Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật ở cây tiêu sẻ (Piper nigrum L.) trồng tại huyện Chơn Thành và huyện Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước

Chín mươi dòng vi khuẩn có khả năng cố định nito, hòa tan phosphate được phân lập từ 40 mẫu đất vùng rễ của cây tiêu Sẻ trồng tại huyện Chơn Thành và huyện Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước. Trong đó, 43 dòng phát triển tốt trên cả 2 loại môi trường Burk’s không đạm và NBRIP chứa phosphate khó tan đã được lựa chọn để khảo sát định lượng khả năng cố định nito, hòa tan phosphate và tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng IAA.

Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC VI KHUẨN VÙNG RỄ KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG THỰC VẬT Ở CÂY TIÊU SẺ (PIPER NIGRUM L.) TRỒNG TẠI HUYỆN CHƠN THÀNH VÀ HUYỆN LỘC NINH, TỈNH BÌNH PHƯỚC Đỗ Thị Thùy Trâm*, Châu Kim Xuyến, Hà Bảo Sơn Trường Đại học Sài Gòn * Tác giả liên lạc: dothithuytram290495@gmail.com TĨM TẮT Chín mươi dịng vi khuẩn có khả cố định nito, hịa tan phosphate phân lập từ 40 mẫu đất vùng rễ tiêu Sẻ trồng huyện Chơn Thành huyện Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước Trong đó, 43 dịng phát triển tốt loại môi trường Burk’s không đạm NBRIP chứa phosphate khó tan lựa chọn để khảo sát định lượng khả cố định nito, hòa tan phosphate tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng IAA Năm dòng vi khuẩn (LĐ11, LĐ5, LĐ8, TT2, LĐ6) cố định nito cao (3,61-5,2 mg/L NH4+), dòng (LĐ8, ML42, LĐ3, ML63, LĐ5) hòa tan phosphate cao (23,25-35,14 mg/L P2O5) dòng (CT1, CT2, LT2, LT4, LT6) tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng IAA cao (2,86-3,22 mg/L IAA) Căn kết định lượng, dòng chọn để định danh theo phương pháp khối phổ MALDI Kết cho thấy dòng CT6 lồi Bacillus weihenstephanensis, dịng ML42 Bacillus megaterium, dòng LĐ8 Bacillus cereus dòng TT6.1 Staphylococcus warneri Từ khóa: Cố định nito, hịa tan phosphate, IAA, vi khuẩn đất vùng rễ, tiêu Sẻ ISOLATION AND SELECTION OF PLANT GROWTH-PROMOTING RHIZOBACTERIA FROM PIPER NIGRUM L RHIZOSPHERE SOIL IN CHON THANH DISTRICT AND LOC NINH DISTRICT, BINH PHUOC PROVINCE Do Thi Thuy Tram*, Chau Kim Xuyen, Ha Bao Son Sai Gon University * Corresponding author: dothithuytram290495@gmail.com ABSTRACT Ninety isolates with the ability of fixing nitrogen and phosphorus solubility were isolated from 40 rhizosphere soil of Piper nigrum L in Chon Thanh district and Loc Ninh district, Binh Phuoc province Among them, 43 isolates grown high on media (Burk’s N-free and NBRIP) have been chosen to continue examining the ability to synthesize IAA Five isolates (LĐ11, LĐ5, LĐ8, TT2, LĐ6) had high abilities of nitrogen fixation (3,61-5,2 mg/L NH4+), isolates (LĐ8, ML42, LĐ3, ML63, LĐ5) had high abilities of phosphorus solubilization and isolates (CT1, CT2, LT2, LT4, LT6) synthesized high IAA levels (2,86-3,22 mg/L IAA) From which, 15 isolates have been chosen to identify in MALDI mass spectrometry The results showed that CT6 isolate was Bacillus weihenstephanensis, ML42 isolate was Bacillus megaterium, LĐ8 isolate was Bacillus cereus and TT6.1 isolate was Staphylococcus warneri Keywords: Nitrogen fixation, phosphorus solubility, IAA, rhizosphere bacteria, Piper nigrum L TỒNG QUAN Hồ tiêu vừa loại gia vị sử dụng phổ biến ẩm