(LUẬN văn THẠC sĩ) khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối dưới dạng bào tử của bacillus clausii​

TỔNG QUAN

Vi khu ẩn Bacillus

1.1.1 Giới thiệu về chi Bacillus

Bacillus, có nguồn gốc từ tiếng Latinh nghĩa là "hình que", thường được gọi là trực khuẩn Chi Bacillus bao gồm nhiều loài khác nhau đã được xác định và nghiên cứu.

Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus globigii, Bacillus natto, Bacillus clausii [15]

Chi Bacillus có sự đa dạng về loài, cho phép trực khuẩn này tồn tại và được phân lập trong nhiều môi trường khác nhau, bao gồm đất, nước, không khí, côn trùng và con người.

 Theo như Bergey’s manual of Systematic of Bacteriology 2 nd edition,

2004 thì chi Bacillus thuộc họ Bacillaceae là một trong 4 họ thuộc bộ

Bacillales, lớp Bacilli, ngành Firmicutes trong giới vi khuẩn

 Việc phân loại vi khuẩn theo hình thái và sinh lý được hoàn thiện bằng việc giải trình tự gen 16S r.ARN Theo phương pháp này người ta thấy

Bacillus có mối quan hệ họ hàng với các vi khuẩn không hình thành nội bài tử như Enterococcus, Lactobacillus và Streptococcus ở cấp phân loại bộ, đồng thời cũng liên quan đến Literia và Staphylococcus ở cấp phân loại họ.

 Chi Bacillus bao gồm trên 400 loài (476 loài)

1.1.3 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus là loại vi khuẩn hình que, thường thuộc loại Gram dương, có khả năng di động và hô hấp cả hiếu khí lẫn kỵ khí Đặc điểm nổi bật của chúng là phản ứng catalase dương tính và khả năng sử dụng oxy làm chất nhận electron trong quá trình trao đổi chất.

Bacillus có khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ đơn giản như đường, acid amin và acid hữu cơ để phát triển và dinh dưỡng Trong một số trường hợp, chúng có thể lên men carbohydrate thông qua chuỗi phản ứng phức tạp, tạo ra glycerol và glutadiol.

 Phần lớn Bacillus sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 30- 45ºC, pH khác nhau, dao động từ 2-11

 Khả năng hình thành bào tử là một trong những đặc điểm quan trọng của chi Bacillus

1.1.4 Bào tử và khả năng hình thành bào tử

Bào tử của chi Bacillus được Ferdinand Cohn mô tả lần đầu vào năm 1872 trong nghiên cứu về Bacillus subtilis, và sau đó được Robert Koch nghiên cứu trong mầm bệnh than do Bacillus anthracis vào năm 1976.

Hình 1.1 Bào tử Bacillus subtilis Hình 1.2 Bào tử Bacillus anthracis

Bào tử vi khuẩn có hình dạng cầu hoặc elip, kích thước từ 0,8 đến 1,4 micromet, là trạng thái nghỉ của vi khuẩn trong giai đoạn sinh trưởng khi gặp điều kiện sống không thuận lợi Khi môi trường trở nên thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành tế bào sinh dưỡng.

 Sự hình thành nội bào tử qua các bước:

- Trong tế bào sinh dưỡng ADN được phân chia thành nhiễm sắc thể (chromosom) riêng biệt và màng tế bào chất lấn sâu vào phân chia tế bào

- ADN được bao bọc hoàn toàn bằng màng tế bào chất, thành bào tử (nha bào) được hình thành và một phần vỏ cũng được hoàn thành

- Vỏ bào tử được hình thành đầy đủ bao quanh ADN

- Bào tử chín và được giải phóng ra ngoài tế bào [1]

Hình 1.3 Quá trình hình thành bào tử của Bacillus clausii

Quá trình hình thành bào tử là một quá trình phức tạp, kéo dài từ 6 đến 8 giờ, nhằm tạo ra bào tử có cấu trúc bền vững, có khả năng chịu đựng các điều kiện khắc nghiệt.

 Đặc điểm bào tử vi khuẩn:

Hình 1.4 Cấu tạo bào tử

Cấu trúc bào tử bao gồm nhiều lớp vỏ bền vững, bao quanh vùng lõi chứa ADN Các lớp bao bọc này, bao gồm màng bào tử, thành bào tử, vỏ bào tử, và áo bào tử với hai lớp áo trong và áo ngoài, chiếm đến 50% thể tích của bào tử.

