Nghiên cứu phát triển chủng nấm sợi và tối ưu điều kiện lên men sản xuất đa enzyme (α amylase, glucoamylase, cellulase) ứng dụng trong chế biến thức ăn chăn nuôi TT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM DƯƠNG THU HƯƠNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỦNG NẤM SỢI VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SẢN XUẤT ĐA ENZYME (α-AMYLASE, LUCOAMYLASE, CELLULASE) ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN THỨC ĂN CHĂN NUÔI Chuyên ngành : Chăn ni Mã số : 9.62.01.05 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2022 Cơng trình hồn thành tại: HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn: PGS TS VŨ VĂN HẠNH PGS.TS PHẠM KIM ĐĂNG Phản biện PGS.TS Nguyễn Văn Đức - Hội Chăn nuôi Phản biện PGS.TS Nguyễn Bá Hiên - Hội Thú y Phản biện PGS.TS Trần Huê Viên - Trường Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2022 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện Lương Định Của, Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ở nước ta, chăn ni lợn đóng vai trị vơ quan trọng hệ thống sản xuất nông nghiệp kinh tế Trong nhiều năm trở lại đây, ngành chăn nuôi nước ta đẩy mạnh phát triển chăn nuôi lợn, thực trạng ngành chăn ni lợn Việt Nam cịn gặp nhiều khó khăn, đặc biệt giá thức ăn cao thường xuyên biến động phải phụ thuộc nguồn nguyên liệu nhập khẩu, ảnh hưởng bất lợi cho phát triển chăn ni lợn Trong đó, Việt Nam nước nông nghiệp với nguồn phụ phẩm dồi từ trồng trọt, chế biến nông sản rơm rạ, bã sắn, bã dong riềng, bã mía…Hiện Việt Nam có khoảng 100 nhà máy chế biến tinh bột sắn có quy mơ lớn với sản lượng từ 1,8 đến triệu tinh bột/ngày, lượng chất thải rắn thải từ nhà máy khoảng 0,6 triệu tấn/ngày (Nguyễn Thị Hằng Nga & cs., 2016) Lượng bã sắn phần lớn thải mơi trường, gây lãng phí nhiễm nghiêm trọng Một số phơi khơ ủ chua làm thức ăn cho gia súc, hiệu sử dụng thức ăn chưa cao, bã sắn có hàm lượng protein thấp, chứa nhiều chất xơ chất kháng dinh dưỡng hydrogen cyanide (HCN) Vì xử lý hạn chế đó, chế biến cách bã sắn trở thành nguồn thức ăn chăn ni có giá trị, góp phần quan trọng vào việc giảm phụ thuộc nguyên liệu nhập giảm giá thành sản xuất từ nâng cao khả cạnh tranh ngành Chăn nuôi Việt Nam Lên men xác định số phương pháp hiệu trọng việc chế biến, bảo quản phụ phẩm thành thức ăn chăn nuôi giàu dinh dưỡng (Ubalua, 2007; Aro, 2008) Tuy nhiên, phần lớn nguồn phụ phẩm chứa hàm lượng xơ tinh bột cao, hầu hết vi sinh vật sử dụng trực tiếp Vì vậy, để nâng cao hiệu trình lên men cần bổ sung thêm enzyme phân giải tinh bột (amylase) cellulase lựa chọn chủng có khả sản sinh enzyme Hiện nay, enzyme amylase cellulase thương mại chủ yếu chiết chủ yếu từ nấm sợi với loài thuộc chi Trichoderma, Humicola, Penicillium, Aspergillus (Sukumaran & cs., 2005; Ariffin & cs., 2006; Ghani & cs., 2013) Do nhu cầu sử dụng enzyme chăn nuôi lĩnh vực công, nông nghiệp thực phẩm ngày tăng nên việc mở rộng nghiên cứu, tăng cường cải thiện chất lượng nâng cao sản lượng thông qua việc cải tiến chủng, tối ưu môi trường tìm kiếm