Đánh giá tác động hiệp lực giữa tinh dầu sả chanh và ethanol tới escherichia coli

Mục đích của nghiên cứu là đánh giá hiệu quả kháng khuẩn đơn lẻ của ethanol (từ 500 ÷ 800µl/ml) và tinh dầu sả chanh (ở các nồng độ khác nhau 400, 350, 200, 100, 50, 30, 10, 5 và 2.5 µl/ml) và kết hợp cả hai chất kháng khuẩn này chống lại vi khuẩn Escherichia coli 250913 bằng phương pháp khuếch tán thạch và xông hơi đĩa.

Kỷ yếu hội thảo khoa học – Phân ban công nghệ thực phẩm ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG HIỆP LỰC GIỮA TINH DẦU SẢ CHANH VÀ ETHANOL TỚI ESCHERICHIA COLI Trần Đăng Khôi1,*, Hồ Thị Thanh Thủy1, Liêu Mỹ Đông1 Khoa Công nghệ thực phẩm, Trường đại học Công nghiệp thực phẩm Tp Hồ Chí Minh * Email: Dkhoi1995@gmail.com Ngày nhận bài: 15/06/2017; Ngày chấp nhận đăng: 02/07/2017 TÓM TẮT Mục đích nghiên cứu đánh giá hiệu khỏng khun n l ca ethanol (t 500 ữ 800àl/ml) tinh dầu sả chanh (ở nồng độ khác 400, 350, 200, 100, 50, 30, 10, 2.5 µl/ml) kết hợp hai chất kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Escherichia coli 250913 phương pháp khuếch tán thạch xông đĩa Kết nghiên cứu cho thấy, phương pháp khuếch tán qua thạch, nồng độ ức chế tối thiểu tinh dầu sả chanh sử dụng chất nhũ hóa tween 80 0.5% µl/ml, ethanol 550µl/ml Hiệu kết hợp tinh dầu µl/ml, tween 80 0.5%và ethanolở nồng độ 10% 30% tương đương kháng sinh ampicillin acid nalidixic Trong phương pháp xơng đĩa, kết hợp 250 µl/ml tinh dầu 150 µl/ml ethanol cho hiệu diệt khuẩn tương đương nồng độ tinh dầu 400 µl/ml Kết nghiên cứu cho thấy kết hợp tinh dầu sả chanh ethanol kháng E coli cho hiệu tương đương nồng độ tinh dầu tự do, hứa hẹn tiềm ứng dụng bảo quản thực phẩm thay chất kháng sinh hóa học độc hại với hiệu kinh tế cao Từ khóa: ethanol, Escherichia coli, hiệp lực, tinh dầu sả MỞ ĐẦU Escherichia coli loại vi khuẩn đường ruột thông thường người động vật máu nóng [1].Bên cạnh chủng có lợi tồn song song số chủng gây bệnh, E.coli nguyên nhân gây nhiễm trùng nghiêm trọng người động vật tiêu chảy, viêm đại tràng tan huyết hội chứng urê huyết tán [2] Do nhiệt độ phát triển tối ưu tương đương nhiệt độ thể người (37.4oC) thời gian hệ để tăng sinh khoảng 20 phút [3] nên E coli xem mối nguy sinh học phổ biến nguy hiểm sức khỏe người Đáng lo ngại hơn, tình trạng kháng kháng sinh chủng vi sinh vật nguy hiểm ngày gia tăng đòi hỏi nhu cầu cấp thiết phải tìm loại kháng sinh có nguy kháng thấp [4] Tinh dầu sả chanh xem tinh dầu tiêu biểu cho chất bảo quản tự nhiên an toàn hiệu [5], với chế tác động ảnh hưởng đến nhiều mục tiêu tế bào vi sinh vật thời điểm nên khơng có đề kháng cụ thể thích ứng với tinh dầu mơ tả [6] có nhiều nghiên cứu chứng minh hiệu kháng khuẩn tinh dầu sả chanh đối 297 Trần Đăng Khôi, Hồ Thị Thanh Thủy, Liêu Mỹ Đông với Escherichia coli [5], [7], [8] Tinh dầu sản phẩm tự nhiên bao gồm hỗn hợp phức tạp nhiều phân tử dễ bay [9], chúng tồn dạng lỏng, hịa tan dung mơi hữu khơng hịa tan nước [10] Trên thực tế, để có đánh giá phù hợp hoạt tính kháng khuẩn lượng tinh dầu sử dụng nghiên cứu thường pha loãng nồng độ khác chất nhũ hóa [7] Gần J Hilbig cộng (2016) đặt nghi vấn ảnh hưởng tiêu cực chất tạo nhũ đến hiệu kháng khuẩn tinh dầu [11] Trong việc kết hợp ethanol nồng độ từ 10% với chất kháng khuẩn khác (chitosan, potassium sorbate…) cho hiệu kết hợp tốt so với sử dụng chất kháng khuẩn đơn lẻ [12] [13] Tuy nhiên, hiệu kết hợp tinh dầu ethanol nồng độ từ 