Sự phát triển của áo bào Áo bào tử Bào tử tự do

Tế bào mẹ Áo trong bào tử

Màng tế bào Thành tế bào

Lõi Màng ngoài Áo ngoài bào tử

- Vỏ bao chứa thành phần hóa học là protein, hydratcarbon, lipid, peptidoglycan và calci dipicolinat

Lõi bào tử có hàm lượng nước rất thấp và chứa calci dipicolinat, một chất quan trọng mà sẽ bị mất khi bào tử nảy mầm Bên cạnh đó, bào tử còn chứa nhiều enzym ở dạng không hoạt động, những enzym này chỉ bắt đầu hoạt động khi bào tử nảy mầm.

Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu [6]

1.1.5 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus

Trong chi Bacillus, hai loài nguy hiểm cho con người là Bacillus anthracis, tác nhân gây bệnh than, và Bacillus cereus, nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Tuy nhiên, vi khuẩn Bacillus cũng có nhiều ứng dụng hữu ích trong đời sống hàng ngày.

 Trong nông, lâm, ngư nghiệp :

Chế phẩm diệt côn trùng như bọ cánh cứng, bướm, ruồi và muỗi được chế tạo từ Bacillus thuringiensis và Bacillus popiliae, nhờ khả năng xâm nhập vào cơ thể côn trùng và sản sinh nội độc tố Những chế phẩm sinh học này có hiệu quả cao trong việc tiêu diệt sâu hại, đồng thời ít gây ô nhiễm môi trường.

Chế phẩm sinh học từ các loài Bacillus subtilis, Bacillus megatherium và Bacillus licheniformis (Biochie) được ứng dụng hiệu quả trong xử lý nước nuôi thủy sản, giúp giảm lượng bùn hữu cơ và cải thiện chất lượng môi trường nước.

Sản phẩm từ Bacillus subtilis hỗ trợ cây trồng bằng cách bổ sung dinh dưỡng cho đất thông qua chu kỳ cacbon và chu kỳ nitơ của vi sinh vật, đồng thời giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh cho cây.

- Chất tẩy rửa: sử dụng enzym protease pH kiềm

 Trong dược phẩm, thực phẩm chức năng:

- Tạo ra các chế phẩm probiotic chống loạn khuẩn đường ruột, nhất là sau khi sử dụng kháng sinh dài ngày

Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng một chủng Bacillus đơn độc, như Biosubtyl II chứa Bacillus subtilis từ công ty vắc xin và sinh phẩm số 2, hoặc kết hợp Bacillus với các loài vi khuẩn có lợi khác, ví dụ như Bio-acimin.

Gi ới thiệu về Bacillus clausii

1.2.1 Đặc điểm sinh thái sinh sinh lý của Bacillus clausii

- Đặc điểm phân loại: Bacillus clausii thuộc

Bacillus clausii chủ yếu phân bố ở nhiều nơi nhưng chủ yếu là trong đất, có thể là vườn (Bacillus clausii KSM-K16, Bacillus clausii DSM8716,

Bacillus clausii, một loại vi khuẩn quan trọng, có thể được tìm thấy trong nhiều môi trường khác nhau như đất và nước Chẳng hạn, Bacillus clausii DSM 9784 được phân lập từ đất sét, trong khi Bacillus clausii MB được phát hiện trong mẫu nước vùng biển phía đông Ấn Độ Ngoài ra, vi khuẩn này cũng tồn tại trong bùn, cho thấy sự đa dạng và khả năng thích nghi của chúng trong các hệ sinh thái khác nhau.

Bacillus clausii là vi khuẩn Gram dương, có hình dạng que đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi, với khả năng di động và hình thành bào tử oval.

Bacillus clausii cú kớch thước chiều rộng 1-2àm, chiều dài 5àm [9]

Bacillus clausii có cấu trúc gen dạng vòng tròn với tổng cộng 4.303.871 nucleotide, bao gồm 4.204 gen, trong đó có 4.096 gen mã hóa protein và 96 gen mã hóa RNA.

