2.3.1. Tổng hợp hóa học
Sử dụng các phương pháp thực nghiệm cơ bản trong hóa học hữu cơ để tổng hợp các chất dự kiến.
Dùng SKLM để theo dõi tiến triển của phản ứng. Soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm để nhận biết vết sắc ký.
Xác định độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp được bằng phương pháp SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy.
2.3.2. Xác định cấu trúc
Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR), Phổ khối lượng phân tử (MS), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H - NMR).
Phổ hồng ngoại (IR):
Được ghi tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400cm-1. Mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1: 200 rồi ép dưới dạng viên nén dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
Phổ khối lượng phân tử (MS):
Được ghi theo phương pháp ESI trên máyLTQ Orbitrap XL tại Phòng Hóa vật liệu - Khoa Hóa - Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, còn tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam được ghi trên máy LC/MSD Trap - SL và máy LC/MS/MS-Xevo TQ.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H - NMR):
Được ghi trên máy Brucker AV-500MHz tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.3. Thử tác dụng sinh học
Thử tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm tiến hành theo phương pháp khuếch tán trên thạch, thực hiện tại bộ môn Vi sinh - Sinh học của Trường Đại học Dược Hà Nội.
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Tổng hợp hóa học
Qua tham khảo các tài liệu và dựa vào điều kiện của phòng thí nghiệm, các hóa chất cho phép, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của 1,4-bis(1H- benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan theo sơ đồ như sau:
NH2 NH2 N H N SH N H N S (CH2)4 N N H S N N S (CH2)4 N N S N N S (CH2)4 N N S N N S (CH2)4 N N S Benzyl clorid MCA ECA C2H5OOCH2C CH2COOC2H5 H3COOCH2C CH2COOCH3 (I-a) (II-a) (III-a) (III-b) (III-c) (III-d)
Sờ đồ 8: Sơ đồ các dẫn chất 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan được tổng hợp
3.1.1. Tổng hợp 2-mercaptobenzimidazol
Phương pháp của Van Allan và Deacon:
NH2 NH2 + CS2 KOH, H2O EtOH, to N H N SH + H2S + H2O (I-a) (II-a)
Tiến hành: Chuẩn bị dụng cụ bao gồm: một bình cầu 250ml, ống đong 100ml, nồi áo, quả bóp, đá bọt, hệ thống sinh hàn hồi lưu. Cố định bình cầu và hệ thống sinh hàn lên giá đỡ. Đầu tiên, cho vào bình cầu hỗn hợp gồm có: 7,03g (0,065 mol) o-phenylendiamin và 3,642g (0,065mol) KOH, 70ml ethanol tuyệt đối, 12ml nước cất, sau đó thêm từ từ 3,93ml (0,065 mol) carbon disulfid (CS2) và thêm vài viên đá bọt (để làm hỗn hợp phản ứng sôi đều). Lắp bình cầu vào bếp ôm với hệ thống sinh hàn thích hợp. Tiến hành hồi lưu trong 3 giờ.
Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là dicloromethan: methanol (20: 1) và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm. Dưới đây là hình ảnh SKLM minh họa (với 1 là nguyên liệu ban đầu và 2 là hỗn hợp phản ứng):
(Phản ứng đang diễn ra) (Phản ứng kết thúc)
Hình 3.1.Hình ảnh theo dõi phản ứng bằng SKLM của phản ứng tạo chất II-a Xử lý hỗn hợp phản ứng: Sau khi phản ứng kết thúc, thêm vào hỗn hợp phản ứng 0,7g than hoạt, tiếp tục đun trong vòng 10 phút, sau đó lọc nóng bằng phễu Buchner và rửa 2-3 lần bằng ít ethanol (bỏ than hoạt và đá bọt). Dịch thu được thêm 70ml nước nóng (60-70o
C), acid hóa đến pH khoảng 5-6, tiếp tục khuấy khoảng 1 giờ. Lọc lấy tủa (rửa bằng nước cất) và sấy khô dưới đèn hồng ngoại, thu được sản phẩm thô. Tinh chế bằng cách kết tinh lại trong cồn 50%, thu được 9,154g sản phẩm.
Kết quả:
Độ tan : Tan tốt trong ethanol, aceton, DMF, DMSO; tan trong methanol, dicloromethan; không tan trong nước. Nhiệt độ nóng chảy : 302oC - 306oC
Hiệu suất : 93,89%
Độ tinh khiết : Kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là dicloromethan: methanol (20: 1), thì cho một vết gọn, rõ, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Rf = 0,32.