trình lên men hiệu giảm chi phí sản xuất cần thiết 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Nâng cao hiệu sử dụng phụ phẩm trồng trọt chế biến nông sản ứng dụng chế phẩm sinh học 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Chọn lọc chủng đột biến từ chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 có khả sinh đa enzyme (α-amylase, glucoamylase cellulase) với hoạt tính cao Tối ưu điều kiện lên men xốp cho sản xuất đa enzyme (α-amylase, glucoamylase cellulase) chủng đột biến chọn lọc Đánh giá hiệu việc sử dụng thức ăn lên men tạo từ bã thải chế biến tinh bột xử lý đa enzyme (α-amylase, glucoamylase cellulase) lợn thịt 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu Chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 sàng lọc từ giống phòng Các chất chức Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Bã sắn tươi: thu gom trực tiếp từ sở chế biến tinh bột thuộc xã Cát Quế, huyện Hoài Đức, Hà Nội Lợn lai F1 (Landrac x Yorkshire): 72 lợn 72 lợn đực thiến giai đoạn 20 kg đến xuất chuồng 1.3.2 Địa điểm nghiên cứu Phòng chất chức sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam Phịng Thí nghiệm trung tâm, Khoa Chăn ni, Học Viện Nơng nghiệp Việt Nam Phịng thí nghiệm mơn Di truyền giống, khoa Chăn nuôi, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Trung tâm Giống lợn chất lượng cao, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 1.3.3 Thời gian nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: tháng năm 2015 – tháng năm 2019 1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đề tài cải tiến chủng dại Aspergillus niger A45.1 đột biến ngẫu nhiên chọn lọc chủng đột biến Aspergillus niger GA15 có khả sinh đa enzyme (α-amylase, glucoamylase cellulase) với hoạt tính cao Chế biến bã thải tinh bột sắn thành thức ăn giàu dinh dưỡng cho chăn nuôi lợn thịt đường hóa lên men đồng thời sử dụng chế phẩm chứa đa enzyme từ chủng đột biến lợi khuẩn 1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1 Ý nghĩa khoa học Đề tài tạo chủng nấm sợi đột biến có khả sinh đa enzyme (α-amylase, glucoamylase cellulase) với hoạt tính cao tối ưu mơi trường lên men xốp cho sản xuất đa enzyme Đề tài chế biến bã thải tinh bột sắn thành thức ăn giàu dinh dưỡng cho gia súc đường hóa lên men đồng thời sử dụng chế phẩm đa enzyme vi sinh vật có lợi Kết nghiên cứu góp phần cung cấp thêm tư liệu phục vụ cho giảng dạy nghiên cứu phát triển chủng kỹ thuật đột biến, chế biến thức ăn chăn nuôi giàu dinh dưỡng từ bã thải tinh bột đa enzyme hoạt tính cao lợi khuẩn 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn Có thể cung cấp chủng giống đột biến cho sản xuất enzyme công nghiệp, giảm thiểu chi phí, đáp ứng nhu cầu sử dụng enzyme ngày tăng chăn nuôi lĩnh vực công nghiệp Tận dụng nguồn phụ phẩm rẻ tiền từ sở sản xuất tinh bột sắn thành nguồn nguyên liệu giàu dinh dưỡng làm thức ăn chăn nuôi, góp phần giảm chi phí thức ăn chăn nuôi ô nhiễm môi trường PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU Ngày này, hầu hết hầu hết enzyme cellulase