 Các nucleotid loại GC trong ADN của Bacillus clausii chiếm tỷ lệ cao nhất so với các Bacillus khác: chiếm 44% với chủng KSM- K16 và chiếm tới 49% với chủng GMBAE 42 [8], [18]

Nhu cầu oxy: Bacillus clausii là vi khuẩn hiếu khí do đó trong quá trình nuôi cấy cần có sự cấp khí

Về nhiệt độ: nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là từ 15-50 o C Mỗi chủng có nhiệt độ tối ưu riêng như: Bacillus clausii DSM 8716 có nhiệt độ tối ưu là

30 o C, chủng Bacillus clausii KSM-K16 có nhiệt độ tối ưu là 40 o C, Bacillus clausii ATCC 31084 có nhiệt độ tối ưu là 37 o C…[6], [11]

Về pH: khoảng pH nuôi cấy thích hợp là từ 7-10,5 Chủng Bacillus claussii KSM-K16 có pH tối ưu là 9,0 [11]

Về dinh dưỡng: Bacillus clausii có thể sử dụng nhiều nguồn carbohydrat khác nhau như: glucose, galactose, mannose, sorbitol, 2-ketogluconat…; nguồn nitơ, phospho, các nguyên tố vi lượng…

Trong môi trường lỏng, Bacillus clausii có thể tồn tại dưới dạng chuỗi hoặc tế bào đơn lẻ Khi được nuôi cấy trong môi trường đặc, vi khuẩn này tạo ra các khuẩn lạc màu trắng với viền hơi nhăn.

Hình 1.5 Bacillus clausii trên môi trường đặc

Vi khuẩn Bacillus clausii có khả năng thủy phân casein, gelatin và tinh bột, nhưng không thể thủy phân pullulan, Tween 20, 40 hoặc 60 Đồng thời, Bacillus clausii cũng cho phản ứng oxidase và catalase dương tính, đồng thời có khả năng khử nitrat thành nitrit.

- Bào tử và khả năng tạo bào tử

Trong điều kiện khắc nghiệt, Bacillus clausii phát triển nội bào tử (endospore) với cấu trúc nhiều lớp vỏ bọc bền chắc, tương tự như các loài Bacillus khác Bào tử của Bacillus clausii có hình cầu, kích thước khoảng 1,01±0,13 x 0,57±0,05 μm.

Hình 1.6 Bào tử Bacillus clausii dưới kính hiển vi điện tử

1.2.2 Ứng dụng của Bacillus clausii

Bacillus clausii có hai ứng dụng quan trọng đó là: sản xuất enzym và sản xuất chế phẩm probiotic

- Sản xuất enzym từ Bacillus clausii

Bacillus clausii có khả năng sản xuất nhiều loại enzym quan trọng, trong đó protease nổi bật nhất, chiếm gần 60% tổng doanh số enzym toàn cầu Protease được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như chất tẩy rửa, công nghiệp thuộc da và thực phẩm Ngoài ra, enzym này còn có khả năng thủy phân protein dạng sợi như sừng, lông và tóc.

- Sản xuất chế phẩm probiotic từ bào tử Bacillus clausii

Bào tử Bacillus clausii là thành phần chính trong sản phẩm probiotic Enterogermina của Sanofi - Aventis, có tác dụng hiệu quả trong việc điều trị tiêu chảy ở trẻ em Sản phẩm này cung cấp bào tử vi khuẩn Bacillus clausii dưới hai dạng: huyền dịch trong ống nhựa (2 tỷ bào tử trong 5ml) và viên nang (2 tỷ bào tử trong 1 viên nang) Enterogermina được chỉ định cho các trường hợp tiêu chảy ở trẻ em.

• Ðiều trị và phòng ngừa rối loạn khuẩn chí đường ruột và bệnh lý kém hấp thu vitamin nội sinh

• Ðiều trị hỗ trợ để phục hồi hệ khuẩn chí đường ruột bị ảnh hưởng khi dùng thuốc kháng sinh hoặc hóa trị liệu

• Rối loạn tiêu hóa cấp và mãn tính ở trẻ em do nhiễm độc hoặc rối loạn khuẩn chí đường ruột và kém hấp thu vitamin

Bacillus clausii có khả năng kháng kháng sinh, vì vậy khi sử dụng kháng sinh, nên uống chế phẩm này xen kẽ với thời gian dùng thuốc Chế phẩm dạng bào tử vi khuẩn mang lại nhiều lợi ích, cho phép vi khuẩn sống sót cao qua dạ dày và hiệu quả trong việc điều trị rối loạn tiêu hóa.

