii Hình 1.4 Cấu tạo bào tử Hình 1.5 Bacillus clausii mơi trường đặc 13 Hình 1.6 Bào tử Bacillus clausii kính hiển vi điện tử 13 Hình 1.7 Chế phẩm Enterogermina 15 Hình 1.8 Chế phẩm Erceflora 15 Hình 1.9 Chế phẩm Bazivic 15 Hình 3.1 Sơ đồ biểu diễn đường cong sinh trưởng Bacillus 22 clausii Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn biến thiên lượng sinh khối Bacillus 24 clausii theo tốc độ lắc nhiệt độ 370C Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn biến thiên lượng sinh khối Bacillus 26 subtilis theo tốc độ lắc nhiệt độ 370C Hình 3.4 Đồ thị so sánh sinh khối Bacillus clausii Bacillus 27 subtilis tốc độ lắc khác 370C Hình 3.5 Đồ thị biến thiên lượng sinh khối Bacillus clausii 29 nhiệt độ 300C 370C Hình 3.6 Đồ thị biến thiên lượng sinh khối Bacillus subtilis nhiệt độ 300C 370C download by : skknchat@gmail.com 30 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong đường ruột người có diện lớn hệ vi sinh vật với khoảng 100 tỷ vi khuẩn, bao gồm vi sinh vật có lợi vi sinh vật có hại Các vi sinh vật có lợi có tác động tốt cho sức khỏe tổng hợp vitamin, giảm hình thành chất gây hại ruột, hỗ trợ tiêu hóa, giúp hấp thu tốt cải thiện rối loạn đường ruột, tăng cường sức khỏe, giúp phòng bệnh Ngược lại, vi sinh vật gây hại gây tác động xấu cho thể hình thành chất gây hoại tử ruột, chất gây ung thư, tiêu chảy… Trong sống hàng ngày, hệ vi sinh vật đường ruột dễ bị tác động yếu tố bên ngồi lão hóa, dùng kháng sinh, thức ăn không vệ sinh… làm cân số lượng vi khuẩn có lợi vi khuẩn có hại, gây nên bệnh đường ruột tiêu chảy điển hình Vì việc trì lượng vi sinh vật có lợi chiếm ưu nhằm hỗ trợ chức tiêu hóa miễn dịch đường ruột quan trọng Sử dụng chế phẩm chứa vi sinh vật có lợi (Probiotic) nhằm mục đích bổ sung, cân lại vi sinh vật đường ruột phương pháp phòng chữa bệnh tiêu chảy Trong Probiotic chế phẩm Enterogermina thực bật, chế phẩm chứa bào tử Bacillus clausii kháng đa kháng sinh, sử dụng dạng bào tử nên vi khuẩn qua dược dày với tỷ lệ sống sót cao điều trị rối loạn tiêu hóa hiệu Tuy nhiên việc nghiên cứu điều kiện nuôi cấy Bacillus clausii cịn quan tâm Vì vậy, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng điều kiện cấp khí để thu sinh khối dạng bào tử vi khuẩn Bacillus clausii” thực nhằm giải mục tiêu: - Xây dựng đường cong sinh trưởng Bacillus clausii - Khảo sát ảnh hưởng điều kiện cấp khí nhiệt độ để thu sinh khối dạng bào tử Bacillus clausii so sánh với Bacillus subtilis download by : skknchat@gmail.com CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Bacillus 1.1.1 Giới thiệu chi Bacillus  Từ Bacillus theo tiếng Latinh có nghĩa hình que, Bacillus cịn gọi trực khuẩn Chi Bacillus gồm nhiều loài biết đến như: Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus globigii, Bacillus natto, Bacillus clausii [15]  Do đa dạng lồi chi Bacillus, trực khuẩn sống phân lập môi trường khác nhau, từ đất, nước, khơng khí, trùng người 1.1.2 Vị trí phân loại  Theo Bergey’s manual of Systematic of Bacteriology 2nd edition, 2004 chi Bacillus thuộc họ Bacillaceae họ thuộc Bacillales, lớp Bacilli, ngành Firmicutes giới vi khuẩn  Việc phân loại vi khuẩn theo hình thái sinh lý hồn thiện việc giải trình tự gen 16S r.ARN Theo phương pháp người ta thấy Bacillus có mối quan hệ họ hàng với số loại vi khuẩn khơng hình thành nội tử Enterococcus, Lactobacillus Streptococcus cấp phân loại có mối quan hệ với Literia Staphylococcus