Bromelain trong dứa và curcumin từ nghệ kết hợp để tạo thành một hiệu ứng chống viêm, tăng tốc lành vết thương. Áp dụng công nghệ nano để chuẩn bị phức hợp silica-curcumin-bromelain tạo ra phức hợp hạt nano giúp tăng cường khả năng của cơ thể được tiếp xúc và hấp thu bởi cơ thể trong khi duy trì hoạt động sinh học.
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học NGHIÊN CỨU TẠO PHỨC HỢP NANOSILICA – CURCUMIN – BROMELAIN VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH LÊN DỊNG FIBROBLAST TRÊN MƠ HÌNH ĐỘNG VẬT Trương Thị Thúy An*, Chiêm Thị Anh Thư Trường Đại học Cơng nghiệp Thực phẩm TP Hồ Chí Minh *Tác giả liên lạc: truongthithuyan1996@gmail.com TÓM TẮT Từ năm 2017, số lượng bỏng tăng lên loại tai nạn thường gặp thứ hai sau tai nạn giao thông Với phát triển công nghệ làm đẹp, yêu cầu điều trị vết thương bỏng nhanh chóng, hồn tồn không sẹo người quan tâm Bromelain dứa curcumin từ nghệ kết hợp để tạo thành hiệu ứng chống viêm, tăng tốc lành vết thương Áp dụng công nghệ nano để chuẩn bị phức hợp silica-curcumin-bromelain tạo phức hợp hạt nano giúp tăng cường khả thể tiếp xúc hấp thu thể trì hoạt động sinh học Hỗ trợ điều trị vết thương hở, bỏng, sẹo lồi, lõm nhanh Trong thử nghiệm, nanosilica-bromelain-curcumin với kích thước 10-100 nm đánh giá thành công dòng tế bào nguyên bào sợi từ chuột trắng nồng độ tối ưu hoạt chất mức 7,5% Ngoài ra, ứng dụng nanosilica-bromelaincurcumin điều trị bỏng mơ hình chuột bỏng nhiệt độ II, sau 18 ngày, vết sẹo bỏng lành tóc mọc nhanh khơng điều trị ngày Từ khóa: Nanosilica, bromelain, curcumin, bỏng sẹo RESEARCH IN CREATING NANOSILICA – CURCUMIN – BROMELAIN COMPLEX AND EVALUATING THE ACTIVE ON FIBROBLASTS, ANIMAL MODELS Truong Thi Thuy An*, Chiem Thi Anh Thu Ho Chi Minh City University of Food Industry * Corresponding Author: truongthithuyan1996@gmail.com ABSTRACT According to the Vietnam Burns Institute since 2017, the number of burns has increased and is the second common accident type after traffic accident With the development of beauty technology, requirement of the quickly, completely, and without scarring treatment for burns wound is very interested and necessary Bromelain in pineapple and curcumin from turmeric combine to form an effective anti-inflammatory, accelerating wound Applying nanotechnology to the preparation of the silica-curcumin-bromelain complex produces a nanoparticle complex that enhances the body's ability to be exposed and absorbed by the body while maintaining biological activity Support for the treatment of open wounds, burns, keloids, concave faster In the test, nanosilica-bromelain-curcumin with size 10-100 nm was successfully assessmented on the fibroblast cell line from white mice and optimal concentration of active ingredient at 7.5% In addition, the application of nanosilica-bromelain-curcumin in the treatment of burns on the mouse model burns heat level II, after 18 days, burns scar was healed and hair growth faster than no treatment for days Keywords: Nanosilica, bromelain, curcumin, burns scar 45 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học mà giữ hoạt tính sinh học chất, hỗ trợ cho trình điều trị vết thương hở, vết bỏng, sẹo lồi, lõm nhanh TỔNG QUAN Hạt nano sử dụng rộng rãi vật liệu phân phối thuốc hạt nano khơng làm tăng khả tương thích sinh học độ tan thuốc, mà tăng khả lưu thông máu (Y Barenholz, 2012) Moulari cộng nói hạt nano có khả kháng viêm làm tăng