Enterogermina contains four strains of Bacillus clausii, each resistant to specific antibiotics: strain O/C is resistant to chloramphenicol, N/R to novobiocin and rifampicin, T to tetracycline, and SIN to streptomycin and neomycin.

Ngoài Enterogermina chứa bào tử Bacillus clausii còn một số chế phẩm khác chứa Bacillus clausii như: Progemila, Erceflora, Bazivic, Probacin, Enterum

Hình 1.8 Chế phẩm Erceflora Hình 1.9 Chế phẩm Bazivic

Các phương pháp nuôi cấy

Phương pháp nuôi cấy nấm mốc rất hiệu quả nhờ vào khả năng phát triển nhanh và mạnh, giúp giảm thiểu tình trạng tạp nhiễm Khi nấm mốc phát triển, chúng bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn và các khuẩn ty sẽ xâm nhập sâu vào môi trường đã được tiệt trùng và làm ẩm Đối với một số ứng dụng đặc biệt, vi sinh vật được nuôi trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (để sản xuất tương) hoặc hạt đậu tương (đậu tương lên men - misô) đã được nấu chín, kết hợp với hạt cốc sống để làm men thuốc bắc, men dân tộc, và tương.

Người ta thường sử dụng cám mì, cám gạo và ngô mảnh kết hợp với trấu làm chất phụ gia Cám và trấu có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng và giúp tạo độ xốp cao, đồng thời không chứa các chất gây hại cho sự phát triển của nấm mốc Tỉ lệ các chất phụ gia cần đảm bảo rằng hàm lượng tinh bột trong nguyên liệu không được thấp hơn 20%, và có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ.

((NH4)2SO4, (NH4)2CO3), photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu [2]

Vi sinh vật thường được nuôi cấy trong môi trường lỏng với tinh bột là nguồn cơ chất chính, mặc dù một số ít giống sử dụng đường glucose hoặc saccharose Trong một số trường hợp, tinh bột được đường hóa sơ bộ trước khi thanh trùng, tạo ra maltose, một chất cảm ứng tốt giúp giảm độ nhớt của môi trường, từ đó dễ dàng cho quá trình khuấy trộn và sục khí Để đảm bảo hiệu quả, phương pháp nuôi cấy chìm cần được thực hiện với sự vô trùng tuyệt đối trong tất cả các khâu, bao gồm vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy và không khí cung cấp.

NGUYÊN LI ỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên li ệu, hóa chất, thiết bị

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.2 Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Thiết bị Xuất xứ Thiết bị Xuất xứ

Tủ cấy Sony clean bench (Nhật) Tủ lạnh Toshiba (Nhật)

Máy ly tâm Rotofix (Đức) Tủ sấy Memmert (Đức)

Nồi hấp ALP (Nhật) Tủ lắc Bioshake (Đức) Đầu côn, cân kỹ thuật, bình nón, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, que trang, giấy lọc

Môi trường canh thang Môi trường thạch thường

Hóa chất Khối lượng (g) Hóa chất Khối lượng (g)

Nước máy vừa đủ 100 ml Thạch bột 2,0

Nước máy vừa đủ 100 ml

N ội dung nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis 2.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí lên khả năng tăng sinh khối Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis

2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tăng sinh khối Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis

2.3.1 Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina

Pha 50 ml môi trường canh thang trong bình nón dung tích 250ml, đậy bằng nút bông không thấm nước, hấp tiệt trùng ở 1atm trong vòng 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng Tiến hành cấy giống Bacillus clausii từ chế phẩm Enterogermina vào bình nón trong tủ cấy vô trùng Nuôi cấy trong máy lắc ở

Nhiệt độ 37°C và tốc độ lắc 150 vòng/phút được duy trì trong 24 giờ, sau đó vi khuẩn phát triển và làm đục môi trường Đối với Bacillus subtilis, tiến hành cấy giống từ thạch nghiêng và nuôi cấy tương tự như với Bacillus clausii.