cấp phân loại họ  Chi Bacillus bao gồm 400 loài (476 loài) 1.1.3 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus  Vi khuẩn Bacillus có hình que, thường Gram dương, có khả di động, hơ hấp hiếu khí kỵ khí tùy tiện, hầu hết có phản ứng catalase dương tính, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron trình trao đổi chất download by : skknchat@gmail.com  Về dinh dưỡng sinh trưởng, Bacillus sử dụng hợp chất hữu đơn giản loại đường, acid amin acid hữu Trong số trường hợp chúng lên men cacbohydrat qua loạt chuỗi phản ứng phức tạp tạo glycerol glutadiol  Phần lớn Bacillus sinh trưởng tối ưu nhiệt độ 30- 45ºC, pH khác nhau, dao động từ 2-11  Khả hình thành bào tử đặc điểm quan trọng chi Bacillus 1.1.4 Bào tử khả hình thành bào tử  Bào tử (nội bào tử) chi Bacillus miêu tả lần đầu năm 1872 Ferdinand Cohn nghiên cứu Bacillus subtilis sau Koch nghiên cứu mầm bệnh than vi khuẩn Bacillus anthracis năm 1976 [12] Hình 1.1 Bào tử Bacillus subtilis Hình 1.2 Bào tử Bacillus anthracis Bào tử thường có dạng hình cầu elip, kích thước 0,8 - 1,4 µm chiều dài, thể nghỉ vi khuẩn cuối giai đoạn sinh trưởng điều kiện sống không thuận lợi Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử lại nảy mầm phát triển thành tế bào sinh dưỡng  Sự hình thành nội bào tử qua bước: - Trong tế bào sinh dưỡng ADN phân chia thành nhiễm sắc thể (chromosom) riêng biệt màng tế bào chất lấn sâu vào phân chia tế bào download by : skknchat@gmail.com 21 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng Bacillus clausii - Mục đích Xây dựng đường cong sinh trưởng, xác định thời điểm thu sinh khối Bacillus clausii cho thí nghiệm - Tiến hành Trong bình nón chứa 50ml mơi trường canh thang, hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina theo phương pháp nêu mục 2.3.1 Nuôi máy lắc 150 vòng/phút 370C 24h thu dịch nhân giống Cấy 5ml dịch nhân giống vào 50ml môi trường canh thang hấp tiệt trùng để nguội đến nhiệt độ phịng, ni cấy máy lắc 370C, 150 vòng/phút Tại thời điểm khác (16h, 24h, 40h, 48h, 64h, 72h, 88h, 96h), ly tâm dịch lên men thu sinh khối, cân sinh khối để xây dựng đường cong sinh trưởng - Kết trình bày bảng 3.1 hình 3.1 Bảng 3.1 Lượng sinh khối thu Bacillus clausii thời điểm khác Thời điểm (h) Lượng sinh khối (g) 16 24 40 48 64 72 88 96 0,84 0,98 1,10 1,09 1,02 0,97 0,92 0,92 Chênh lệnh sinh khối (%) so với thời điểm 16,0 12,0 11,2 4,0 1,0 24h download by : skknchat@gmail.com 6,5 6,5 22 Lượng sinh khối (g) 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 0 16 24 40 48 64 72 80 88 96 Thời điểm (h) Hình 3.1 Sơ đồ biểu diễn đường cong sinh trưởng Bacillus clausii - Nhận xét Dựa vào đường cong sinh trưởng, ta nhận thấy thời điểm từ 16 – 40h lượng sinh khối B clausii tăng dần theo thời gian Lượng sinh khối thu lớn 1,10g thời điểm 40h (lớn 12% so với 24h) Kể từ thứ 40, lượng sinh khối giảm dần, đạt thấp 0,92g thời điểm 88 – 96h (ít 6,5% so với 24h) Kết tương tự với kết Nguyễn Thị Bích Ngọc [3] cho thấy sinh khối tăng nhanh theo thời gian thời điểm 24 – 36h đầu Theo công bố khác Nguyễn Thị Hiền [4], bào tử bắt đầu xuất sau 40 – 48h nuôi cấy môi trường lỏng điều kiện tự nhiên (môi trường không bổ sung Mn2+, không xử lý nhiệt để thu bào tử) Trong nghiên cứu này, tượng lượng sinh khối Bacillus clausii thời điểm 40h bắt đầu giảm dần so với giá trị lớn giải thích dựa vào đặc điểm hình thành bào tử chúng Hơn nữa, theo Nguyễn Thị Hiền [4], có phương