amylase quan trọng công nghiệp tạo nấm sợi với loài thuộc chi Trichoderma, Humicola, Penicillium, Aspergillus (Sukumaran & cs., 2005; Ariffin & cs., 2006; Ghani & cs., 2013) Trong năm gần đây, với tăng lên theo cấp số nhân ứng dụng enzyme nhiều lĩnh vực khác đặt yêu cầu cấp thiết phải mở rộng tăng cường việc cải tiến chất lượng nâng cao số lượng thông qua việc cải tiến chủng, tối ưu mơi trường, tìm kiếm q trình lên men hiệu để tăng sản lượng enzyme Việc cải tiến chủng chủ yếu tập trung vào gia tăng hiệu suất trình lên men, giảm chi phí tăng lợi ích kinh tế có thêm số đặc tính mong muốn khác (Prabakaran & cs., 2009; Singh & cs., 2011) Đột biến công cụ thường sử dụng để cải tiến chủng, phương pháp có hiệu cải tiến vi sinh vật công nghiệp để tạo chủng có hiệu suất enzyme cao đặc tính mong muốn (Singh & cs., 2011; Pathak & cs., 2015) Trong trình sản xuất enzyme công nghiệp, việc tối ưu môi trường lên men tiến hành để tăng sản lượng sản phẩm mong muốn Lên men xốp đánh giá đường tốt để sản xuất enzyme sản phẩm bền nhiệt khác Lên men xốp ngày sử dụng rộng rãi sản xuất nghiên cứu ứng dụng mang tính thực tiễn kinh tế Lên men xốp dùng công nghiệp chế biến sản xuất thực phẩm chủ yếu lĩnh vực sản xuất loại hương liệu, sản xuất enzyme (a-amylase, fructosyl transferase, lipase, pectinase, xylanase), acid hữu (acid lactic, acid citric) Thức ăn lên men nghiên cứu rộng rãi để thay việc sử dụng kháng sinh làm chất kích thích tăng trọng nhiều năm gần để giám giá thành thức ăn chăn nuôi việc sử dụng phụ phẩm công – nông nghiệp (Wang & cs., 2018) Thức ăn lên men mang lại nhiều lợi ích cho vật ni có mặt vi sinh vật có lợi với đặc tính probiotic, kháng khuẩn, chống oxy hóa, sản sinh peptit…Chúng có khả biến đổi thành phần hóa học nguyên liệu thức ăn suốt trình lên men làm tăng cường giá trị dinh dưỡng, cải thiện chất lượng cảm quan, an tồn thực phẩm có hiệu bảo quản thức ăn Bên cạnh đó, vi sinh vật cịn có khả phân hủy thành phần độc hại, chất kháng dinh dưỡng có thức ăn, sinh chất kháng khuẩn, chống oxy hóa, kích thích đặc tính probiotic hợp chất tăng cường sức khỏe cho vật chủ (Tamang & cs., 2016; Wang & cs., 2018) Ở nước ta, năm gần nhiều nhà máy sản xuất chế biến tinh bột sắn đời Hiện nay, Việt Nam có khoảng 100 nhà máy chế biến tinh bột sắn có quy mơ lớn với sản lượng từ 1,8 đến triệu tinh bột/ngày, lượng chất thải rắn thải từ nhà máy khoảng 0,6 triệu tấn/ngày Chỉ phần nhỏ bã sắn sử dụng làm thức ăn cho gia súc giá trị dinh dưỡng khơng cao, phần lớn thải ngồi mơi trường, gây lãng phí nhiễm mơi trường nghiêm trọng Vì vậy, việc tìm kiếm giải pháp kỹ thuật để xử lý bã sắn làm thức ăn chăn ni cần phải đặt mức để đưa nguồn phụ phẩm trở thành thức ăn hữu ích cho vật ni, góp phần khai thác ưu chỗ góp phần hạn chế nhiễm môi trường PHẦN NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nội dung 1: Gây đột biến chủng Aspergillus niger A45.1 tối ưu điều kiện lên men chủng nấm đột biến chọn lọc để sinh tổng hợp đa enzyme (α- amylase, glucoamylase cellulase) cao Nội dung 2: Xử lý bã sắn thành