2.3.2 Giữ giống trên thạch nghiêng

Pha môi trường thạch, đun sôi để đồng nhất các thành phần, chia vào ống nghiệm 6ml, nút kín và hấp tiệt trùng ở 1atm trong 15 phút Sau khi nguội, đặt ống nghiệm nghiêng và sử dụng que cấy vô trùng để cấy giống Bacillus clausii theo hình ziczac trong tủ cấy vô trùng, ủ ở 37°C trong 24h Khi khuẩn lạc mọc, cất giống vào tủ lạnh và định kỳ 2 tháng cấy truyền giống để duy trì hoạt tính vi khuẩn Quy trình tương tự cũng được áp dụng cho Bacillus subtilis.

2.3.3 Chuẩn bị dịch nhân giống

Chuẩn bị 50ml môi trường canh thang trong bình nón dung tích 250ml

Hấp tiệt trùng ở áp suất 1atm trong 15 phút, sau đó để nguội Sử dụng đầu côn đã được hấp tiệt khuẩn để hút 5ml từ bình chứa Bacillus clausii và cấy vào môi trường Đặt trong máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 37 độ C trong 24 giờ Đối với Bacillus subtilis, thực hiện quy trình tương tự như với Bacillus clausii.

2.3.4 Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng xác định lượng sinh khối ướt trong dịch lên men của Bacillus clausii tại thời điểm khác nhau

Chuẩn bị 50ml môi trường lên men canh thang, hấp tiệt trùng ở 1atm trong 15 phút Để nguội đến nhiệt độ phòng Cấy 5ml dịch nhân giống

Bacillus clausii được đưa vào môi trường đã chuẩn bị và lắc ở 37°C với tốc độ 150 vòng/phút Mẫu dịch lên men được lấy tại các thời điểm 16h, 24h, 40h, 48h, 64h, 72h, 88h và 96h, sau đó ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 - 20 phút Khối lượng cặn thu được sẽ được cân để xác định lượng sinh khối, từ đó xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii.

2.3.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí lên khả năng tăng sinh khối

Chuẩn bị 50ml môi trường lên men canh thang và hấp tiệt trùng ở 1atm trong 20 phút Cấy 5ml dịch nhân giống Bacillus clausii vào môi trường đã chuẩn bị và lắc ở 37 độ C với ba tốc độ khác nhau: 100, 150 và 200 vòng/phút trong máy lắc Sau 24 giờ, ly tâm dịch lên men với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15-20 phút để thu cắn Xác định lượng sinh khối ướt bằng cách cân cắn thu được, thực hiện mỗi thí nghiệm ba lần để lấy kết quả trung bình và so sánh với các mẫu cấy Bacillus subtilis.

2.3.6 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ lên khả năng tăng sinh khối

Chuẩn bị 50ml môi trường lên men canh thang và hấp tiệt trùng ở áp suất 1atm trong 20 phút Sau đó, cấy 5ml dịch nhân giống Bacillus clausii vào môi trường đã chuẩn bị, lắc ở hai nhiệt độ 30°C và 37°C với cùng một tốc độ trong máy lắc Sau 24 giờ, tiến hành ly tâm dịch lên men để thu cặn.

Quy trình thí nghiệm bao gồm quay ở tốc độ 4000 vòng/phút trong khoảng 15 - 20 phút để xác định lượng sinh khối bằng cách cân cặn thu được Mỗi thí nghiệm được thực hiện ba lần để lấy kết quả trung bình, sau đó tiến hành so sánh với các mẫu cấy Bacillus subtilis.

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Xây d ựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii

Xây dựng đường cong sinh trưởng, xác định thời điểm thu sinh khối của

Bacillus clausii cho các thí nghiệm tiếp theo

Trong nghiên cứu này, 50ml môi trường canh thang được sử dụng để hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina, nuôi trong máy lắc ở 37°C với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ để thu được dịch nhân giống Sau đó, 5ml dịch nhân giống được cấy vào 50ml môi trường canh thang đã được hấp tiệt trùng và để nguội đến nhiệt độ phòng, tiếp tục nuôi cấy ở 37°C với cùng tốc độ lắc Tại các thời điểm khác nhau (16h, 24h, 40h, 48h, 64h, 72h, 88h, 96h), dịch lên men được ly tâm để thu sinh khối, từ đó cân sinh khối nhằm xây dựng đường cong sinh trưởng.