10% chưa công bố cách đầy đủ Ở nồng độ này, ethanol đóng vai trò hòa tan thành phần kỵ nước tinh dầu đồng thời đóng vai trị chất kháng khuẩn Trong nghiên cứu này, hỗn hợp dễ bay tinh dầu sả chanh (có nguồn gốc Việt Nam) ethanol nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn Escherichia coli phương pháp khuếch tán đĩa thạch xông VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Chủng vi sinh vật chất kháng khuẩn Tinh dầu sử dụng nghiên cứu tinh dầu sả chanh (Cymbopogon citratus) có nguồn gốc từ Yên Bái, Việt Nam cung cấp công ty cổ phần tinh dầu Việt Nam Ethanol với độ tinh khiết 99.7% cung cấp công ty TNHH giải pháp hóa học Vi Na (VNCHEMSOL CO.) Vi khuẩ n E.coli 250913 (từ Viê ̣n Pasteur Tp.HCM) hoạt hóa môi trường nutrient broth (NB) tăng sinh môi trường nutrient agar (NA) 24 nhiệt độ 37oC Tinh dầu sả chanh pha loãng tween 80 (0.5% v/v) nồng độ 400, 350, 200, 100, 50, 30, 10, 2.5 µl/ml khuấy hệ nhũ tương hình thành Ethanolđươ ̣c pha loãng nước cấ t ở các nồ ng đô ̣ 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 µl/ml Tinh dầ u ethanol pha lỗng kiểm tra hiệu kháng khuẩ n bước 2.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 2.2.1 Phương pháp khuếch tán thạch Khảo sát hoạt tính kháng E.coli thực phương phápkhuếch tán thạch, kế thừa mô tả A A Dobre cộng (2011) [14] với số thay đổi nhỏ tóm tắt sau E.coli ni cấy môi trường NA 37oC 24 Khuẩn lạc sau cấy truyền sang mơi trường NB để thu nhận sinh khối, tiến hành đo mật độ quang hiệu chuẩn để đạt nồng độ log (CFU/mL) Huyền phù thu trải lên môi trường thạch TSA (Tryptic Soy Agar) để khô phút Sau tinh dầu hoă ̣c ethanol nồng độ pha lỗng nhỏ (10µl) lên bề mặt thạch, dung môi không chứa tinh dầu và ethanol dùng làm đối chứng Các đĩa petri sau ủ 37oC sau 24 ủ, đĩa petri lấy kiểm tra đường kính vịng kháng khuẩn 298 Đánh giá tác động hiệp lực tinh dầu sả chanh ethanol tới Escherichia Coli 2.2.2 Phương pháp xông đĩa Để đánh giá hiệu kháng khuẩn với phương phápkhuếch tán thạch, phương pháp xông đĩa tiến hành theo mô tả A A Dobre cộng (2011) [14] với số thay đổi tóm tắt sau Mơi trường PCA khử trùng bổ sung 1ml sinh khối vi khuẩn E.coli (106 CFU/ml) trải bề mặt đĩa que cấy để khơ Sau đó, 10 μl dung dịch kháng khuẩn từ tinh dầu ethanol nồng độ khác thêm vào giấy lọc vô trùng đường kính mm đặt sẵn nắp đĩa petri Các đĩa úp ngược bao kín màng bao thực phẩm để tránh rị rỉ Sau ủ 37oC 24 giờ, đo đường kính vịng kháng khuẩn Các chất kháng sinh tổng hợp ampicillin nalidixic acid sử dụng làm mẫu so sánh đối chiếu hiệu kháng E.coli 2.3 Xử lý thống kê Các nghiê ̣m thức thí nghiệm đươ ̣c lă ̣p la ̣i ba lầ n nhằm xác định giá trị trung bình, độ lệch chuẩn kiểm định Student–Newman–Keuls, Tukey HSD dùng để so sánh khác biệt nhóm Sớ liê ̣u đươ ̣c xử lý thông qua phần mềm Statgraphics centurion phiên 15.1 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Hiệu độc lập chất kháng E.coli phương pháp khuếch tán thạch Khả kháng E.coli của tinh dầ u sả chanh ethanol đươ ̣c triǹ h bày ở hiǹ h Kế t quả khảo sát cho thấ y, tinh dầu sả chanh (nồng độ 2.5÷ 50 µl/ml) ảnh hưởng đáng kể (p0.05) hai mẫu này, ethanol hiệu kháng khuẩn nồng độ này.Việc khảo sát kết hợp nồng độ tinh dầu ethanol đảm bảo tổng nồng độ 400 𝜇l/ml để tiến hành đánh giá tác động hiệp lực hai chất hợp lý (kết thu thể hình 4) Đối với mẫu kết hợp không sử dụng tween 80, nồng độ kết hợp 200 𝜇l/ml tinh dầu sả chanh 200 𝜇l/ml ethanol