thực vừa dùng làm thuốc chữa bệnh Nhu cầu tiêu thụ hạt tiêu giới không ngừng gia tăng, tiêu thích hợp với khí hậu vùng nhiệt đới Do vậy, hồ tiêu nông sản xuất quan trọng số nước châu Phi, châu Mỹ châu Á, có Việt Nam Từ năm 2000 đến nay, Việt Nam liên tục quốc gia sản xuất xuất hồ tiêu lớn giới, đến 100 quốc gia khác Đặc biệt, năm 2014, hồ tiêu Việt Nam chiếm lĩnh khoảng 58% thị phần xuất quốc tế Có thể nói, nước ta nắm quyền chi phối ngành hàng nơng sản tồn cầu, giúp đời sống người dân cải thiện đáng kể Nước ta có vùng trồng hồ tiêu trọng điểm, có tỉnh Bình Phước Để tăng cường dinh dưỡng cho đất trì 442 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 sản lượng hồ tiêu, người dân thường có thói quen sử dụng phân bón hóa học Việc lạm dụng phân bón hóa học gây nhiều bất lợi cho trồng, hệ sinh thái sức khỏe người Do vậy, ngày sản xuất sử dụng phân bón sinh học có phân vi sinh nhằm bổ sung thay phân bón hóa học biện pháp quan tâm nhiều quốc gia Các nhà khoa học khơng ngừng tìm kiếm ứng dụng chủng vi khuẩn kích thích tăng trưởng thực vật (Plant Growth Promoting Bacteria - PGPB), có vi khuẩn vùng rễ, để sản xuất chế phẩm sinh học bón cho trồng “Vi khuẩn vùng rễ” (rhizopheric bacteria) thuật ngữ nhằm mô tả vi khuẩn đất có khả cạnh tranh tốt tiến trình dịng hóa (colonization) rễ kích thích tăng trưởng thực vật, từ làm giảm tỷ lệ mắc bệnh Kloepper Schroth (1981) gọi vi khuẩn vùng rễ có lợi “vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật” (Plant Growth Promoting Rhizobacteria - PGPR) PGPR có khả xâm chiếm rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật thông qua hoạt động trực tiếp thông qua việc kiểm soát sinh học bệnh hại trồng Sự thúc đẩy tăng trưởng thực vật trực tiếp thơng qua cố định đạm sinh học (Biological Nitrogen Fixation – BNF), hòa tan phosphate, sản xuất phytohormone, sản xuất siderophore, ức chế sinh tổng hợp ethylene nhằm đáp ứng với stress sinh học phi sinh học, v.v , hay gián tiếp thông qua giảm bớt ngăn ngừa tác động có hại nhiều sinh vật gây bệnh cách tạo chất đối kháng gây đề kháng với mầm bệnh Sau 24 – 48 giờ, chọn khuẩn lạc rời, nằm đường cấy, tiếp tục cấy chuyển quan sát kính hiển vi trường NBRIP Burk’s đặc không N để chọn lọc dịng vi khuẩn có hai khả cố định nito hòa tan phosphate Chuyển dòng vào ống nghiệm chứa môi trường đặc trữ 4oC Đã có nhiều quốc gia Ấn Độ, Nam Phi, Malaysia nghiên cứu vi khuẩn kích thích tăng trưởng thực vật hồ tiêu chưa thấy có nghiên cứu Việt Nam Kỷ yếu khoa học ĐỐI TƯỢNG VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu nghiên cứu phân lập, tuyển chọn vi khuẩn vùng rễ có khả cố định nito, hịa tan phosphate, tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng IAA tiêu Sẻ (Piper nigrum L.) trồng huyện Chơn Thành huyện Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước, hướng tới nghiên cứu chọn lọc dịng có tiềm ứng dụng vào sản xuất phân bón vi sinh PHƯƠNG PHÁP Mẫu đất Các mẫu đất vùng rễ tiêu Sẻ (khoảng kg đất bao gồm tiêu) thu thập từ vườn huyện (Chơn Thành, Lộc Ninh) Bình Phước Đất vùng rễ lớp đất bao quanh rễ (< cm) mẫu tiêu Mỗi mẫu đất bao quanh rễ xử lý theo phương pháp “Lắc” (Shaking) (Luster and Finlay, 2006) Mỗi mẫu “mẫu đơn” sau gộp chung tạo thành “mẫu tổ hợp” theo vườn (TCVN 75282:2005) Có tổng cộng 40 mẫu, mẫu bảo quản lọ thủy tinh 5oC dùng để tiến hành phân lập vi khuẩn