* Tác dụng trên thần kinh trung ương
- Tác dụng an thần
+ Dịch chiết của xấu hổ có tác dụng kéo dài rõ rệt giấc ngủ hexobarbital, meprobamat hoặc barbital trên chuột, làm cho chuột đi vào giấc ngủ nhanh hơn [4] [5][16].
- Tác dụng chống co giật
+ Nghiên cứu của Ngo Bum và cộng sự cho thấy nước sắc lá xấu hổ có tác dụng bảo vệ chuột chống lại các cơn co giật gây ra bởi pentylentetrazol (PTZ) và strychnin, chống lại cơn động kinh gây ra bởi N-methyl-D-aspartate (NMDA) [51]. + Cao nước xấu hổ đã được nghiên cứu có tác dụng làm giảm các cơn co giật, làm chậm thời gian xuất hiện co giật và giảm tỷ lệ chết ở chuột nhắt trắng do cardiazol [4][16].
- Tác dụng giải lo âu
+ Mbomo và cộng sự ghi nhận dịch chiết nước của M. pudica có tác dụng giải lo âu trên mô hình chữ T nâng cao dựa trên quan sát hành vi ở chuột nhắt, chủ yếu là hành vi né tránh ức chế [22].
+ M. pudica được sử dụng trong y học cổ truyền Cameroon để điều trị chứng mất ngủ, động kinh, lo âu và kích động [52].
- Tác dụng chống trầm cảm
+ Dịch chiết nước từ lá khô của M. pudica được nghiên cứu có tác dụng điều trị trầm cảm trên chuột, dịch chiết M. pudica liều 6 mg/kg và 8 mg/kg có tác dụng tương đương với hai thuốc chống trầm cảm ba vòng là clomipramin liều 1,25 mg/kg và desipramin liều 2,14 mg/kg [45][50].
+ Theo một nghiên cứu sàng lọc in vitro 58 loại dược liệu trên hoạt tính của monoamino oxidase (MAO), cao khô toàn cây xấu hổ chiết bằng methanol với nồng độ 6 mg/ml ức chế 55% hoạt tính của enzym. Nghiên cứu này ghi nhận 9 trong số 58 loại dược liệu có hoạt tính ức chế trên 80%, chứng tỏ xấu hổ chỉ có tác dụng ở mức độ trung bình (trích theo tài liệu [5]).
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1 Dược liệu xấu hổ và dịch chiết
* Bộ phận trên mặt đất của cây xấu hổ được thu hái ở tại Đông Anh, Hà Nội vào tháng 7 năm 2012. Mẫu dược liệu được Tiến sĩ Trần Thế Bách, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học Việt Nam, định tên khoa học là Mimosa pudica L., Mimosaceae.
Hình 2.1 Dược liệu xấu hổ (M. pudica L., Mimosaceae) thu hái tại Đông Anh,
Hà Nội. * Chuẩn bị mẫu thử:
Sau khi thu hái, dược liệu được làm sạch, phơi sấy khô, cắt nhỏ. Các mẫu thử bao gồm:
- Dịch chiết nước thu được bằng phương pháp sắc với dung môi là nước (tỉ lệ 1:2) đun sôi trong 1h, lặp lại 3 lần. Gộp dịch chiết nước, bay hơi dung môi đến dạng cao lỏng 1:1.
Hình 2.2 Quy trình chuẩn bị dịch chiết nước 1:1 của xấu hổ
- Các phân đoạn dịch chiết thu được bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n- hexan, cloroform, ethyl acetat. Bay hơi dung môi đến cắn, phần nước còn lại cô đặc đến dạng cao lỏng 1:1 (1ml tương đương 1g dược liệu khô ban đầu). Hiệu suất chiết các phân đoạn n-hexan, cloroform, ethyl acetat tương ứng là 0,07%, 0,16%, 0,43%. Cắn các phân đoạn được phân tán trở lại bằng CMC 0,5% với liều phù hợp để cho chuột thí nghiệm uống.
Dược liệu xấu hổ khô
Sắc với nước lần 1 Sắc với nước lần 2 Sắc với nước lần 3 Dịch chiết nước lần 1 Dịch chiết nước lần 2 Dịch chiết nước lần 3 Dịch chiết nước Gộp Gộp Cô cách thủy
Hình 2.3 Quy trình chuẩn bị cắn chiết phân đoạn từ dịch chiết nước của xấu hổ
2.1.2. Hóa chất, thuốc thử
- Clomipramin (biệt dược Clomidep 25 mg của Sun Pharmaceutical Industries Ltd, Ấn Độ).