độ hòa tan thuốc tích lũy chọn lọc mơ nhiễm sau uống, làm tăng hiệu điều trị Nanosilica vật liệu có lõi bên rỗng cấu trúc vỏ hạt vật liệu lý tưởng cho dẫn dược, giúp lượng thuốc hấp thu cao hơn, liệu pháp điều trị hiệu độc tính thấp thể Do đó, nói nanosilica có tiềm lớn để phát triển tảng dẫn dược đa mạnh mẽ cho việc giúp đỡ mở rộng liệu pháp điều trị Việc kết hợp phương pháp điều trị đại với dược liệu tự nhiên hướng có nhiều bước tiến cho y học Bromelain curcumin kết hợp tạo hiệu cộng hưởng điều trị làm lành vết thương Bromelain tăng khả hấp thụ curcumin tế bào, thúc đẩy nhanh trình làm vết thương sau giờ, lấy vật lạ mơ chết để khơng cịn trở ngại nào, hỗ trợ cho hoạt tính curcumin chữa lành vết thương, ngồi bromelain cịn giảm khả tăng trưởng hỗn loạn nguyên bào sợi trình tăng sinh giảm bớt hình thành sẹo Curcumin bromelain tan nước – làm giảm khả hấp thu bám dính tế bào nên gây nhiều hạn chế cho việc sử dụng rộng rãi lâm sàng nghiên cứu Ứng dụng công nghệ nano vào việc điều chế phức hợp Silica-curcumin-bromelain tạo hạt phức hợp có kích thước nano tăng khả tiếp xúc, hấp thụ thể VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Chuẩn bị phức hợp nanosilica – curcumin – bromelain Phối trộn TEOs, curcumin, bromelain theo tỷ lệ 1:1:1 sử dụng phương pháp đánh sóng siêu âm liên tục theo trình tự thời gian khác qua giai đoạn Dung dịch nano sau đánh sóng siêu âm đem rửa giải chất phụ gia trình tạo hạt phương pháp ly tâm Phức hơp nanosilica – curcumin – bromelain kiểm tra chất lượng kích thước phương pháp chụp TEM, hoạt tính bromelain kiểm tra phương pháp đông tụ sửa Phương pháp Phương pháp thu nhận phần da lưng Mô lưng lấy từ phôi chuột nhắt trắng 13 đến 18 ngày tuổi Chuột nhắt trắng mua khu chăn ni động vật thí nghiệm viện Pasteur, Tp Hồ Chí Minh Đặt chuột lên giá mổ cách kéo giãn đốt cổ (tay phải cầm chuột, ngón tay ngón trỏ bàn tay trái kẹp chặt gáy chuột, tay phải kéo lực mạnh phía sau tới nghe tiếng rắc) Đặt chuột nằm ngửa đĩa petri hấp khử trùng (lưng tiếp xúc với khay) Sát trùng vùng da bụng chuột cồn 70oc Cắt ngang bụng chuột đường ngắn, lấy tồn thai chuột (cịn màng ối) Sau loại bỏ thai, rốn, màng ối, quan nội tạng thu phần lưng thai chuột (Balin AK cộng sự, 2000) Phương pháp thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô lưng Cắt phần mô thành miếng nhỏ kéo, dùng pince chuyển mẫu mô 46 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 vào eppendorf có sẵn PBS kháng sinh để mẫu ổn định, sau loại bỏ phần dịch Lặp lại trình lần Tách tế bào đơn trypsin ấm Sau thực quy trình, tiếp tục cho 1ml môi trường vào sục đều, cho tế bào rời tạo huyền phù tế bào Quan sát xác định mật độ tế bào/ml Nuôi cấy sơ cấp dòng tế bào Fibroblast Chuyển lượng tế bào huyền phù ban đầu với lượng môi trường nuôi cấy DMEM/F12 1% Antibiotic – Antimycotic có bổ sung huyết với nồng độ 15% với mật độ 2x104 tế bào/ml Để đĩa nuôi vào tủ nuôi 37oc, 5% CO2 Quan sát kính hiển vi ghi nhận kết Kỹ thuật tách tế bào để đếm mật độ Đổ bỏ mơi trường cũ đĩa ni có tế bào Dùng pipette hút 2ml PBS cho vào giếng nuôi, rửa huyết tế bào chết Dùng pipet hút 0,1ml trypsin cho vào đĩa nuôi Lắc nhẹ, ủ vịng phút Hút 2ml mơi trường nuôi cấy vào đĩa tráng bề mặt đĩa nuôi có tế bào Hút 0,1ml mơi trường đếm mật độ, phần cịn lại tiếp tục ni Xác định mật độ tế bào buồng đếm Neubauer Kỷ yếu khoa học Rửa buồng đếm lamelle nước cất, cồn để khô Đặt miếng lamelle lên buồng đếm Lấy 100µl dịch huyền phù tế