vòng 10 ngày Phân lập vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật (PGPR) Cân g đất vùng rễ tiêu Sẻ qua xử lý nghiền mịn, cho vào bình tam giác chứa 99 mL nước vô trùng Lắc 12 với tốc độ 200 rpm (vòng/phút) giúp cho hạt đất rời vi khuẩn phân tán nước Sau lắc, để lắng khoảng thu lấy phần dịch cho vào ống nghiệm vô trùng bảo quản lạnh để sử dụng ngày Lấy 30 L dịch huyền phù trang môi trường thạch đĩa Burk’s không N môi trường NBRIP Sau 24 – 48 giờ, tiến hành quan sát Nếu thấy xuất khuẩn lạc, dùng que cấy khử trùng cấy chuyển vi khuẩn sang môi trường thạch đĩa tương ứng theo phương pháp cấy ria 443 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Định lượng nito, phosphate hòa tan, IAA dòng phân lập Các dòng vi khuẩn phân lập loại môi trường đo khả cố định nito phương pháp so màu bước sóng 640 nm (OD640nm) (Solarzano, 1969), đo khả hịa tan phosphate phương pháp so màu bước sóng 880nm (OD880nm) (Murphy Riley, 1962) Từ kết định lượng, tuyển chọn 43 dịng vi khuẩn có khả cố định nito, hòa tan phosphate cao tiếp tục định lượng khả tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng IAA phương pháp so màu bước sóng 530nm (OD530nm) Gordon Weber, 1951) Kết đo OD thay vào phương trình đường chuẩn, từ suy hàm lượng (nito, phosphate hòa tan, IAA) sinh dung dịch Định danh vi khuẩn Căn kết định lượng khả cố định nito, hòa tan phosphate, tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng IAA chọn số dòng trội Gửi mẫu để định danh phương pháp khối phổ MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Giải hấp laser hỗ trợ chất nền) Mẫu phân tích trộn với chất chứa phân tử hữu nhỏ có khả hấp thụ lượng ánh sáng bước sóng định Hỗn hợp mẫu chất đưa lên khay bay tạo thành hạt tinh thể bám với peptid Dưới tác dụng nguồn lượng laser Kỷ yếu khoa học cực lớn chiếu vào làm cho chất (axit yếu) hấp thụ lượng, làm nóng lên nhanh chóng gây thăng hoa cục tinh thể chất từ pha rắn vào pha khí Mẫu hấp thụ photon lượng vào hệ thống khối phổ TOF Sự phân tách phân tử dựa khối lượng, ion lớn có thời gian bay dài phân tử nhỏ có thời gian bay ngắn Detector nơi tiếp nhận ion biến thành tín hiệu điện để ghi nhận thành tín hiệu phổ khối Số liệu phân tích thống kê phần mềm SPSS22 với mức tin cậy 95%, lập ANOVA, kiểm định Duncan để so sánh khác biệt trị số trung bình nghiệm thức KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chín mươi dịng vi khuẩn có khả cố định nito, hòa tan phosphate phân lập từ 40 mẫu đất vùng rễ tiêu Sẻ trồng huyện Chơn Thành huyện Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước Trong đó, 47 dịng vốn phân lập từ mơi trường NBRIP 43 dịng vốn phân lập từ môi trường Burk’s Hầu hết khuẩn lạc thu có màu trắng đục trắng trong, số dòng xuất sắc tố vàng Đa số khuẩn lạc có dạng bìa ngun, độ mơ, đường kính khuẩn lạc dao động từ 0,1 – cm (Hình 1), tế bào hình cầu que ngắn (Hình 2), phần lớn chuyển động Hình Hình thái khuẩn lạc số dòng (isolate) vi khuẩn phân lập 444 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học Hình “Kéo sợi KOH” hình nhuộm Gram số dòng vi khuẩn A: Gram dương; B: Gram âm Bảng Khả cố định nito (mg/L NH4+) qua ngày 43 dòng vi khuẩn STT Dòng vi Lượng STT Dòng vi Lượng STT Dòng vi Lượng + + khuẩn NH4 khuẩn NH4 khuẩn NH4+ (mg/L) (mg/L) (mg/L) LĐ1 0,20 16 LT5 1,61 31 CT1 2,96 LĐ5 4,76 17 LT2 1,89 32 TT7 1,01 LĐ10 3,61 18 LT4 1,34 