- Diazepam (Biệt dược Seduxen 5 mg của Gedeon Richter, Hungari) Dược liệu xấu hổ khô
Đun sôi với nước 3 lần, mỗi lần 1h Lọc nóng
Cất thu hồi dung môi
Phần còn lại
Phần còn lại Cắn phân đoạn CHCl3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cắn phân đoạn n-hexan
Cắn phân đoạn EtOAc Phần còn lại
Cao lỏng 1:1 Cô Dịch chiết 1:2 Nước sắc Lắc với n-hexan Cô cách thủy Lắc với CHCl3 Cất thu hồi dung môi
Lắc với EtOAc Cất thu hồi dung môi
- Thiopental natri của Rotexmedica, Đức; do công ty Dược phẩm Trung Ương 2 phân phối
- Dung dịch NaCl 0.9%; CMC 0,5%.
- Dung môi chiết phân đoạn: n- hexan, chloroform (CHCl3), ethylacetat (EtOAc) của hãng Daejung Chemicals and Metals Co. Ltd, Hàn Quốc.
2.1.3. Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng, chủng Swiss albino khỏe mạnh, 4 tuần tuổi, trọng lượng 20 ± 2g được cung cấp bởi Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương.
- Chuột cống trắng chủng Wistar khỏe mạnh, trọng lượng từ 180- 220g do Học viện Quân Y cung cấp.
Chuột được chia lô ngẫu nhiên 10-12 con/lô, nuôi ổn định trong điều kiện thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi tiến hành nghiên cứu, uống nước tự do, nuôi bằng thức ăn chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương sản xuất.
2.1.4. Dụng cụ, thiết bị, máy móc
- Bơm, kim tiêm cho chuột uống thuốc - Bóng đèn, đèn bàn
- Đồng hồ bấm giây
- Cân phân tích, cân kỹ thuật - Cốc có mỏ, ống đong - Nhiệt kế
- Chữ thập nâng cao (EPM): Dụng cụ thí nghiệm được cấu tạo gồm hai tay kín kích thước 30 x 5 x15 cm (dài x rộng x cao), hai tay mở kích thước 30 x 5 x 0.25 cm đặt vuông góc với nhau tạo ra khoảng trung tâm có kích thước 5 x 5 cm. Bộ dụng cụ được đặt cách nền nhà 60cm, cường độ chiếu sáng trong thời gian làm thực nghiệm được duy trì bằng một bóng đèn 60W.
Hình 2.4 Dụng cụ chữ thập nâng cao
- Chữ T nâng cao (ETM): Dụng cụ thí nghiệm gồm 2 cánh tay mở kích thước 50 x 10 x 1 cm (dài x rộng x cao), 1 cánh tay kín có kích thước 50 x 10 x 40 cm đặt vuông góc với nhau tạo thành hình chữ T; Bộ dụng cụ được đặt cách nền nhà 50cm. Cường độ chiếu sáng trong lúc thí nghiệm được duy trì bằng 2 bóng đèn 60W.
- Dụng cụ cho thí nghiệm bơi cưỡng bức (FST): là một bình thủy tinh trong suốt hình trụ có chiều cao 60 cm, đường kính 25 cm, chiều cao mực nước 30 cm, nhiệt độ nước được duy trì trong khoảng 23 – 25oC.
2.2 Nội dung nghiên cứu
Hình 2.7 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
Dược liệu xấu hổ
Chiết
Dịch chiết nước toàn phần
Đánh giá tác dụng giải lo âu
Lựa chọn mức liều
Mô hình EPM
Chiết phân đoạn
Đánh giá tác dụng giải lo âu Phân đoạn có tác dụng nhất Các mức liều Đánh giá tác dụng giải lo âu EPM Đánh giá tác dụng an thần Đánh giá tác dụng an thần Các mức liều Mô hình EPM Đánh giá tác dụng giải lo âu ETM Đánh giá tác dụng chống trầm cảm FST
2.2.1. Đánh giá tác dụng giải lo âu của dịch chiết nước toàn phần của dược liệu xấu hổ với các mức liều khác nhau trên (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Mô hình chữ thập nâng cao - Mô hình chữ T nâng cao
2.2.2. Đánh giá tác dụng giải lo âu của các phân đoạn từ dịch chiết nước xấu hổ trên
- Mô hình chữ thập nâng cao
2.2.3. Đánh giá tác dụng giải lo âu của phân đoạn có tác dụng nhất của xấu hổ ở các mức liều khác nhau trên
- Mô hình chữ thập nâng cao
2.2.4. Đánh giá tác dụng an thần của dịch chiết nước toàn phần và phân đoạn có tác dụng nhất của xấu hổ với các mức liều khác nhau trên
- Ảnh hưởng trên thời gian ngủ do thiopental.
2.2.5 Đánh giá tác dụng chống trầm cảm của dịch chiết nước toàn phần của dược liệu xấu hổ với các mức liều khác nhau trên
- Mô hình chuột bơi
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Điều kiện tiến hành thí nghiệm:
Tất cả các thí nghiệm trên được tiến hành trong phòng riêng biệt, yên tĩnh. Thời gian tiến hành thí nghiệm trong khoảng từ 8h – 17h.