3.1.2. Tổng hợp 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan 3.1.2.1. Tổng hợp tác nhân 1,4-dibromobutan
Theo Vogel’s Textbook of Practical Organic Chemistry trang 390 [15]:
O + HBr
H2SO4 to/3h
BrCH2CH2CH2CH2Br + H2O
Sơ đồ 10:Sơ đồ tổng hợp 1,4-dibromobutan
Tiến hành: Chuẩn bị dụng cụ bao gồm: Một bình cầu 250ml, 3 pipet 10ml, găng tay, quả bóp, nồi áo, đá bọt, hệ thống sinh hàn thích hợp. Cố định bình cầu và hệ thống sinh hàn lên giá đỡ. Đầu tiên, cho vào bình cầu 34ml acid hydrobromic (HBr) 40%; tiếp theo nhỏ từ từ 8,2ml acid sulfuric đặc; cuối cùng là thêm 4,1ml tetrahydrofuran và vài viên đá bọt. Sau đó lắc nhẹ và lắp bình cầu vào bếp ôm với hệ thống sinh hàn thích hợp. Tiến hành hồi lưu trong 3 giờ.
Chú ý: Trong thao tác pha hỗn hợp phản ứng nền: đeo kính, găng tay, khẩu trang để an toàn và phải tiến hành trong tủ hút.
Xử lý hỗn hợp phản ứng: Phản ứng kết thúc sau thời gian 3 tiếng đun hồi lưu. Để lạnh, đổ tất cả hỗn hợp phản ứng sang bình chiết 125ml, gạn lấy lớp dưới vào cốc có mỏ, rửa 2 lần với khoảng 50ml nước cất. Sau đó rửa 2 lần tiếp với 50ml natri carbonat bão hòa, rửa tiếp với khoảng 50ml nước cất đến pH khoảng 7. Gạn lấy pha hữu cơ vào bình nón 50ml, sau đó cho Na2SO4 vào để làm khan và đậy nắp kín. Bảo quản trong tủ hút.
Kết quả:
- Thể tích : 2,1ml - Hiệu suất : 34,78%
3.1.2.2. Tổng hợp 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan
Theo phương pháp của Kozo Aoki và Kazuhiro Aikawa, sơ đồ phản ứng như sau:
N H N SH BrCH2CH2CH2CH2Br N H N S (CH2)4 N H N + Ethanol to = 90oC / 14h S (III-a)
Sơ đồ 11:Sơ đồ tổng hợp 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan
Tiến hành: Chuẩn bị dụng cụ bao gồm: một bình cầu 2 cổ 250ml có nút mài, một pipet chia vạch 10ml, 1 pipet chia vạch 1ml, quả bóp, máy khuấy từ có gia nhiệt, con khuấy từ, nhiệt kế, cân kỹ thuật và hệ thống sinh hàn thích hợp. Cố định bình cầu chứa con khuấy từ và hệ thống sinh hàn lên giá đỡ. Đầu tiên, hòa tan 3,51g (23,4mmol) 2-mercaptobenzimidazol trong 70ml ethanol tuyệt đối. Sau đó nhỏ từ từ 1,39ml (11,7mmol) 1,4-dibromobutan vào dung dịch trên. Tiến hành hồi lưu trong 14 giờ.
Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là dicloromethan: methanol (20: 1) và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm. Dưới đây là hinh ảnh SKLM minh họa (với 1 là nguyên liệu ban đầu và 2 là hỗn hợp phản ứng):
(Phản ứng đang diễn ra) (Phản ứng kết thúc)
Xử lý hỗn hợp phản ứng: Sau khi phản ứng kết thúc, bình cầu được để nguội về nhiệt độ phòng, thêm khoảng 50ml nước cất vào trong bình cầu và khuấy, kiềm hóa bằng cách vừa khuấy vừa nhỏ từ từ dung dịch NaOH 2N vào đến pH khoảng 12-13, sau đó tiến hành lọc lấy tủa bằng phễu Buchner có nối sẵn với bộ phận hút chân không, rửa tủa bằng ethanol và acetonitril. Sấy khô dưới đèn hồng ngoại và đem cân, thu được 3,83g sản phẩm.
Kết quả:
Cảm quan : Bột màu trắng
Độ tan : Không tan trong nước, tan trong ethanol nóng, DMF, DMSO.