cho hiệu hai mẫu cịn lại với đường kính vịng kháng khuẩn 83.33 ± 5.03 mm, tăng nồng độ tinh dầu lên 250 300 𝜇l/ml khác biệt mặt ý nghĩa với đường kính vịng kháng khuẩn 93.00±3.46 mm 95±0mm, hai kết không khác biệt với nồng độ tinh dầu 400 𝜇l/ml (hình 4) Kết đồng nghĩa với việc hồn tồn thay từ 25% đến 37.5% hàm lượng tinh dầu ethanol mà trì hiệu diệt khuẩn E coli Hình Hiệu kết hợp tinh dầu sả chanh ethanol phương pháp khuếch tán thạch Còn mẫu kết hợp tinh dầu ethanol có sử dụng dung mơi pha lỗng tween 80 nồng độ 0.5%, kết thu có biến động tương đối lớn nồng độ Điều giải thích dung dịch tween 80 0.5% chứa lượng nước lớn Việc sử dụng nước phương pháp hiệu để phân tán tinh dầu hợp chất phenolic tan nước dẫn đến hoạt tính kháng khuẩn giảm [23] Theo Sato cộng (2006), nước làm giảm tính bay hợp chất với nhóm hydroxyl hòa tan 302 Đánh giá tác động hiệp lực tinh dầu sả chanh ethanol tới Escherichia Coli nước [25] Trong phương pháp xông đĩa, chế kháng khuẩn dựa vào bốc thành phần, việc pha lỗng tinh dầu chất nhũ hóa cản trở bốc từ làm giảm lượng chất kháng khuẩn bốc gây ảnh hưởng tiêu cực đến hiệu kháng khuẩn Phương pháp xông xem phương pháp hữu hiệu cho việc sàng lọc đơn giản hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu [14] Theo K Laird C Phillips (2011) vấn đề gặp phải xem xét tác động kháng khuẩn tinh dầu tốc độ bốc tự nhiên thành phần [23] Sở dĩ tinh dầu có hoạt tính kháng khuẩn cao tương tác cộng hưởng toàn thành phần chứa tinh dầu [7] Tương tự tinh dầu, ethanol biết đến chất sát khuẩn dễ bay [12] Trong nghiên cứu cho thấy, kết hợp ethanol với tinh dầu giúp gia tăng hiệu kháng khuẩn, giảm bớt lượng tinh dầu sử dụng (hình 4) Điều cho thấy, việc kết hợp ethanolđã tăng cường lôi thành phần dễ bay tinh dầu, từ nhanh chóng phát huy hiệu kháng khuẩn KẾT LUẬN Hoạt tính kháng khuẩn đạt hiệu kết hợp tinh dầu sả ethanol kháng Escherichia coli thông qua hai phương pháp kiểm tra khuếch tán thạch xông đĩa so với sử dụng riêng lẻ Ethanol không cho hiệu kháng khuẩn tất nồng độ khảo sát, tinh dầu sả với thành phần đa dạng hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn khác cho thấy hiệu kháng khuẩn không cao Trong phương pháp khuếch tán thạch, kết hợp µl/ml tinh dầu sả với tween 80 0.5% ethanol nồng độ 10% 30% cho vòng kháng khuẩn tương đương kháng sinh ampicillin acid nalidixic, để có hiệu tương tự cần phải sử dụng nồng độ 50 µl/ml tinh dầu đơn, hiệu kết hợp giúp cắt giảm 90% lượng tinh dầu so với việc sử dụng tinh dầu riêng lẻ Kết hợp 250 𝜇l/ml tinh dầu sả 150 𝜇l/ml (tương đương 47ppm thể tích khơng khí) ethanol cho hiệu không khác tinh dầu sả 400 𝜇l/ml (p=0.05) phương pháp xông đĩa, giúp cắt giảm 37.5% lượng tinh dầu sử dụng Việc sử dụng kết hợp tween 80 0.5% phương pháp khuếch tán thạch không sử dụng phương pháp xông đĩa cần thiết cho hiệu kháng Escherichia coli chứng minh Nghiên cứu cho thấy tiềm ứng dụng kết hợp tinh dầu sả chanh ethanol kháng Escherichia coli ngành công nghiệp thực phẩm lớn thay loại kháng sinh tổng hợp độc hại tránh nguy kháng kháng sinh vi sinh vật, đồng thời mang ý nghĩa mặt kinh tế lượng tinh dầu thay ethanol TÀI LIỆU THAM KHẢO Bibliography Tenaillon O , Skurnik D., Picard B and Denamur E - The population genetics of commensal Escherichia coli,Nature Reviews Microbiology, (2010) 207-217 Alỗay A ĩ , Yỹzbaiolu G , ầakmak B , Salam A Yalỗin S - A Study on Prevalence of Escherichia coli O157 with a