33 TT6.1 1,60 LĐ6 3,66 19 TT4 0,90 34 TT2 4,43 CT3 0,18 20 TT1 0,58 35 ML43.1 1,02 CT2 0,15 21 CT7 0,33 36 ML57 0,56 CT8 0,29 22 ML6.3 0,64 37 ML13.1 0,75 LT6 1,77 23 CT4 0,19 38 ML17.2 0,58 LĐ8 4,51 24 TT5 2,00 39 ML43.2 2,21 10 LĐ11 5,20 25 LĐ7 2,72 40 ML6.1 0,46 11 CT10 2,51 26 CT9 0,61 41 ML42 0,91 12 CT5 1,25 27 LĐ9 0,24 42 ML41 1,62 13 LĐ4 1,30 28 LĐ3 1,55 43 LĐ2 2,85 14 LT3 1,65 29 TT3 1,19 44 ĐC 0,00 15 LT1 1,68 30 CT6 3,08 CV% 8,87 Kết Bảng cho thấy, sau ngày khảo sát phosphate dịng cao (Hình 3) 43 dịng vi khuẩn đất vùng rễ phân Lượng phosphate hòa tan qua ngày lập nuôi môi trường Burk’s lỏng dòng vi khuẩn đất vùng rễ tiêu khơng nito có khả cố định nito Sẻ phân lập dao động từ 4,13 - 35,14 Lượng ammonium tạo dao động từ mg/L Năm dịng có khả hịa tan 0,15 mg/L đến 5,20 mg/L Năm dịng có khả phosphate trội LĐ8, ML42, LĐ3, tổng hợp nito (tính bình qn đợt đo) ML63, LĐ5 (19,94 - 35,14 mg/L) Theo kết cao LĐ11, LĐ5, LĐ8, TT2, LĐ6 nghiên cứu khả hòa tan phosphate Sau 20 ngày khảo sát 43 dòng vi khuẩn đất vi khuẩn đất vùng rễ số cấy rau ăn vùng rễ phân lập nuôi môi trồng Thành phố Cần Thơ (Trần Thị trường NBRIP lỏng cho thấy tất dòng Giang ctv., 2014) lượng phosphate có khả hịa tan phosphate Khả vi khuẩn hòa tan dao động từ 13,52 - 50,63 hòa tan phosphate dòng vi mg/L Như vậy, hàm lượng phosphate hòa khuẩn biểu qua phản ứng màu Những tan 43 dòng vi khuẩn phân lập nằm mẫu có màu xanh đậm mức hấp thụ khoảng dao động quang lớn, chứng tỏ khả hòa tan 445 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học Hình Phản ứng màu đường chuẩn phosphate số dòng vi khuẩn ngày Bảng Lượng IAA tổng hợp qua ngày 43 dòng Dòng vi Lượng STT Dòng vi Lượng STT Dòng vi Lượng khuẩn IAA khuẩn IAA khuẩn IAA (mg/L) (mg/L) (mg/L) LĐ1 2,69 16 LT5 2,52 31 CT1 3,04 LĐ5 2,54 17 LT2 3,22 32 TT7 2,48 LĐ10 2,64 18 LT4 3,07 33 TT6.1 3,13 LĐ6 2,66 19 TT4 2,64 34 TT2 2,16 CT3 2,48 20 TT1 2,39 35 ML43.1 2,63 CT2 2,85 21 CT7 2,39 36 ML57 2,05 CT8 2,55 22 ML6.3 2,28 37 ML13.1 2,49 LT6 2,61 23 CT4 2,29 38 ML17.2 2,11 LĐ8 2,50 24 TT5 2,37 39 ML43.2 2,74 10 LĐ11 2,47 25 LĐ7 2,15 40 ML6.1 2,19 11 CT10 2,09 26 CT9 2,53 41 ML42 2,14 12 CT5 2,44 27 LĐ9 2,78 42 ML41 1,78 13 LĐ4 2,67 28 LĐ3 2,55 43 LĐ2 1,98 14 LT3 2,47 29 TT3 2,51 44 ĐC 0,00 15 LT1 2,38 30 CT6 2,22 CV% 4,51 Sau ngày khảo sát 43 dòng vi khuẩn đất điều hòa sinh trưởng IAA vi khuẩn đất vùng vùng rễ phân lập nuôi môi rễ rau ăn trồng Thành phố Cần trường Burk’s lỏng có bổ sung Tryptophan Thơ (Trần Thị Giang ctv., 2014); cho thấy tất dịng có khả nghiên cứu lượng IAA tổng hợp trung tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng IAA Kết bình dao động từ 1,01 – 8,25 mg/L Năm bảng cho thấy lượng IAA đo dao dịng có khả tổng hợp IAA cao động từ 1,77 - 3,22 mg/L Kết định LT2, TT6, LT4, CT1, CT2 Mức IAA tổng lượng dòng vi khuẩn phân lập hợp trung bình cao 3,22 mg/L huyện Lộc Ninh Chơn Thành nằm dòng LT2 tổng hợp được, thấp 1,77 khoảng giá trị hàm lượng IAA trung mg/L dòng ML41 tổng hợp bình nghiên cứu khả tổng hợp chất STT Hình Phản ứng màu đường chuẩn IAA số dòng vi khuẩn ngày 446 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Căn vào kết định lượng chọn dịng trội có sai khác hình thái khuẩn lạc, tế bào CT6, ML42, LĐ8, TT6.1 để gửi định danh phương pháp MALDI Kết cho thấy dịng CT6 lồi Bacillus weihenstephanensis, dòng ML42 Bacillus