Liều thuốc thử và thuốc đối chiếu
- Liều của chất đối chiếu diazepam được chọn ở mức 2mg/kg thể trọng chuột theo nghiên cứu của Dương Phước An và cộng sự [3], mức liều này phù hợp với mức liều của diazepam sử dụng đường uống để điều trị lo âu trên người trưởng thành (4 -15 mg/ngày) [2].
- Mức liều của chứng dương clomipramin được sử dụng trong nghiên cứu là 25 mg/kg, sử dụng dài ngày (21 ngày) theo nghiên cứu của Poltronieri và cộng sự [55]. Mức liều này phù hợp theo mức liều quy đổi từ liều dùng trên người để điều trị rối loạn hoảng sợ [2] sang liều trên chuột cống.
Diazepam và clomipramin được phân tán trong CMC 0,5% để tạo hỗn dịch cho chuột uống.
- Dược liệu xấu hổ: dựa trên liều điều trị của xấu hổ trong Y học cổ truyền là 6 – 12 g/ ngày [5][16], nhóm nghiên cứu đưa ra 3 mức liều thử nghiệm là 5g, 10g và 20 g/ngày. Liều trên chuột được ngoại suy từ liều của người:
+ Liều chuột nhắt: sử dụng 3 mức liều của dịch chiết toàn phần tương ứng là 1200 mg/kg, 2400 mg/kg, 4800 mg/kg tính theo dược liệu khô. Các cắn n-hexan, cloroform, ethylacetat được phân tán trong nước chứa 0,5% CMC và cho chuột uống với liều tương ứng 1,69mg/kg, 3,86 mg/kg và 10,26 mg/kg. Mức liều của các phân đoạn được tính tương đương với liều 2400 mg/kg (tính theo dược liệu khô) của dịch chiết toàn phần dựa trên hiệu suất chiết từ dược liệu. Liều của phân đoạn nước còn lại được biểu diễn theo lượng dược liệu khô ban đầu.
+ Liều chuột cống: sử dụng 2 mức liều của dịch chiết toàn phần là 1400 và 2800 mg/kg (tương đương mức liều 10g và 20 g/ngày ở người).
2.3.1. Đánh giá tác dụng giải lo âu của dịch chiết nước toàn phần của dược liệu xấu hổ với các mức liều khác nhau
2.3.1.1. Mô hình chữ thập nâng cao:
Mô hình chữ thập nâng cao được tiến hành theo mô tả của Lister và cộng sự [48].
* Phương pháp tiến hành:
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô và cho uống thuốc trong 5 ngày liên tiếp, mỗi ngày 1 lần vào 8h sáng.
- Lô 1: uống NaCl 0,9%
- Lô 2: uống diazepam với liều 2mg/kg.
- Lô 3: uống dịch chiết nước xấu hổ với liều 1200 mg/kg tính theo dược liệu khô.
- Lô 4: uống dịch chiết nước xấu hổ với liều 2400 mg/kg tính theo dược liệu khô.
- Lô 5: uống dịch chiết nước xấu hổ với liều 4800 mg/kg tính theo dược liệu khô.
Ngày thứ 5 sau khi uống thuốc 1h, chuột được đặt nhẹ nhàng vào vùng trung tâm, mặt hướng về phía cánh tay mở, sau đó chuột tự do di chuyển và khám phá trong thời gian 5 phút. Chuột được coi là ở trong một cánh tay khi cả 4 chân đều nằm trong cánh tay đó. Sau tiến hành thí nghiệm với mỗi chuột, dụng cụ thí nghiệm được lau sạch trước khi tiến hành với chuột tiếp theo để tránh lưu giữ mùi. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để hạn chế sai lệch về khoảng thời gian giữa các cá thể trong lô, mỗi lô được cho uống thuốc làm hai đợt, mỗi đợt cách nhau 25 phút.
* Chỉ tiêu đánh giá: số lần và thời gian lưu lại ở các cánh tay mở và kín của chuột.
2.3.1.2 Mô hình chữ T nâng cao:
Mô hình chữ T nâng cao được tiến hành theo mô tả của Graeff và cộng sự [39]
* Phương pháp tiến hành:
Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô và cho uống thuốc liên tiếp trong 21 ngày, mỗi ngày 1 lần vào 8h sáng:
- Lô 1: uống NaCl 0,9%
- Lô 2: uống clomipramin liều 25 mg/kg thể trọng chuột.
- Lô 3: uống dịch chiết nước xấu hổ với liều 1400 mg/kg tính theo dược liệu khô.
- Lô 4: uống dịch chiết nước xấu hổ với liều 2800 mg/kg tính theo dược liệu khô.