bào cho vào eppendorf, bổ sung 900µl thuốc nhuộm trypan blue 0,4% vào eppendorf, trộn đều, hút dịch cho vào buồng đếm Đếm tế bào ô vuông lớn Mật độ tế bào 1ml : C = N × d × × 104 Trong đó: d: nồng độ pha loãng C: số tế bào 1ml dịch nuôi N: số tế bào đếm ô lớn KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tạo hạt phức hợp nanosilica curcumin - bromelain từ phương pháp đánh siêu âm Dựa quy trình tạo thành cơng hạt phức hợp nanosilica - curcumin bromelain có kích thước từ 10 - 100 nm chụp kính hiển vi điện tử truyền qua hình Hình ảnh hạt so sánh với Changhui Fu, 2013 chưa đạt hình ảnh rõ ràng cấu trúc vỏ lõi Tuy nhiên nhìn thấy kết hợp chất vỏ silica phát sáng bao bọc 20 nm Hình Ảnh hiển vi điện tử truyền qua hạt nano silica - curcumin bromelain 47 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học dạng cực nhỏ 10-100 nm giúp tế bào fibroblast tăng trưởng phát triển ổn định Là sở phân tích, chứng minh khả làm lành vết thương tối ưu phức hợp nanosilica - curcumin bromelain Thử nghiệm ảnh hưởng nanosilica - curcumin - bromelain làm lành vết thương mơ hình động vật Sau 21 ngày quan sát theo dõi mẫu đánh giá in vivo chuột cách gây bỏng nóng điều trị nghiệm thức khác nhau: A: đối chứng âm (không điều trị), B: đối chứng dương (kem nghệ Thorakao), C: đối chứng vaseline, D: hợp chất nano silica - curcumin, E: hợp chất nanosilica – curcumin - bromelain Đường kính trung bình vết thương ban đầu khoảng 1,03cm Quan sát miệng vết thương mẫu ngày đầu mẫu E có tượng tróc màu trắng, diện tích mẫu gần Cho đến ngày thứ hầu hết vết bỏng có tượng kéo màu khép miệng vết thương lại khoảng từ 0,8-1,0cm ngoại trừ mẫu A có kích thước lớn 1,02 cm, diện tích vết bỏng gần khơng đổi so với ngày trước Sau 18 ngày điều trị ta thấy mẫu E sử dụng hỗn hợp nanosilica – curcumin bromelain cho thời gian điều trị nhanh nhất, diện tích vết bỏng giảm nhanh, độ kháng khuẩn tốt nhất, không xuất hiện tượng kháng thuốc, đặc biệt chúng tơi nhận thấy q trình liền sẹo tương đối ổn định nhanh mẫu thử nghiệm Mẫu D sử dụng nanosilica - curcumin có mức độ lành vết thương kháng khuẩn tốt, nhiên so với mẫu E thời gian mức độ liền sẹo hạn chế Hai mẫu đối chứng B C kháng khuẩn thúc đẩy trình lành vết thương thời gian hồi phục Thử nghiệm hoạt tính phức hạt nanosilica - curcumin - bromelain dòng tế bào fibroblast thu nhận từ chuột nhắt trắng Từ mẫu chuột nhắt trắng mang bầu 13 đến 18 ngày tuổi, tiến hành thu nhận tế bào đơn phương pháp tách Trypsin ấm Lượng tế bào thu sau tách trypsin đếm buồng đếm hồng cầu, tính tóa n xử lý thống kê ANOVA với độ tin cậy 95% nhận kết 26,6 ± 3,56 x 104 tế bào/gam mô Mẫu thu nhận nuôi môi trường DMEM bổ sung 15% FBS 1% Anti Khi so sánh tăng tưởng fibroblast môi trường nuôi bổ sung điều chỉnh theo nồng độ dược liệu, đối chứng, khẳng định bổ sung với nồng độ 7,5% lượng phức hợp chất nanosilica - curcumin - bromelain tế bào phát triển tốt, tăng trưởng ổn định Sự trao đổi chất tế bào gia tăng lên đáng kể theo thời gian khảo sát đánh giá cách quan sát hình thái đếm buồng đếm hồng cầu cho kết mật độ nồng độ tối ưu cao sau 72h Sự kết dính, bám dính lan rộng tế bào sau quan sát kính hiển vi Leica với độ phóng đại 10X thể tương thích hoạt chất cộng hưởng bromelain curcumin nồng độ 7,5% So sánh với mơ tả khả kết dính nano silica Nguyễn Thị Minh Tâm, 2013, khả kháng viêm, kháng khuẩn cắt mô bỏng cấp độ ba, tăng cường khả hấp thụ thuốc bromelain mô tả Steven J.Taussig, 1988 kết tối