thức ăn chăn nuôi chế phẩm đa enzyme chủng đột biến chọn lọc vi sinh vật probiotic cơng nghệ đường hóa lên men đồng thời Nội dung 3: Đánh giá ảnh hưởng việc sử dụng bã sắn lên men phần ăn đến suất chăn nuôi lợn thịt 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Gây đột biến chủng Aspergillus niger A45.1 tối ưu điều kiện lên men chủng nấm sợi đột biến chọn lọc để sinh tổng hợp đa enzyme (α- amylase, glucoamylase cellulase) cao a Phương pháp hoạt hóa nuôi cấy nấm sợi Giống gốc bào tử chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 (đựng ống eppendorf) bảo quản glycerol 30%, điều kiện lạnh sâu (-700C) Trước đem giống gốc hoạt hóa cần để nhiệt độ phòng khoảng 30 phút Tiến hành pha lỗng giống gốc nước cất vơ trùng đến nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 Mỗi độ pha loãng hút 100µl vào đĩa petri có mơi trường PDA chuẩn bị, tiến hành cấy trải que cấy trang Ủ đĩa ni cấy điều kiện phịng khoảng 5-7 ngày Kiểm tra độ khiết khuẩn lạc nấm b Phương pháp gây đột biến Chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 nuôi cấy môi trường PDB 28oC, 200 vòng/phút, sau ngày thu 2ml dung dịch bào tử (107 bào tử/ml), ly tâm 10.000 vòng/phút 10 phút 4oC), thu bào tử, loại dịch Bào tử hịa vào 500µl dung dịch NTG lắc kỹ Đổ dung dịch vào đĩa petri (9cm x 1,5 cm), bật tia UV (50 Watte), khoảng cách từ nguồn UV đến đĩa 30 cm Sau 30, 60, 90, 120 180 phút chiếu UV, 50 µl dịch chiếu hút cho vào ống eppendorf rửa nước muối sinh lý lần, sau pha lỗng cấy trải mơi trường PDA có bổ sung ampicillin (100mg/l), ni cấy nhiệt độ phòng 4-6 ngày Sau nấm mọc, đếm số lượng khuẩn lạc đĩa thí nghiệm đối chứng (không gây đột biến) để dựng đồ thị tỷ lệ (%) sống sót bào tử sau chiếu UV Từ đĩa nấm mọc, nhặt ngẫu nhiên khuẩn lạc/liều gây đột biến, cấy đĩa PDA, ủ nhiệt độ phòng ngày, sau tiến hành lên men để xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp mô tả Vũ Văn Hạnh & cs (2012) Kaur & cs.(2014) c Phương pháp lên men xốp chiết tách enzyme thô Tiến hành lên men sản xuất enzyme theo Vu & cs (2011) có cải tiến việc sử dụng chất Cấy (1x1 cm2) nấm sợi nuôi ngày tuổi từ đĩa thạch vào bình tam giác 250 ml chứa môi trường cám gạo dịch thể (10%, w/v), nuôi lắc 200 vòng/phút, 30oC, sau ngày thu giống cấp Lấy 10% giống cấp trộn vào môi trường lên men xốp (10 cám gạo, độ ẩm 30%), trộn đều, ngày nhiệt độ phòng Lấy 1g sản phẩm sau ngày lên men xốp trộn với ml nước cất vô trùng đựng ống falcon 50 ml Hỗn hợp lắc 200 vòng/phút, 30oC 60 phút, sau ly tâm 4000 vịng/phút 10 phút, thu dịch sử dụng làm nguồn enzyme thơ d Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase, α - amylase glucoamylase Hoạt tính enzyme α – amylase, glucoamylase cellulase sau lên men xốp xác định theo mô tả Grajek (1987) Vu & cs (2010): ml hỗn hợp phản ứng enzyme gồm 50µl enzyme pha lỗng 50µl carboxymethyl cellulose 1% (w/v) (CMC) hồ tinh bột 1% đệm axetat (50 mM, pH 5) Hỗn hợp phản ứng ủ 50oC 30 phút đường khử sau phản ứng xác định phương pháp xác định hàm lượng đường khử (Miller, 1959) Xây dựng đường chuẩn