megaterium, dòng LĐ8 Bacillus cereus dòng TT6.1 Staphylococcus warneri Đây dòng vi khuẩn đất vùng rễ phân lập từ số trồng giới có nhiều tiềm thúc đẩy tăng trưởng thực vật KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ 40 mẫu đất vùng rễ tiêu Sẻ trồng huyện Chơn Thành huyện Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước phân lập 90 dòng vi khuẩn đất vùng rễ có khả cố định nito, hịa tan phosphate Trong số 90 dịng có 43 dịng phát triển tốt môi trường Burk’s không đạm NBRIP đặc phân tích khả cố định nito, hòa tan phosphate tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng IAA Lượng nito trung bình dao động khoảng 0,15 – 5,20 mg/L Lượng phosphate trung bình hịa tan khoảng 4,13 – 35,14 mg/L Về kết định lượng IAA, hàm Kỷ yếu khoa học lượng IAA trung bình dịng tổng hợp khoảng 1,77 – 3,22 mg/L Căn vào kết định lượng chọn dịng trội có sai khác hình thái khuẩn lạc, tế bào CT6, ML42, LĐ8, TT6.1 để gửi định danh phương pháp MALDI Kết cho thấy dòng CT6 lồi Bacillus weihenstephanensis, dịng ML42 Bacillus weihenstephanensis, dịng ML42 Bacillus megaterium, dòng LĐ8 Bacillus cereus dòng TT6.1 Staphylococcus warneri Đề xuất Tiến hành định danh, khảo sát yếu tố kích thích sinh trưởng thực vật khác dòng vi khuẩn phân lập Sử dụng dòng định danh, nghiên cứu hoạt tính khác tiến hành thực nghiệm hoạt tính khác tiến hành thực nghiệm trồng với quy mơ phịng thí nghiệm vườn tiêu để ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh Lời cảm ơn Nhóm tác giả xin chân thành gởi lời cảm ơn đến thầy cán phịng thí nghiệm Vi sinh hỗ trợ tạo điều kiện tốt cho thực nghiên cứu Xin cảm ơn tác giả có cơng trình nghiên cứu sử dụng nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO GORDON, S.A AND WEBER R.P., 1951 Colorimetric estimation of indoleacetic acid Plant Physiol 26(1):192-195 KLOEPPER J.W AND M.N SCHROTH 1978 Plant growth promoting rhizobacteria on radishes In: Station de Pathologic Vegetal et Phytobacteriologic (eds.) Proceedings of the 4th International Conference on Plant Pathogenic Bacteria Angers, France 2:879 – 882 LUSTER, J., AND R FINLAY 2006 Handbook of Methods Used in Rhizosphere Research Birmensdorf Swiss Federal Research Institute WSL:536 MURPHY, J., RILEY, J.P., 1962 A modified single solution method for the determrnation of phosphate in natural waters Anal Chim Acta 27:31-36 SOLARZANO, L.,1969 Determination of ammonia in natural waters by the phenolhypochlorite methods Limnol Oceanogr 14(5):799-801 TRẦN LINH THƯỚC, NGUYỄN ĐỨC HOÀNG, PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG VÀ PHẠM THỊ HỒNG TƯƠI 2001 Thực tập vi sinh vật học Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh 447 ... dòng vi khuẩn đất vùng rễ phân lập từ số trồng giới có nhiều tiềm thúc đẩy tăng trưởng thực vật KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ 40 mẫu đất vùng rễ tiêu Sẻ trồng huyện Chơn Thành huyện Lộc Ninh, tỉnh. .. điều hòa sinh trưởng IAA tiêu Sẻ (Piper nigrum L.) trồng huyện Chơn Thành huyện Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước, hướng tới nghiên cứu chọn lọc dịng có tiềm ứng dụng vào sản xuất phân bón vi sinh PHƯƠNG... hóa (colonization) rễ kích thích tăng trưởng thực vật, từ làm giảm tỷ lệ mắc bệnh Kloepper Schroth (1981) gọi vi khuẩn vùng rễ có lợi ? ?vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật? ?? (Plant Growth