Ngày thứ 20: trước khi uống thuốc, cho chuột phơi nhiễm với mô hình chữ T trên 1 trong 2 cánh tay hở trong vòng 30 phút, sử dụng một thanh gỗ chắn ngang trước lối vào của cánh tay kín và một thanh chắn ngay đầu gần tay hở để đảm bảo chuột được tách biệt với phần còn lại của dụng cụ. Chuột được uống thuốc sau khi phơi nhiễm 30 phút.
Ngày thứ 21: sau khi cho chuột uống thuốc 1h, chuột cống được đặt vào cuối tay kín, mặt hướng về vùng trung tâm để tự do khám phá mô hình. Ghi nhận thời gian chuột rời tay kín bằng cả 4 chân (thời gian tiềm tàng nền, baseline latency), sau đó ghi nhận lại thời gian này trong 2 lần đặt chuột vào mô hình ở vị trí như trên (né tránh 1 và né tránh 2, avoidance 1 và avoidance 2). Sau huấn luyện né tránh, chuột được đặt lại vào mô hình vào phần cuối tay mở bên phải, mặt hướng về phía trung tâm và ghi nhận thời gian chuột rời tay mở này bằng cả 4 chân (chạy trốn, escape). Khoảng cách giữa các lần đặt chuột vào mô hình là 30 giây, dụng cụ thí nghiệm được lau sạch trước khi tiến hành với chuột tiếp theo để tránh lưu giữ mùi.
Để hạn chế sai lệch về khoảng thời gian giữa các cá thể trong lô, mỗi lô được cho uống thuốc làm hai đợt, mỗi đợt cách nhau 25 phút.
* Lưu ý: thời gian tối đa cho mỗi thí nghiệm không quá 5 phút.
* Chỉ tiêu đánh giá: Các chỉ số: thời gian tiềm tàng nền (baseline), né tránh 1 (avoidance 1), né tránh 2 (avoidance 2), chạy trốn (escape).
2.3.2. Đánh giá tác dụng giải lo âu của các phân đoạn từ dịch chiết nước xấu hổ
* Phương pháp tiến hành
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 7 lô, các lô được uống thuốc thử tương ứng liên tục trong 5 ngày, mối ngày 1 lần vào 8h sáng.
- Lô 1: uống NaCl 0,9%
- Lô 2: uống diazepam liều 2mg/kg
- Lô 3: uống dịch chiết nước xấu hổ với liều 2400 mg/kg tính theo dược liệu khô.
- Lô 4: uống phân đoạn dịch chiết n-hexan với liều tương đương 2400 mg/kg tính theo dược liệu khô.
- Lô 5: uống phân đoạn dịch chiết cloroform với liều tương đương 2400 mg/kg tính theo dược liệu khô.
- Lô 6: uống phân đoạn dịch chiết ethylacetat với liều tương đương 2400 mg/kg tính theo dược liệu khô.
- Lô 7: uống phân đoạn nước còn lại với liều tương đương 2400 mg/kg tính theo dược liệu khô.
Ngày thứ 5 sau khi uống thuốc 1h tiến hành thí nghiệm trên mô hình chữ thập nâng cao như đã mô tả trong phần 2.3.1.1.
2.3.3. Đánh giá tác dụng giải lo âu của phân đoạn từ dịch chiết nước xấu hổ có tác dụng nhất ở các mức liều khác nhau
* Phương pháp tiến hành:
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, các lô được uống thuốc thử tương ứng liên tục trong 5 ngày, mỗi ngày 1 lần vào 8h:
- Lô 1: uống NaCl 0,9% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Lô 2: uống diazepam liều 2 mg/kg
- Lô 3: uống phân đoạn nước còn lại với liều tương đương 1200 mg/kg tính theo dược liệu khô.
- Lô 4: uống phân đoạn nước còn lại với liều tương đương 2400 mg/kg tính theo dược liệu khô.
- Lô 5: uống phân đoạn nước còn lại với liều tương đương 4800 mg/kg tính theo dược liệu khô.
Ngày thứ 5 sau khi uống thuốc 1h, tiến hành thí nghiệm trên mô hình chữ thập nâng cao như đã mô tả trong phần 2.3.1.1.
2.3.4. Đánh giá tác dụng an thần của dịch chiết nước toàn phần và phân đoạn từ dịch chiết nước xấu hổ có tác dụng nhất với các mức liều khác nhau
Ảnh hưởng trên thời gian ngủ của thiopental
Mô hình được tiến hành theo mô tả của Đỗ Trung Đàm và Đỗ Thị Phượng [7]. * Phương pháp tiến hành:
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 8 lô và cho uống thuốc thử tương ứng trong 5 ngày liên tiếp, mỗi ngày 1 lần vào 8h sáng.
- Lô 1: uống NaCl 0,9%