pháp xử lý phù hợp hồn tồn chuyển dạng tế bào sinh dưỡng thành bào tử với hiệu suất cao Do đó, nghiên cứu này, việc khảo sát điều kiện để thu lượng bào tử lớn đưa khảo sát điều kiện để thu lượng sinh download by : skknchat@gmail.com 23 khối lớn Đối chiếu với kết bảng 3.1 cho thấy, lượng sinh khối thu thời điểm 40h nhiều nhất, sau 40h lượng sinh khối chuyển thành dạng bào tử Khi so sánh với lượng sinh khối thu thời điểm 24h, chênh lệch khơng q lớn (12%) Chính vậy, để tiết kiệm thời gian, môi trường dinh dưỡng thuận tiện cho việc lấy mẫu nghiên cứu, thời điểm 24h lựa chọn để thu sinh khối cho thí nghiệm 3.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện cấp khí nhiệt độ để thu sinh khối dạng bào tử Bacillus clausii so sánh với Bacillus subtilis 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng chế độ cấp khí lên khả tăng sinh khối Bacillus clausii so sánh với Bacillus subtilis Theo nhiều nghiên cứu cơng bố, Bacillus clausii thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí Đối với vi sinh vật hiếu khí nói chung chi Bacillus nói riêng, lưu lượng khí cung cấp q trình ni cấy đóng vai trị quan trọng đến sinh trưởng phát triển chúng Với mục đích thu lượng bào tử nhiều đưa khảo sát điều kiện tạo sinh khối lớn nên thí nghiệm nhằm mục tiêu khảo sát ảnh hưởng tốc độ cấp khí máy lắc đến lượng sinh khối thu trình lên men Bacillus clausii quy mơ phịng thí nghiệm, đồng thời so sánh với Bacillus subtilis (là chủng vi khuẩn Bacillus phổ biến) điều kiện - Tiến hành Trong bình nón chứa 50ml mơi trường canh thang, hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina theo phương pháp nêu mục 2.3.1 Ni máy lắc 150 vịng/phút 370C 24h thu dịch nhân giống Cấy 5ml dịch nhân giống vào 50ml môi trường canh thang hấp tiết trùng để nguội đến nhiệt độ phòng Lựa chọn điều kiện nhiệt độ cho lô lên men 370C với tốc độ lắc khác 100, 150 200 vòng/phút thời gian 24h download by : skknchat@gmail.com 24 Ly tâm dịch sau lên men 24h, thu cắn (4000 vòng/phút 15 - 20 phút) theo phương pháp mục 2.3.4 Xác định lượng sinh khối ướt cách cân cắn thu Thí nghiệm tiến hành lần độc lập - Kết trình bày bảng 3.2 hình 3.2 Bảng 3.2 Ảnh hưởng tốc độ lắc lên khả tăng sinh khối Bacillus clausii nhiệt độ 370C Lượng sinh khối (g) Tốc độ lắc (vòng/phút) Trung Lần Lần Lần 100 0,64 0,73 0,72 0,69 150 0,70 0,74 0,86 0,76 200 0,74 0,80 0,81 0,78 bình Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn biến thiên lượng sinh khối Bacillus clausii theo tốc độ lắc nhiệt độ 370C download by : skknchat@gmail.com 25 - Nhận xét Kết bảng 3.2 cho thấy với tốc độ lắc tăng lượng sinh khối Bacillus clausii tăng, lượng sinh khối đạt cực đại 0,78g tốc độ lắc 200 Như vậy, độ cấp khí tăng, sinh khối Bacillus clausii tăng Điều hoàn toàn phù hợp với đặc điểm sinh lý Bacillus clausii kết nghiên cứu trước [3], [4] Tuy nhiên, so sánh lượng sinh khối 150 vòng/phút 200 vòng/phút cho thấy chệnh lệnh không nhiều (0,02g), nên lựa chọn tốc độ lắc 150 vịng/phút để làm thí nghiệm Song song tiến hành thí nghiệm trên, Bacillus subtilis kết được trình bày bảng 3.3 hình 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hưởng tốc độ lắc lên khả tăng sinh khối Bacillus subtilis nhiệt độ 370 C Lượng sinh khối (g) Tốc độ lắc (vòng/phút) Trung Lần Lần Lần 100 0,53 0,71 0,73 0,65 150 0,68 0,76 0,78 0,74 200 1,02 1,03 1,10 1,05 download by : skknchat@gmail.com bình 26 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn biến thiên lượng sinh khối Bacillus subtilis theo tốc độ lắc nhiệt độ 370C - Nhận xét Kết bảng 3.3 cho thấy Bacillus subtilis ảnh hưởng điều kiện khí tương tự với Bacillus clausii Khi tốc độ lắc tăng, sinh khối tăng đạt cao chế độ lắc 200 vòng/phút 1,05g Sự chênh lệnh khối lượng sinh khối chế độ cấp khí 200 vịng/phút 100 vòng/phút cao (đạt giá trị 0,4g) Kết so sánh sinh khối Bacillus clausii Bacillus subtilis điều kiên lắc khác 370C thể bảng Bảng 3.4 hình 3.4 download by : skknchat@gmail.com 27 Bảng 3.4 So sánh sinh khối Bacillus clausii Bacillus subtilis tốc độ lắc khác 370C Lượng sinh khối (g) Tốc độ 100 Tốc độ 150 Tốc độ 200 vòng/phút vòng/phút vòng/phút Bacillus clausii 0,69 0,76 0,78 Bacillus subtilis 0,65 0,74 1,05 Chênh lệnh lượng sinh khối 6,00 2,70 34,60 Vi sinh vật chủng VSV (%) 1.2 Lượng sinh khối (g) 1.05 0.8 0.6 0.76 0.78 0.69 0.74 0.65 0.4 Bacillus clausii Bacillus subtilis 0.2 100 vòng/phút 150 vịng/phút 200 vịng/phút Tốc độ lắc Hình 3.4 Đồ thị so sánh sinh khối Bacillus clausii Bacillus subtilis tốc độ lắc khác 370C Theo đồ thị hình 3.4 so sánh tốc độ lắc, thấy 100 vịng/phút 150 vòng/phút, lượng sinh khối Bacillus clausii lớn Bacillus subtilis Tuy nhiên chênh lệnh không nhiều Trong download by : skknchat@gmail.com 28 với tốc độ lắc 200 vịng/phút, lượng sinh khối Bacillus clausii lại 34,60% so với Bacillus subtilis Như Bacillus clausii, độ cấp khí thay đổi từ 100 – 200 vòng/phút biến thiên lượng sinh khối không cao Sai khác tốc độ lắc 150 200 vịng/phút khơng đáng kể Do độ lắc 150 vịng/phút chọn cho thí nghiệm 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên khả tăng sinh khối Bacillus clausii - Mục đích Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên khả tăng sinh khối Bacillus clausii so sánh với Bacillus subtilis - Tiến hành Trong bình nón chứa 50ml mơi trường canh thang, hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina theo phương pháp nêu mục 2.3.1 Ni máy lắc 150 vịng/phút 370C 24h thu dịch nhân giống Cấy 5ml dịch nhân giống vào 50ml môi trường canh thang hấp tiệt trùng để nguội đến nhiệt độ phịng Ni cấy với tốc độ lắc 150 vòng/phút hai nhiệt độ khác 300C 370C Ly tâm dịch lên men sau 24h, thu cắn (ly tâm 4000 vòng/phút thời gian 15 – 20 phút) Xác định lượng sinh khối ướt cách cân cắn thu Thí nghiệm tiến hành lần độc lập download by : skknchat@gmail.com 29 - Kết trình bày bảng 3.5 hình 3.5 Bảng 3.5 Lượng sinh khối thu nhiệt độ 300C 370C Bacillus clausii Nhiệt độ Lượng sinh khối (g) Lần Lần Lần Trung Bình 30OC 0,86 0,86 0,94 0,84 37 OC 0,70 0,74 0,86 0,76 Chênh lệnh lượng sinh khối nhiệt độ (%) 10,5 Lần thí nghiệm Hình 3.5 Đồ thị biến thiên lượng sinh khối Bacillus clausii nhiệt độ 300C 370C - Nhận xét Kết bảng 3.5 cho thấy khối lượng sinh khối Bacillus clausii thu sau nuôi cấy 24h với tốc độ lắc 150 vòng/phút nhiệt độ 300C nhiều 10,5% so với 370C Như thấy 300C Bacillus download by : skknchat@gmail.com 30 clausii nghiên cứu phát triển thuận lợi Kết phù hợp với nhiệt độ tối ưu công bố để nuôi cấy chủng Bacillus clausii DSM 8716 [17], [19] Như chọn nhiệt độ 300C nhiệt độ để thu sinh khối lớn Đối với Bacillus subtilis tiến hành thí nghiệm trên, kết trình bày bảng 3.6 hình 3.6 Bảng 3.6 Lượng sinh khối thu nhiệt độ 300C 370C Bacillus subtilis Lượng sinh khối (g) Nhiệt độ Lần Lần Lần Trung Bình 30OC 0,93 0,95 0,97 0,95 37 OC 0,68 0,76 0,78 0,76 Chênh lệnh lượng sinh khối