- Kết quả được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1

Bảng 3.1 Lượng sinh khối thu được của Bacillus clausii tại các thời điểm khác nhau

Lư ợn g sin h kh ối (g )

Hình 3.1 Sơ đồ biểu diễn đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii

Theo đường cong sinh trưởng, từ 16 đến 40 giờ, lượng sinh khối của B clausii tăng dần, đạt mức cao nhất là 1,10g tại 40 giờ, tăng hơn 12% so với 24 giờ Tuy nhiên, sau 40 giờ, lượng sinh khối bắt đầu giảm, đạt mức thấp nhất là 0,92g trong khoảng thời gian 88 – 96 giờ, giảm 6,5% so với 24 giờ Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Nguyễn.

Thị Bích Ngọc [3] ghi nhận sự gia tăng sinh khối nhanh chóng trong khoảng thời gian từ 24 đến 36 giờ đầu Đồng thời, theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hiền [4], bào tử bắt đầu hình thành sau 40 đến 48 giờ nuôi cấy trong môi trường lỏng tự nhiên, không bổ sung Mn 2+ và không qua xử lý nhiệt.

Nghiên cứu cho thấy rằng lượng sinh khối của Bacillus clausii bắt đầu giảm dần sau 40 giờ, điều này có thể được giải thích bởi đặc điểm hình thành bào tử của chúng.

Theo Nguyễn Thị Hiền [4], nếu áp dụng phương pháp xử lý phù hợp, có thể chuyển đổi tế bào sinh dưỡng thành bào tử với hiệu suất cao Vì vậy, nghiên cứu này tập trung khảo sát các điều kiện nhằm tối ưu hóa việc thu nhận lượng bào tử lớn nhất.

Kết quả thu được từ bảng 3.1 cho thấy lượng sinh khối lớn nhất đạt được sau 40 giờ, tuy nhiên sau thời gian này, một phần sinh khối đã chuyển thành bào tử So với lượng sinh khối tại 24 giờ, sự chênh lệch chỉ khoảng 12%, do đó, để tiết kiệm thời gian và môi trường dinh dưỡng, thời điểm 24 giờ được lựa chọn để thu sinh khối cho các thí nghiệm tiếp theo.

Kh ảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối dưới dạng bào tử của B a ci ll us cl au s ii v à s o s ánh v ới Ba ci l lu s subtilis

khối dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí lên khả năng tăng sinh khối Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis

Theo nhiều nghiên cứu đã công bố, Bacillus clausii thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí Đối với các vi sinh vật hiếu khí nói chung cũng như chi

Lưu lượng khí trong quá trình nuôi cấy Bacillus đóng vai trò quan trọng đối với sự sinh trưởng và phát triển của chúng Mục tiêu của các thí nghiệm là khảo sát ảnh hưởng của tốc độ cấp khí của máy lắc đến lượng sinh khối thu được trong quá trình lên men Bacillus clausii ở quy mô phòng thí nghiệm, nhằm thu được lượng bào tử tối đa và tạo ra khối lượng sinh khối lớn nhất.

Bacillus subtilis (là chủng vi khuẩn Bacillus phổ biến) tại cùng điều kiện.

Trong bình nón, 50ml môi trường canh thang được sử dụng để hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina theo phương pháp đã mô tả Quá trình nuôi cấy diễn ra trong máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ, từ đó thu được dịch nhân giống Sau đó, 5ml dịch nhân giống được cấy vào 50ml môi trường canh thang đã được hấp tiệt trùng và để nguội đến nhiệt độ phòng, từ đó lựa chọn điều kiện nhiệt độ cho các lô lên men.

37 0 C với tốc độ lắc khác nhau là 100, 150 và 200 vòng/phút trong thời gian

Sau 24 giờ lên men, tiến hành ly tâm dịch với tốc độ 4000 vòng/phút trong khoảng 15 - 20 phút theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.3.4 Để xác định lượng sinh khối ướt, cân cặn thu được sau quá trình ly tâm Thí nghiệm được thực hiện độc lập ba lần để đảm bảo độ chính xác của kết quả.

- Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.2

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng tăng sinh khối của

Tốc độ lắc (vòng/phút)

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn biến thiên lượng sinh khối của Bacillus clausii theo tốc độ lắc ở nhiệt độ 37 0 C

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy với tốc độ lắc tăng thì lượng sinh khối của

Bacillus clausii cũng tăng, lượng sinh khối đạt cực đại là 0,78g ở tốc độ lắc

Khi tăng độ cấp khí, sinh khối của Bacillus clausii cũng tăng theo, điều này phù hợp với đặc điểm sinh lý của vi khuẩn này và các nghiên cứu trước đây Mặc dù có sự tăng sinh khối khi so sánh giữa 150 vòng/phút và 200 vòng/phút, nhưng mức chênh lệch chỉ là 0,02g Do đó, chúng tôi quyết định chọn tốc độ lắc 150 vòng/phút cho các thí nghiệm tiếp theo.

Song song tiến hành thí nghiệm như trên, đối với Bacillus subtilis kết quả được được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.3

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng tăng sinh khối của

Tốc độ lắc (vòng/phút)

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn biến thiên lượng sinh khối của Bacillus subtilis theo tốc độ lắc ở nhiệt độ 37 0 C

Kết quả từ bảng 3.3 cho thấy rằng đối với Bacillus subtilis, ảnh hưởng của điều kiện khí tương tự như Bacillus clausii Khi tốc độ lắc tăng, sinh khối cũng tăng, đạt mức cao nhất tại chế độ lắc 200 vòng/phút với giá trị 1,05g Sự chênh lệch khối lượng sinh khối giữa chế độ cấp khí 200 vòng/phút và 100 vòng/phút là khá lớn, đạt 0,4g.

Kết quả so sánh sinh khối giữa Bacillus clausii và Bacillus subtilis ở các điều kiên lắc khác nhau tại 37 0 C được thể hiện ở bảng Bảng 3.4 và hình 3.4

Bảng 3.4 So sánh sinh khối giữa Bacillus clausii và Bacillus subtilis ở các tốc độ lắc khác nhau tại 37 0 C

Chênh lệnh lượng sinh khối giữa 2 chủng VSV (%)

100 vòng/phút 150 vòng/phút 200 vòng/phút

Lư ợng si nh khối (g)

Hình 3.4 Đồ thị so sánh sinh khối giữa Bacillus clausii và Bacillus subtilis ở các tốc độ lắc khác nhau tại 37 0 C

Theo đồ thị ở hình 3.4 so sánh tại cùng một tốc độ lắc, có thể thấy ở

Khi so sánh lượng sinh khối giữa Bacillus clausii và Bacillus subtilis, ở tốc độ 100 vòng/phút và 150 vòng/phút, Bacillus clausii cho thấy lượng sinh khối lớn hơn, mặc dù sự chênh lệch không đáng kể Tuy nhiên, ở tốc độ lắc 200 vòng/phút, Bacillus clausii lại giảm 34,60% so với Bacillus subtilis.

Đối với Bacillus clausii, khi thay đổi tốc độ cấp khí từ 100 đến 200 vòng/phút, lượng sinh khối không có sự biến thiên cao Sự khác biệt giữa tốc độ lắc 150 và 200 vòng/phút là không đáng kể, vì vậy tốc độ lắc 150 vòng/phút được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tăng sinh khối của

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tăng sinh khối của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis

Trong bình nón, 50ml môi trường canh thang được sử dụng để hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina theo phương pháp đã chỉ định Quá trình nuôi cấy diễn ra trong máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở 37°C trong 24 giờ để thu được dịch nhân giống Sau đó, 5ml dịch nhân giống được cấy vào 50ml môi trường canh thang đã được hấp tiệt trùng và làm nguội đến nhiệt độ phòng Nuôi cấy tiếp tục với tốc độ lắc 150 vòng/phút ở hai nhiệt độ 30°C và 37°C Cuối cùng, dịch được ly tâm sau 24 giờ lên men để thu cặn.

(ly tâm 4000 vòng/phút trong thời gian 15 – 20 phút) Xác định lượng sinh khối ướt bằng cách cân cắn thu được Thí nghiệm được tiến hành 3 lần độc lập

- Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.5

Bảng 3.5 Lượng sinh khối thu được ở nhiệt độ

Nhiệt độ Lượng sinh khối (g)

L ần 1 L ần 2 L ần 3 Trung Bình

Chênh lệnh lượng sinh khối giữa 2 nhiệt độ (%) 10,5

Hình 3.5 Đồ thị biến thiên lượng sinh khối của Bacillus clausii ở nhiệt độ 30 0 C và 37 0 C

Kết quả từ bảng 3.5 cho thấy rằng khối lượng sinh khối của Bacillus clausii sau 24 giờ nuôi cấy với tốc độ lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ 30°C cao hơn 10,5% so với ở 37°C Điều này cho thấy rằng nhiệt độ 30°C là điều kiện tối ưu cho sự phát triển của Bacillus clausii.

