Đánh giá khả năng sản xuất gonadotropin màng đệm ngựa (eCG, equine chorionic gonadotropin) chuỗi đơn từ dòng tế bào HEK 293

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN NGUYỄN BÁ NGHỊ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT GONADOTROPIN MÀNG ĐỆM NGỰA (eCG, Equine Chorionic Gonadotropin) CHUỖI ĐƠN TỪ DÒNG TẾ BÀO HEK 293 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Bình Định - Năm 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN NGUYỄN BÁ NGHỊ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT GONADOTROPIN MÀNG ĐỆM NGỰA (eCG, Equine Chorionic Gonadotropin) CHUỖI ĐƠN TỪ DÒNG TẾ BÀO HEK 293 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Mộng Điệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi, hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Thị Mộng Điệp Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa công bố hình thức Luận văn sử dụng thông tin, số liệu từ báo nguồn tài liệu tác giả khác có trích dẫn thích nguồn gốc đầy đủ Nếu có gian lận tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Học viên Nguyễn Bá Nghị LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Mộng Điệp Trưởng môn Sinh học ứng dụng – Nông nghiệp, khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Quy Nhơn; TS.BS Bùi Khắc Cường tập thể cán nhân viên Trung tâm nghiên cứu động vật thực nghiệm, Học viện Quân Y, tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Quỹ đổi sáng tạo Vingroup (VINIF) tài trợ kinh phí để thực đề tài nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Quang Trung tạo điều kiện thời gian hỗ trợ kinh phí suốt thời gian Hà Nội để thực hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học, khoa Khoa học Tự nhiên, quý Thầy Cô trường Đại học Quy Nhơn quý Thầy Cô trực tiếp giảng dạy suốt trình học tập Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, em gái người thân gia đình ln động viên, hỗ trợ làm hậu phương vững trở thành niềm động viên mạnh mẽ giúp thực luận văn Xin chân thành cảm ơn! Học viên Nguyễn Bá Nghị MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu 3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Cấu trúc luận văn Những đóng góp đề tài Chương 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan hormone gonadotropin 1.1.1 Hormone kích thích nang trứng (Follicle-stimulating hormone, FSH) 1.1.2 Hormone tạo hoàng thể (Luteinizing hormone, LH) 1.1.3 Gonadotropin màng đệm người (Human chorionic gonadotropin, hCG) 1.2 Tổng quan eCG 1.2.1 Nguồn gốc cấu trúc eCG 1.2.1.1 Nguồn gốc eCG 1.2.1.2 Cấu trúc eCG 1.2.2 Hoạt động sinh học eCG 11 1.2.3 Ứng dụng eCG hỗ trợ sinh sản 12 1.3 Tình hình sử dụng eCG hỗ trợ sinh sản động vật 15 1.4 Tế bào HEK 293 (Human Embryonic Kidney 293) 21 1.4.1 Nguồn gốc HEK 293 21 1.4.2 Ứng dụng HEK 293 24 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 27 2.