nhiệt độ (%) 28,3 Lần thí nghiệm Hình 3.6 Đồ thị biến thiên lượng sinh khối Bacillus subtilis nhiệt độ 300C 370C download by : skknchat@gmail.com 31 Kết bảng 3.6 cho thấy lượng sinh khối Bacillus subtilis thu sau nuôi cấy 24h với tốc độ lắc 150 vòng/phút nhiệt độ 300C cao 28,3% so với 370C Kết tương tự với kết Bacillus clausii - So sánh khả tăng sinh khối tốc độ lắc 150 vòng/phút nhiệt độ 300C 370C Bacillus clausii Bacillus subtilis Bảng 3.7 So sánh khả tăng sinh khối nhiệt độ 300C 370C Bacillus clausii Bacillus subtilis Vi sinh vật Lượng sinh khối (g) 300C 370C Bacillus clausii 0,84 0,76 Bacillus subtilis 0,95 0,74 Chênh lệnh lượng sinh khối 13,10 2,70 chủng VSV (%) Theo hình bảng 3.7, ta thấy nhiệt độ 370C lượng sinh khối thu Bacillus clausii Bacillus subtilis tương đương (chênh lệch 2,7%) lượng sinh khối 300C Ở nhiệt độ 300C lượng sinh khối Bacillus clausii lượng sinh khối Bacillus subtilis 13,1% Như vậy, thấy điều kiện nhiệt độ 370C khả phát triển chủng vi sinh vật gần giống nhau, nhiệt độ 300C, Bacillus clausii phát triển với tốc độ chậm Bacillus subtilis download by : skknchat@gmail.com 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau thời gian làm thực nghiệm khoa học, rút số kết luận sau:  Xây dựng đường cong sinh trưởng Bacillus clausii từ 16h đến 96h Lượng sinh khối thu lớn 1,10g thời điểm 40h, nhiên chênh lệch so với 24h không nhiều Để tiết kiệm thời gian dinh dưỡng, lựa chọn thời điểm để thu sinh khối cho thí nghiệm 24h  Khảo sát ảnh hưởng điều kiện cấp khí nhiệt độ đến sinh khối Bacillus clausii: - Khảo sát ảnh hưởng tốc độ lắc 100, 150, 200 vòng/phút đến lượng sinh khối Bacillus clausii Lựa chọn tốc độ lắc 150 vòng/phút tốc độ để thu sinh khối với lượng sinh khối tương đương lượng sinh khối 200 vòng/phút cao so với lắc 100 vòng/phút - Khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến sinh khối Lựa chọn nhiệt độ 300C nhiệt độ để thu sinh khối tốt Bacillus clausii Kiên nghị: - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện, môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng đến sinh khối - Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ, môi trường dinh dưỡng đến việc tạo bào tử download by : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ môn Vi sinh – Sinh học, Trường Đại Học Dược Hà Nội (2007), Vi sinh vật học, Hà Nội, tr 22– 24 [1] Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ Enzym, Nhà xuất Đại học quốc gia Thành Phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Bích Ngọc (2011), Khảo sát điều kiện ni cấy vi khuẩn Bacillus clausii, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 06-11 Nguyễn Thị Hiền (2012), Khảo sát khả nẳng hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus clausii, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 07-12 Trần Thu Hoa (2002), Nghiên cứu khả dung bào tử Bacillus subtilis tái tổ hợp làm nguyên liệu thuốc chủng ngừa qua niêm mạc, Luận án tiến sĩ Dược học, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, tr.33- 35 Tiếng Anh A.A Denizci, D Kazan, E.C.A Abeln, and A Erarslan Newly isolated Bacillus clausii GMBAE 42: an alkaline protease producer capable to grow under higly alkaline conditions Journal of Applied Microbiology 2004 Volume 96 p 320–327 N K Asha Devil, K Balakrishan, R Gopal and S Padmavathyl (2008), “Bacillus clausii MB9 from the east coast regions of India: Isolation, biochemical characterization an