ưu hạt nanosilica - curcumin nghiên cứu tiền đề kết nghiên cứu chúng tơi chứng minh tác dụng sinh học chất phức hợp tối ưu tác dụng chất kết hợp với 48 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 không khác nhiều so với mẫu đối âm (không điều trị) Kết ngày thứ 21, mẫu E D gần bình phục, lơng mọc miệng vết thương cũ, mẫu D vết sẹo có phần rõ so với mẫu E Ở điều kiện bình thường khả hịa tan curcumin nước làm hạn chế hoạt tính sinh học, nên sử dụng curcumin truyền thống không phát huy hết tác dụng Quá trình tăng sinh nhanh nguyên bào sợi sinh nhiều myofibroblast nguyên nhân gây sẹo lồi, sẹo lõm, sẹo phì đại gây thẩm mĩ trình điều trị bỏng, việc sử dụng bromelain bổ sung vào hợp chất dẫn dược hỗ trợ cho trình làm lành vết thương ổn định tái tạo tế bào fibroblast hạn chế sẹo cho việc điều trị, tác dụng cộng hưởng bromelain curcumin việc xúc tác hoạt tính curcumin làm tăng khả trình điều trị Kỷ yếu khoa học hoạt tính bromelain có tác dụng đơng tụ sữa Đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính phức hợp nanosilicacurcumin- bromelain với nghiệm thức bao gồm mẫu khảo sát với nồng độ khác mẫu đối chứng lên dòng fibroblast thu nhận từ chuột nhắt trắng Qua thực nghiệm, kết luận nồng độ 7,5% hoạt chất tối ưu cho khả tăng sinh bám dính tế bào fibroblast đánh giá qua mật độ đếm buồng đếm hồng cầu hình ảnh kính hiển vi tiêu cự 10X Tiến hành thử nghiệm ảnh hưởng nanosilica-curcumin-bromelain làm lành vết thương mơ hình động vật (chuột nhắt trắng Mus musculus var Albino) Bằng phương pháp gây bỏng nhiệt lô mẫu tương ứng với nghiệm thức điều trị Sau 18 ngày, đánh giá mẫu điều trị hạt phức hợp nanosilica-curcuminbromelain có thời gian lành nhanh nhất, miệng vết thương đóng khơng để lại sẹo q rõ Đến ngày 21 mẫu điều trị nanosilicacurcumin-bromelain bắt đầu mọc lông miệng vết thương cũ vết sẹo gần không thấy KẾT LUẬN Đề tài tạo thành công hạt phức hợp nanosilica – curcumin - bromelain đạt kích thước từ 10 – 100 nm kiểm tra TÀI LIỆU THAM KHẢO CHANGHUI FU ET AL 2013 The absorption, distribution excretion and toxicity of mesoporous silica nanoparticles in mice following different exposure routes EKAMBARAM SHOBA, RACHITALAKRA MANIKANTAN SYAMALA KIRAN AND PURNA SAI KORRAPATI, 2017 Fabrication ofcore – shell nanofibers for controlled delivery of bromelain and salvianolic acid B for skin regeneration in wound therapeutics GAO Y LI Z., SUN M., ET AL 2011 Preparation and characterization of intravenously injectable Curcumin nanosuspension Drug Delivery KATHRIN AICHELE, MONIKA BUBEL, GUNTHER DEUBEL, TIM POHLEMANN, MARTIN OBERRINGER, 2013 Bromelain down regulates myofibroblast differentiation in an in vitro wound healing assay ROXANA BAZE, 2007 In vivo Antitumoral of stem pineapple (Ananas Comosus) Bromelain 49 ... Silica -curcumin- bromelain tạo hạt phức hợp có kích thước nano tăng khả tiếp xúc, hấp thụ thể VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Chuẩn bị phức hợp nanosilica – curcumin – bromelain Phối trộn TEOs, curcumin, ... đếm ô lớn KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tạo hạt phức hợp nanosilica curcumin - bromelain từ phương pháp đánh siêu âm Dựa quy trình tạo thành cơng hạt phức hợp nanosilica - curcumin bromelain có kích thước... thương tối ưu phức hợp nanosilica - curcumin bromelain Thử nghiệm ảnh hưởng nanosilica - curcumin - bromelain làm lành vết thương mô hình động vật Sau 21 ngày quan sát theo dõi mẫu đánh giá in vivo