Verified Method in Foods, Turkish Journal of Agriculture - Food Science and Technology, (2017) 294-298 Gupta S K and Sharma A - Dynamic Properties Of Escherichia Coli, World Journal Of Pharmacy And Pharmacetical Sciences (2015) 296-307 Ozcan B , Yilmaz M and Caliskan M - Antimicrobial and antioxidant activities of 303 Trần Đăng Khôi, Hồ Thị Thanh Thủy, Liêu Mỹ Đông various extracts of verbascum antiochium boiss.,Med Food, 13 (5) (2013) 1147-1152 Vazirian M , Ardekani M R S , Khavani M., Jamalifar H ,Fazeli M R ,Toosi A N and Kashani S T - Antimicrobial activity of lemongrass (Cymbopogon citratus (DC) Stapf.) essential oil against food-borne pathogens added to cream-filled cakes and pastries, The Journal of essential oil research 24 (2012) 579-582 Fomda B A.,Jaykumar E., Bhat J A and Naik M I - Antibacterial activity of lemongrass (Cymbopogon citratus) oil against some selected pathogenic bacterias,Asian Pacific Journal of Tropical Medicine (2010) 535-538 Burt S - Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods—a review, International Journal of Food Microbiology, 94 (2001) 233-253 Grau M A R ,Avena-Bustillos R J , Friedman M ,Henika P R , Martiän-Belloso O and McHugh T H - Mechanical, Barrier, and Antimicrobial Properties of Apple Puree Edible Films Containing Plant Essential Oils, Agricultural and food chemistry, 54 (2006) 9262-9267 Mahian R A.and Sani A M - Essential oils in Food Systems: A systemic review,International journal of PharmTech research, (2016) 409-416 10 Bakkali F , Averbeck D , Idaomar M and Averbeck S - Biological effects of essential oils - a review,Food and Chemical Toxicology, 46 (2008) 446-475 11 Hilbig J , Ma Q ,Davidson P M , Weiss J and Zhong Q - Physical and antimicrobial properties of cinnamon bark oil co-nanoemulsified by lauric arginate and Tween 80,International Journal of Food Microbiology 233 (2016) 52-59 12 Romanazzi G , Karabulut O A and Smilanick J L - Combination of chitosan and ethanol to control postharvest gray mold of table grapes,Postharvest Biology and Technology, 45 (2007) 134–140 13 Karabulut O A , Romanazzi G , Smilanick J L and Lichter A - Postharvest ethanol and potassium sorbate treatments of table grapes to control gray mold,Postharvest Biology and Technology, 37 (2005) 129–134 14 Dobre A A , Gagiu V and Petru V - Antimicrobial activity of essential oils against food-borne bacteria evaluated by two preliminary methods, Romanian Biotechnological Letters (2011) 15 Ozogul Y , Kuley E , Y Ucar Ozogul F - Antimicrobial Impacts of Essential Oils on Food Borne-Pathogens, Recent Patents on Food, Nutrition & Agriculture, 53-61 (7) 2015 16 Sacchetti G , Maietti S., Muzzoli M.,Scaglianti M., Manfredini S., Radice M and Bruni R., - Comparative evaluation of 11 essential oils of different origin as functional antioxidants, antiradicals and antimicrobials in food,Food Chemistry, 91 (2005) 621– 632 17 Bajpai V K , Baek K H and Kang S C - Control of Salmonella in foods by using 304 Đánh giá tác động hiệp lực tinh dầu sả chanh ethanol tới Escherichia Coli essential oils: a review, Food Research International, 45 (2012) 722-734 18 Burt S A and Reinders R D - Antibacterial activity of selected plant essential oils against Escherichia coli O157:H7, Letters in Applied Microbiology, 36 (2003) 162167 19 Pinto G , Lichter A , Danshin A and Sela S - The effect of an ethanol dip of table grapes on