antimicrobial potentials”, Current science, vol 95, pp 627-635 Dilek Kazan Aziz Akın Denizci and Mine N Kerimak Oner Altan Erarslan (2005), “Purification and characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE 42”, Microbiol Biotechnol, vol 32, pp 335–344 download by : skknchat@gmail.com C Ganesh Kumar, Han-Seung Joo, Yoon-Mo Koo, Seung R Paik and Chung-Soon Chang (2004), “Thermostable alkaline protease from a novel marine haloalkalophilic Bacillus clausii isolate”, World Journal of Microbiology & Biotechnology, vol 20, pp 351–357 10 Hatsuo Aoki and Ralph A Slepecky (1973), “Inducement of a Heat Resistance in Bacillus fastidiosus Spores by Manganuos Ions”, Journal of bacteriology, pp 137-143 11 Kageyama Y, Takaki Y, Shimamura S, Nishi S, Nogi Y, Uchimura K, Kobayashi T, Hitomi J, Ozaki K, Kawai S, Ito S, and Horikoshi K Intragenomic diversity of the V1 regions of 16S rRNA genes in high-alkaline protease-producing Bacillus clausii spp Extremophiles 2007 12 Maria R Spinosa, Tiziana Braccini, Ezio Ricca, Maurilio De Feliceb, Lorenzo Morelli, Gianni Pozzi, Marco R Oggioni (2000), “On the fate of ingested Bacillus spores”, Res Microbiol, vol 151, pp 361-368 13 Marseglia GL, Tosca M, Cirillo I, et al (March 2007) "Efficacy of Bacillus clausii spores in the prevention of recurrent respiratory infections in children: a pilot study" Ther Clin Risk Manag (1): 13–7 14 Nicholson, W.L and P Setlow (1990), “Sporulation, germination, and outgrowth”, pp 391 – 450 15 Preben Nielsen, Dagmar Fritze and Fergus G Priest (1995), “Phenetic diversity of alkaliphilic Bacillus strains: proposal for nine new species”, Microbiology, vol 141, pp 1745-1761 16 Rosa Lippolis, Antonio Gnoni, Anna Abbrescia, Damiano Panelli, Stefania Maiorano, Maria Stefania Paternoster, Anna Maria Sardanelli, Sergio Papa, Antonio Gaballo (2011), “Comparative proteomic analysis of four download by : skknchat@gmail.com Bacillus clausii strains: Proteomic expression signature distinguishes protein profile of the strains”, Journal of proteomics, pp - 10 17 S Yazdany and K B Lashkari (1975), “Effect of pH on sporulation of Bacillus stearothermophilus”, Appl Environ Microbiol, Vol 30(1), pp 1-3 18 Seyedeh Faranak Ghaemi Oskouie, Fatemeh Tabandeh, Bagher Yakhchali, Fereshteh Eftekhar (2008), “Response surface optimization of medium composition for alkaline protease production by Bacillus clausii”, Biochemical Engineering Journal, vol 39, pp 37–42 19 Shirai, T., A Suzuki, T Yamane, T Ashida, T Kobayashi, J Hitomi, and S Ito High-resolution crystal structure of M-protease: phylogeny aided analysis of the high-alkaline adaptation mechanism Protein Eng 1997 Volume 10 p 627-634 download by : skknchat@gmail.com ... để thu sinh khối cho thí nghiệm 3.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện cấp khí nhiệt độ để thu sinh khối dạng bào tử Bacillus clausii so sánh với Bacillus subtilis 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng chế độ cấp. .. ảnh hưởng điều kiện cấp khí nhiệt độ để thu sinh khối dạng bào tử Bacillus clausii so sánh với Bacillus subtilis 2.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng chế độ cấp khí lên khả tăng sinh khối Bacillus clausii... ? ?Khảo sát ảnh hưởng điều kiện cấp khí để thu sinh khối dạng bào tử vi khuẩn Bacillus clausii” thực nhằm giải mục tiêu: - Xây dựng đường cong sinh trưởng Bacillus clausii - Khảo sát ảnh hưởng điều