Kết quả thí nghiệm trên chủng Bacillus clausii DSM 8716 cho thấy nhiệt độ tối ưu để nuôi cấy là 30°C, giúp thu được sinh khối lớn nhất Đối với Bacillus subtilis, kết quả được trình bày chi tiết trong bảng 3.6 và hình 3.6.

Bảng 3.6 Lượng sinh khối thu được ở nhiệt độ

Nhiệt độ Lượng sinh khối (g)

L ần 1 L ần 2 L ần 3 Trung Bình

Chênh lệnh lượng sinh khối giữa 2 nhiệt độ (%) 28,3

Hình 3.6 Đồ thị biến thiên lượng sinh khối của Bacillus subtilis ở nhiệt độ 30 0 C và 37 0 C

Kết quả từ bảng 3.6 chỉ ra rằng lượng sinh khối của Bacillus subtilis thu được sau 24 giờ nuôi cấy với tốc độ lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ 30°C cao hơn 28,3% so với ở 37°C Điều này cũng tương tự với Bacillus clausii.

- So sánh khả năng tăng sinh khối ở tốc độ lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ

30 0 C và 37 0 C của Bacillus clausii và Bacillus subtilis

Bảng 3.7 So sánh khả năng tăng sinh khối ở nhiệt độ 30 0 C và 37 0 C của Bacillus clausii và Bacillus subtilis

Vi sinh vật Lượng sinh khối (g)

Chênh lệnh lượng sinh khối giữa 2 chủng VSV (%)

Theo bảng 3.7, ở nhiệt độ 37°C, lượng sinh khối của Bacillus clausii và Bacillus subtilis tương đương nhau với sự chênh lệch chỉ 2,7%, và cả hai đều có sinh khối thấp hơn so với ở nhiệt độ 30°C.

Bacillus clausii có lượng sinh khối thấp hơn Bacillus subtilis 13,1% Điều này cho thấy, ở nhiệt độ 37°C, khả năng phát triển của hai chủng vi sinh vật này tương đương Tuy nhiên, ở nhiệt độ 30°C, Bacillus clausii phát triển chậm hơn so với Bacillus subtilis.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Sau một thời gian làm thực nghiệm khoa học, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:

Nghiên cứu đã xác định được đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii từ 16h đến 96h, với lượng sinh khối tối đa đạt 1,10g tại 40h Tuy nhiên, sự chênh lệch về sinh khối giữa 40h và 24h không đáng kể Để tối ưu hóa thời gian và dinh dưỡng, thời điểm thu sinh khối cho các thí nghiệm đã được chọn là 24h.

 Khảo sát được ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ đến sinh khối của Bacillus clausii:

Khảo sát ảnh hưởng của các tốc độ lắc 100, 150 và 200 vòng/phút đến lượng sinh khối của Bacillus clausii cho thấy tốc độ lắc 150 vòng/phút là tối ưu, đạt được lượng sinh khối tương đương với tốc độ 200 vòng/phút và cao hơn so với tốc độ 100 vòng/phút.

- Khảo sát được nhiệt độ ảnh hưởng đến sinh khối Lựa chọn nhiệt độ

30 0 C là nhiệt độ để thu được sinh khối tốt nhất của Bacillus clausii

- Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện, môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng đến sinh khối.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, môi trường dinh dưỡng đến việc tạo bào tử

1 Bộ môn Vi sinh – Sinh học, Trường Đại Học Dược Hà Nội (2007), Vi sinh vật học, Hà Nội, tr 22– 24 [1]

2 Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ Enzym, Nhà xuất bản Đại học quốc gia Thành Phố Hồ Chí Minh

3 Nguyễn Thị Bích Ngọc (2011), Khảo sát điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus clausii, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 06-11

4 Nguyễn Thị Hiền (2012), Khảo sát khả nẳng hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus clausii, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 07-12