glucose maltose Nồng độ đường khử mẫu xác định nhờ vào đường chuẩn glucose đường chuẩn maltose dựng Dựa vào đường chuẩn glucose xác định hoạt tính cellulase (cơ chất CMC) glucoamylase (cơ chất tinh bột), dựa vào đường chuẩn maltose xác định hoạt tính α-amylase Một đơn vị hoạt tính enzyme (Unit: U) xác định lượng enzyme cần thiết để tạo 1µM glucose maltose từ chất phút điều kiện thí nghiệm Hoạt tính cellulase, α – amylase glucoamylase thể đơn vị gam cám gạo lên men (U/g) Hoạt tính enzyme (U/g) = Trong đó: X: hàm lượng đường khử (µM) giải phóng dung dịch sau phản ứng enzyme; k: hệ số pha loãng; t: thời gian phản ứng (phút) e Tối ưu điều kiện lên men dịng đột biến chọn lọc có khả sinh đa enzyme cao Các thông số nghiên cứu bao gồm: Cơ chất (cám mì, cám gạo, vỏ trấu, mùn cưa) Độ ẩm chất (20, 30, 40, 50, 60 70%, w/v) Nhiệt độ lên men (20, 25, 30, 35, 40 45oC) pH ban đầu chất lên men (3,0; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,0; 6,5 7) Thời gian lên men (từ 2, 3, 4, 5, 6, ngày), tuổi giống (1, 2, ngày) Nguồn carbon nitrogen: Nguồn carbon gồm glucose, maltose, tinh bột gạo, sucrose, loại 1% bổ sung vào chất lên men xốp Nguồn nitrogen như: ure, cao nấm men, tryptone, peptone, NH4Cl, NH4NO3, loại 1% bổ sung vào chất lên men xốp Tiến hành: Tiến hành tối ưu đơn biến thành phần theo thứ tự thông số lên men sau: Tối ưu chất lên men: Lên men xốp chủng nấm sợi đột biến chọn lọc với chất khác (cám mì, cám gạo, vỏ trấu, mùn cưa), độ ẩm 30%, pH 4,5, tuổi giống ngày tuổi, lên men nhiệt độ 30oC ngày Sau lên men, xác định hoạt tính cellulase, α–amylase glucoamylase, lựa chọn chất thích hợp cho sản sinh enzyme chủng nấm sợi chọn lọc Tối ưu độ ẩm lên men: Tiến hành lên men xốp chủng nấm sợi chọn lọc với chất tối ưu, điều chỉnh chất lên men độ ẩm khác (20, 30, 40, 50, 60 70%), pH 4,5, tuổi giống ngày tuổi, nhiệt độ 30oC, thời gian lên men ngày Lựa chọn độ ẩm thích hợp cho sản sinh enzyme Tối ưu nhiệt độ lên men: Lên men xốp chủng nấm sợi chọn lọc chất tối ưu với độ ẩm thích hợp, pH 4,5, tuổi giống ngày tuổi, lên men ngày nhiệt độ khác (20, 25, 30, 35, 40 45oC) Xác định hoạt tính enzyme cellulase, α–amylase glucoamylase lựa chọn pH thích hợp Tối ưu pH: Lên men xốp chủng nấm sợi chọn lọc chất tối ưu với độ ẩm thích hợp, điều chỉnh pH mơi trường lên men mức khác (3,0; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,0; 6,5 7), tuổi giống ngày tuổi, lên men ngày nhiệt độ tối ưu Xác định hoạt tính enzyme cellulase, α–amylase glucoamylase lựa chọn pH thích hợp Tối ưu thời gian lên men: Tiến hành lên men xốp chủng nấm sợi chọn lọc chất tối ưu, điều chỉnh chất độ ẩm pH thích hợp, bổ sung giống ngày tuổi, lên men từ 2, 3, 4, 5, 6, ngày nhiệt độ tối ưu Sau thời gian lên men, xác định hoạt tính enzyme lựa chọn thời gian lên men thích hợp cho sản sinh cellulase, α–amylase glucoamylase chủng nấm chọn lọc Tối ưu tuổi giống: Lên men chủng nấm sợi chọn lọc với chất lựa chọn, điều chỉnh độ ẩm, pH ban đầu mức thích hợp, bổ sung giống tuổi giống khác (1, 2, ngày tuổi), lên men nhiệt độ thời