populations of Escherichia coli,Postharvest Biology and Technology, 39 (3) (2006) 308-313 20 Beral Y and Ghellai L - Antibacterial efficacy of essential oil of Thymus capitatus, lactic acid and acetic acid against Escherichia coli in craw chicken meat, International Journal of Advanced Multidisciplinary Research, (2015) 42-47 21 Ghasemi F , Rezaei F , Araghi A and Tabari M A - Antimicrobial Activity of Aqueous-Alcoholic Extracts and the Essential Oil of Verbascum thapsus L,Jundishapur J Nat Pharm Prod, (2015) 22 Goni P., Lopez P., Sanchez C., Gomez-Lus R., Becerril R and Nerin C Antimicrobial activity in the vapour phase of a combination of cinnamon and clove essential oils, Food Chemistry, 116 (2009) 982–989 23 Laird K.and Phillips C - Vapour phase: a potential future use for essential oils as antimicrobials?,Applied microbyology, (2011) 169-174 24 Kerwin B A., Polysorbates 20 and 80 Used in the Formulation of Protein Biotherapeutics: Structure and Degradation Pathways, Journal of pharmaceutical sciences, 97 (8) (2008) 25 Sato K , Krist S and Buchbauer G - Antimicrobial effect of trans-cinnamaldehyde, (-)-perillaldehyde, (-)-citronellal, citral, eugenol and carvacrol on airborne microbes using an airwasher,Biology Pharm Bull, 29 (2006) 2292–2294 305 Trần Đăng Khôi, Hồ Thị Thanh Thủy, Liêu Mỹ Đông ABSTRACT EFFECT OF LEMONGASS ESSENTIAL OIL IN COMBINATION ALCOHOLIC AGAINST ESCHERICHIA COLI Tran Đang Khoi*, Ho Thi Thanh Thuy, Lieu My Dong * Faculty of Food Technology, Ho Chi Minh City University of Food Industry * Email: Dkhoi1995@gmail.com The purpose of this work was to evaluate the antibacterial efficiency of ethanol (500 ữ 800 àl/ml)and lemongrass essential oilat the different concentrations (400, 350, 200, 50, 30, 10, and 2.5 µl/ml), alone and in combination both against Escherichia coli ATCC 250913 using two preliminary methods: the agar disc diffusion method and the disc volatilization method The results showed that, the minimum inhibition concentrations of lemon grass oil combined with tween 80 in agar disk diffusion method was µl/ml, while ethanol was 55% The combination effect of essential oil µl/ml, tween 80 0.5% and ethanol 10% and 30% comparable antibiotics ampicillin and acid nalidixic, white In disc volatilization method, combination 250 µl/ml essential oil with 150 µl/ml ethanol show index of bactericidal effect was comparable to 400 µl/ml lemongrass employed alone.The results of the study showed that the combination effect of lemongrass essential oil and ethanol against E.coli comparable concentrations of free essential oil and could be potential agent which applied to preservation on food instead of toxic chemical antibiotics with high economic effect Key words: ethanol, combination, Escherichia coli, Lemongrass essential oil 306 ... tính kháng khuẩn ethanol vi khuẩn E coli Tương tự tinh dầu, ethanol thường sử dụng ức chế vi sinh vật Trong 300 Đánh giá tác động hiệp lực tinh dầu sả chanh ethanol tới Escherichia Coli nghiên cứu... kiểm tra đường kính vịng kháng khuẩn 298 Đánh giá tác động hiệp lực tinh dầu sả chanh ethanol tới Escherichia Coli 2.2.2 Phương pháp xông đĩa Để đánh giá hiệu kháng khuẩn với phương phápkhuếch... H and Kang S C - Control of Salmonella in foods by using 304 Đánh giá tác động hiệp lực tinh dầu sả chanh ethanol tới Escherichia Coli essential oils: a review, Food Research International, 45