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.2 Hóa chất thiết bị 27 2.3 Nội dung nghiên cứu 28 2.4 Phương pháp nghiên cứu 28 2.4.1 Nuôi cấy tế bào 28 2.4.2 Theo dõi cấy truyền tế bào 28 2.4.4 Phương pháp chuyển nạp gen vào tế bào HEK 293 30 2.4.5 Phương pháp xác định nồng độ cAMP 31 2.4.6 Phương pháp xét nghiệm ELISA “Sandwich” 31 2.4.7 Phương pháp xử lý số liệu 32 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33 3.1 Tỷ lệ sống tế bào HEK sau rã đông từ -196°C 33 3.2 Khả sản xuất eCG tái tổ hợp tế bào HEK 293 mơi trường có bổ sung protein 37 3.3 Khả sản xuất eCG tái tổ hợp tế bào HEK 293 môi trường bổ sung protein 41 3.4 Xác định đặc tính sinh học eCG tái tổ hợp thông qua nồng độ cAMP nội bào 43 3.5 Ảnh hưởng eCG đến tỷ lệ sống tế bào Leydig mLTC-1 q trình ni cấy in vitro 47 KẾT LUẬN 50 KẾT LUẬN 50 KIẾN NGHỊ 51 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ (Bản sao) DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT cAMP: Cyclic adenosine monophosphate CHO: Chinese hamster ovary EMEM: Eagle’s Minimum Essential Medium ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent assay eCG: Equine chorionic gonadotropin FSH: Follicle-stimulating hormone hCG: Human chorionic gonadotropin HEK 293: Human embryonic kidney 293 LH: Luteinzing hormone PMSG: Pregnant mare’s serum gonadotropin TSH: Thyroid-stimualting hormone DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng Trang 3.1 Số lượng tế bào tỷ lệ sống tế bào 37 3.2 Tỷ lệ số tế bào HEK 293 sau 48 chuyển nạp 40 3.3 Tỷ lệ phần trăm (%) tế bào mLTC-1 sống theo nồng độ eCG 49 DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu 1.1 1.2 1.3 Tên hình Các phân tử gonadotropin Cấu trúc tuyến tính gonadotropin động vật có vú cho thấy vị trí gắn carbohydrate Vị trí cấu trúc chuỗi carbohydrate gonadotropins ngựa Trang 10 1.4 Tế bào HEK 293 24 1.5 Miễn dịch huỳnh quang tế bào HEK 293 25 3.1 Tế bào HEK 293 nuôi cấy sau rã đông 33 3.2 Tế bào HEK 293 sau 48 nuôi cấy 33 3.3 Tế bào HEK 293 bị nhiễm 34 3.4 Tế bào HEK 239 sau 72 nuôi cấy 35 3.5 3.6 Tế bào HEK 293 sau tách dung dịch Trypsin 0,05% (w/v) Tế bào HEK 293 sau ngày ni cấy (độ phóng đại 100X) 36 37 Nồng độ eCG sản xuất từ tế bào HEK 293 3.7 môi trường sau ngày ni cấy mơi 39 trường có bổ sung FBS Nồng độ eCG sản xuất từ tế bào HEK 293 môi trường sau ngày nuôi cấy vào môi 3.8 trường B (bổ sung FBS), môi trường A (bổ sung BSA) môi trường C (không bổ sung thêm protein BSA) 42 Số hiệu Tên hình Trang Biểu tín hiệu cAMP tác động kích 3.9 thích eCG sau ủ tế bào mLTC-1 44-45 nồng độ khác Biểu tín hiệu cAMP tác động kích 3.10 thích eCG sau ủ tế bào mLTC-1 47 nồng độ khác 3.11 Tế bào mLTC-1 sau ủ với eCG kiểm tra khả sống CellTiter-Blue 48 44 màng tế bào dẫn đến trình hình thành cAMP Sau tổng hợp, cAMP tác động đến nhiều hoạt động sinh lý bên tế bào thông qua protein kinase A cAMP đóng vai trị chất truyền thông tin thứ hai cho tác động hormone Trong thí nghiệm này, để xác định hoạt tính sinh học eCG phần thu sau ni cấy D4 có ảnh hưởng đến tổng hợp cAMP hay không Tế bào mLTC-1 nuôi cấy 48 tiếng mơi trường RPMI, sau kích thích tế bào dịch thu D4 với có diện eCG nồng độ khác (0,25, 0,5 µl/giếng) Nồng độ cAMP nội bào đo thông qua phát quang oxiluciferin tạo từ q trình oxy hóa luciferin 60 phút, giá trị sau chuyển đổi thành động lực tác động khu vực đường cong (AUC) Kết thể hình 3.9 45 Hình 3.9 Biểu tín hiệu cAMP tác động kích thích eCG sau ủ tế bào mLTC-1 nồng độ khác cAMP thể thông qua cường độ phát quang oxiluciferin Lượng eCG tra vào giếng đĩa 96 giếng theo nồng độ 0,25; 0,5; µl/giếng Các thí nghiệm lặp lại lần cách độc lập, giá trị trung bình ± SE (n = 6) Kết phân tích ANOVA, sau test Dunnett *: khác biệt có ý nghĩa thống kê (* P