gian thích hợp Lựa chọn tuổi giống thích hợp cho sản sinh enzyme Lựa chọn nguồn cacbon bổ sung: Tiến hành lên men xốp chủng nấm sợi điều kiện tối ưu lựa chọn, bổ sung 1% nguồn cacbon (glucose, maltose, tinh bột gạo, sucrose) Xác định hoạt tính enzyme lựa chọn nguồn carbone bổ sung thích hợp cho sản sinh cellulase, α–amylase glucoamylase chủng nấm chọn lọc Lựa chọn nguồn nitơ bổ sung: Tiến hành lên men xốp chủng nấm sợi điều kiện tối ưu lựa chọn, bổ sung 1% nguồn cacbon thích hợp 1% nguồn nitơ khác (ure, cao nấm men, tryptone, peptone, NH4Cl, NH4NO3) Xác định hoạt tính enzyme lựa chọn nguồn nitơ bổ sung thích hợp cho sản sinh cellulase, α–amylase glucoamylase chủng nấm chọn lọc 3.2.2 Xử lý bã sắn thành thức ăn chăn ni cơng nghệ đường hố lên men đồng thời a Đường hóa bã sắn enzyme Để lựa chọn nồng độ enzyme thích hợp việc đường hóa, bã sắn sau hịa vào nước với tỷ lệ 30% (w/v) bổ sung chế phẩm đa enzyme thô nồng độ khác (0, 2, 4, 6, 8, 10%) (tính theo khối lượng chất) Ủ hỗn hợp bình kín nhiệt độ phịng, sau 24 tiến hành lấy mẫu xác định hàm lượng tinh bột, xơ thô hàm lượng đường khử Thí nghiệm tiến hành lặp lại lần Thời gian đường hóa bã sắn thích hợp xác định thông qua việc tiến hành ủ dung dịch bã sắn với enzyme nồng độ thích hợp điều kiện mô tả 60 Cứ sau 12 ủ, mẫu lấy để xác định lượng đường khử Thí nghiệm tiến hành lặp lại lần b Đường hóa lên men bã sắn đồng thời tạo sản phẩm giàu protein Xác định mức bổ sung (NH4)2SO4 thích hợp: Cân 10 g bã sắn cho vào bình tam giác 250 ml, điều chỉnh độ ẩm 30% HCl 0,01%, bổ sung chế phẩm enzyme thô hàm lượng thích hợp 0,5% chế phẩm probiotic (theo khối lượng chất) Bổ sung (NH4)2SO4 vào hỗn hợp lên men với hàm lượng 0; 0,5; 1; 1,5 g/100g bã sắn (tương ứng 0; 0,5; 1; 1,5 %) Tiến hành lên men nhiệt độ phòng Sau 48 xác định hàm lượng Protein thô, Protein thực, lượng protein tăng để xác định hàm lượng bổ sung (NH4)2SO4 thích hợp Lượng Protein tăng (protein gain - PG, % VCK) xác định công thức: PG = Pf - Po Trong đó: Po: Hàm lượng protein thời điểm bắt đầu (0 giờ) (% VCK) Pf: Hàm lượng protein sau lên men (48 giờ) (% VCK) Xác định thời gian tối ưu: Lên men lỏng bã sắn có bổ sung enzyme, chế phẩm probiotic (như mơ tả trên) nitơ nồng độ thích hợp Lên men 96 nhiệt độ phòng, sau 24 lấy mẫu phân tích hàm lượng protein thực, xác định thời gian lên men thích hợp cho đường hóa lên men đồng thời bã sắn Thí nghiệm tiến hành lặp lại lần c Lên men bã sắn điều kiện tối ưu làm thức ăn cho lợn Cân 80kg bã sắn tươi vào thùng lên men (dung tích 120l), bổ sung 400g chế phẩm probiotic (tương ứng 0,5%), chế phẩm đa enzyme (NH4)2SO4 với hàm lượng thích hợp, trộn đều, điều chỉnh độ ẩm 30% nước máy Đặt bình lên men phịng kín Sau thời gian lên men thích hợp, tiến hành lấy mẫu xác định thành phần dinh dưỡng (protein thô, protein thực, tinh bột, xơ thô, lipit thơ, khống tổng số, axit hữu tổng số, HCN), pH chất lượng cảm quan d Phương pháp phân tích mẫu Phương pháp lấy mẫu phân tích theo TCVN 4325:2007 Xác định hàm lượng vật chất khô theo TCVN 4326:2007 Định lượng khống tổng số (tro thơ) theo TCVN 4327:2007 Định lượng xơ thô theo TCVN 4329: 2007 Xác định hàm lượng lipit thô theo TCVN 4321:2007 Định lượng canxi theo TCVN 1526: 2001 Định lượng protein thô tính tốn sở xác định hàm lượng nitơ tổng số phương pháp Kjeldahl theo TCVN 4328:2007 Phương pháp xác định hàm lượng Protein thực: Nghiền nhỏ mẫu, hịa với nước cất bình tam giác, đun cách thủy 30 phút Để nguội, kết tủa protein axit tricloaxetic Tách kết tủa, rửa định lượng nitơ theo phương pháp Kjeldahl Phương pháp xác định hàm lượng tinh bột: Tinh bột thủy phân thành đường dung dịch HCl 10% điều kiện đun sơi bình cách thủy 90 phút Dung dịch thủy phân làm nuội trung hòa NaOH với thị methyl da cam Hàm lượng đường sau thủy phân xác định phương pháp DNS theo mô tả Miller (1959) Bảng 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm Chỉ tiêu ĐC TN1 TN2 Số con/ơ thí nghiệm (con) 12 12 12 Số lần lặp lại 3 Tổng số lợn/lơ thí nghiệm (con) 36 36 36 Thời gian nuôi (ngày) 122 122 122 KL bắt đầu TN (kg) 20,04 ± 1,49 20,37 ± 1,59 20,41 ± 1,56 BSLM (% VCK) 10 20 TN3 12 36 122 19,80 ± 1,57 30 Thức ăn sử dụng thí nghiệm gồm có bã sắn sau lên men (BSLM) phối trộn với nguyên liệu thông thường sử dụng để cân đối phần dựa tiêu chuẩn NRC (2012) Công thức thức ăn hỗn hợp cho lợn thí nghiệm chia làm giai đoạn 20-50 kg 50 kg đến xuất bán (Bảng 3.2) Lợn cho ăn lần/ngày Trong chuồng có hệ thống núm uống nước tự động cho lợn uống tự Lợn tiêm phòng vaccine đầy đủ theo quy trình Trung tâm giống lợn Chất lượng cao – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Các tiêu theo dõi bao gồm: khả sinh trưởng tiêu tốn thức ăn, suất thân thịt, chất lượng thành phần hóa học thịt lợn Số lượng bào tử thời điểm chưa xử lý (0 phút) 107 (bào tử/ml) sau giảm dần theo thời gian gây đột biến Tỷ lệ sống sót bào tử 26,73% sau 30 phút, 3,82% sau 60 phút 0,4% sau 90 phút Sau 120 phút xử lý, tỷ lệ sống sót bào tử với 0,12% Từ sau 150 phút xử lý, lượng bào tử bị gây chết hồn tồn 4.1.3 Hoạt tính enzyme dòng đột biến Lựa chọn ngẫu nhiên chủng nấm sợi cịn sống sót sau gây đột biến Mỗi liều chọn khuản lạc tiến hành xác định khả sản sinh enzyme αamylase, glucoamylase cellulase Bảng 4.1 Hoạt tính enzyme dòng đột biến (n=3) Thời gian gây Dòng đột biến Hoạt tính enzyme (U/g) (LSM)* đột biến (phút) Glucoamylase α-amylase Cellulase A45.1 (Chủng dại) 12,47fhi 19,60cdef 6,40bcdef GA11 10,88hi 15,01defg 4,26ef GA12 14,41efh 20,90cde 6,31bcdef cdef bc 30 GA13 18,41 27,57 4,66def abcd ab GA14 21,41 32,57 11,81a GA15 27,41a 38,68a 12,16a GA21 7,98hi 10,18ghi 6,08cdef abcd ab GA22 21,53 32,76 8,81abcdf 60 GA23 15,69def 23,04cd 12,68a GA24 21,31abcd 32,40ab 10,91ab fhi hi GA25 12,10 6,16 8,38abcde edf ghi GA31 15,82 8,02 7,99abcdef GA32 20,38bcde 10,30ghi 9,42abcd 90 GA33 22,43abcd 11,33fghi 6,55bcdef ab efgh GA34 26,60 13,41 5,77cdef GA35 26,16ab 13,19efgh 9,77abc GA41 22,82abc 11,52fghi 6,71cbdef abcd ghi GA42 21,66 10,94 8,04bcdef i i 120 GA43 6,21 3,21 6,99bcdef GA44 8,19hi 4,17i 3,41ef GA45 16,42cdef 8,28ghi 4,51ef SEM 1,27 1,56 0,89 P