Nhiệt độ nóng chảy : 274oC – 277oC. Hiệu suất : 92,31 %.
Độ tinh khiết : Kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là dicloromethan: methanol (20: 1) thì cho một vết gọn, rõ, Rf = 0,42.
3.1.3. Tổng hợp một số dẫn chất thế ở vị trí N1 và N1’ của 1,4-bis(1H- benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan
3.1.3.1. Tổng hợp 1,4-bis(1-benzyl-1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan
Phương trình phản ứng như sau:
N H N S (CH2)4 S N N H + K2CO3 to N N S (CH2)4 S N N DMF khan (III-b) Cl
Tiến hành: Chuẩn bị dụng cụ như sau: một bình cầu 2 cổ 250ml có nút mài, pipet 10ml, pipet chia vạch 1ml, quả bóp, máy khuấy từ có gia nhiệt, nhiệt kế, con khuấy từ, cân kỹ thuật, hóa chất, bộ dụng cụ làm khan và hệ thống sinh hàn thích hợp. Cố định bình cầu chứa con khuấy từ và hệ thống sinh hàn có nối dụng cụ làm khan lên giá đỡ. Đầu tiên, hòa tan 0,42g (1,19mmol) 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol- 2-yl-thio)butan trong 13ml DMF khan, sau đó thêm 0,45g K2CO3 khan và tiến hành khuấy hoạt hóa ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 giờ, tiếp theo là nhỏ từ từ 0,28ml (2,37mmol) benzyl clorid vào hỗn hợp phản ứng. Tiến hành khuấy ở 100oC, sau 1 giờ chấm sắc ký xem thì thấy có phản ứng chạy, tiếp tục đun hồi lưu ở 100oC trong 10 giờ nữa thì kết thúc phản ứng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là dicloromethan: methanol (20: 1) và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm. Dưới đây là hinh ảnh SKLM minh họa (với 1 là nguyên liệu ban đầu và 2 là hỗn hợp phản ứng):
(Phản ứng đang diễn ra) (Phản ứng kết thúc)
Hình 3.3.Hình ảnh theo dõi phản ứng bằng SKLM của phản ứng tạo chất III-b Xử lý hỗn hợp phản ứng: Sau khi phản ứng kết thúc, bình cầu được để nguội về nhiệt độ phòng. Chuẩn bị một cốc có mỏ 250ml khác có chứa khoảng 200ml nước cất và 1 con khuấy, vừa khuấy vừa đổ từ từ hỗn hợp phản ứng trong bình cầu vào cốc có mỏ trên, rửa bình cầu bằng ít nước cất. Tiếp tục khuấy trong khoảng 2 giờ (để tách sản phẩm khỏi dung môi và hòa tan hết K2CO3 trong nước). Sau đó tiến hành lọc lấy tủa qua phễu Buchner có nối sẵn hệ thống hút chân không
(rửa tủa bằng nước cất). Sấy khô dưới đèn hồng ngoại và đem cân, thu được 0,5g sản phẩm.
Kết quả:
- Cảm quan : Bột màu trắng hơi vàng.
- Độ tan : Không tan trong nước, tan trong ethanol nóng, DMF, DMSO.
- Nhiệt độ nóng chảy : 166oC – 168oC. - Hiệu suất : 78,92%.
- Độ tinh khiết : Kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là dicloromethan: methanol (20: 1), thì cho một vết gọn, rõ, Rf = 0,64.
3.1.3.2. Tổng hợp 1,4-bis(1-methoxycarbonylmethyl-1H-benzo[d]imidazol-2-yl- thio)butan
Phương trình phản ứng như sau:
N H N S (CH2)4 S N N H + K2CO3 N N S (CH2)4 S N N DMF khan ClCH2COOCH3 CH2COOCH3 H3COOCH2C (III-c)
Sơ đồ 13: Sơ đồ tổng hợp1,4-bis(1-methoxycarbonylmethyl-1H-benzo[d]imidazol- 2-yl-thio)butan
Tiến hành: Chuẩn bị dụng cụ như sau: một bình cầu 2 cổ 250ml có nút mài, pipet 10ml, pipet chia vạch 1ml, quả bóp, máy khuấy từ có gia nhiệt, nhiệt kế, con khuấy từ, cân kỹ thuật, hóa chất, bộ dụng cụ làm khan và hệ thống sinh hàn thích hợp. Cố định bình cầu chứa con khuấy từ và hệ thống sinh hàn có nối dụng cụ làm khan lên giá đỡ. Đầu tiên, hòa tan 0,41g (1,16mmol) 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol- 2-yl-thio)butan trong 13ml DMF khan, sau đó thêm 0,48g K2CO3 và tiến hành
khuấy hoạt hóa ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 giờ, nhỏ từ từ 0,21ml (2,32mmol) methyl cloroacetat vào. Tiến hành khuấy ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ 30 phút.
Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là dicloromethan: methanol (20: 1) và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm. Dưới đây là hình ảnh SKLM minh họa (với 1 là nguyên liệu ban đầu, 2 là hỗn hợp phản ứng):
(Phản ứng đang diễn ra) (Phản ứng kết thúc)
Hình 3.4. Hình ảnh theo dõi phản ứng bằng SKLM của phản ứng tạo chất III-c Xử lý hỗn hợp phản ứng: Sau khi phản ứng kết thúc, lấy bình cầu hỗn hợp phản ứng ra. Chuẩn bị một cốc có mỏ 250ml khác có chứa khoảng 200ml nước cất và 1 con khuấy, vừa khuấy vừa đổ từ từ hỗn hợp phản ứng trong bình cầu vào cốc có mỏ trên, rửa bình cầu bằng ít nước cất. Tiếp tục khuấy trong khoảng 2 giờ (để tách sản phẩm khỏi dung môi và hòa tan hết K2CO3 trong nước). Sau đó tiến hành lọc lấy tủa qua phễu Buchner có nối sẵn hệ thống hút chân không (rửa tủa bằng nước cất). Sấy khô dưới đèn hồng ngoại và đem cân, thu được 0,37g sản phẩm.
Kết quả:
- Cảm quan : Bột màu trắng.
- Độ tan : Không tan trong nước, tan trong ethanol, DMF, DMSO.
- Nhiệt độ nóng chảy : 130oC – 132oC. - Hiệu suất : 64,15%.
- Độ tinh khiết : Kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là dicloromethan: methanol (20: 1), thì cho một vết gọn, rõ, Rf = 0,46.
3.1.3.3. Tổng hợp 1,4-bis(1-ethoxycarbonylmethyl-1H-benzo[d]imidazol-2-yl- thio)butan
Phương trình phản ứng như sau:
N H N S (CH2)4 S N H N + DMF khan K2CO3 N N S (CH2)4 S N N C2H5OOCH2C CH2COOC2H5 (III-d) Cl-CH2COOC2H5
Sơ đồ 14: Sơ đồ tổng hơp1,4-bis(1-ethoxycarbonylmethyl-1H-benzo[d]imidazol-2- yl-thio)butan
Tiến hành: Chuẩn bị dụng cụ như sau: một bình cầu 2 cổ 250ml có nút mài, pipet 10ml, pipet chia vạch 1ml, quả bóp, máy khuấy từ có gia nhiệt, nhiệt kế, con khuấy từ, cân kỹ thuật, hóa chất, bộ dụng cụ làm khan và hệ thống sinh hàn thích hợp. Cố định bình cầu chứa con khuấy từ và hệ thống sinh hàn có nối dụng cụ làm khan lên giá đỡ. Đầu tiên, hòa tan 0,51g (1,44mmol) 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol- 2-yl-thio)butan trong 13ml DMF khan, sau đó thêm 0,55g K2CO3 và tiến hành khuấy hoạt hóa ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 tiếng, nhỏ từ từ 0,31ml (2,88mmol) ethyl cloroacetat vào. Tiến hành đun hồi lưu ở nhiệt độ 90oC trong 2 giờ.
Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là dicloromethan: methanol (20: 1) và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm. Dưới đây là hình ảnh SKLM minh họa (với 1 là nguyên liệu ban đầu, 2 là hỗn hợp phản ứng):
(Phản ứng đang diễn ra) (Phản ứng kết thúc) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.5. Hình ảnh theo dõi phản ứng bằng SKLM của phản ứng tạo chất III-d Xử lý hỗn hợp phản ứng: Sau khi phản ứng kết thúc, lấy bình cầu hỗn hợp phản ứng ra. Chuẩn bị một cốc có mỏ 250ml khác có chứa khoảng 200ml nước cất và 1 con khuấy, vừa khuấy vừa đổ từ từ hỗn hợp phản ứng trong bình cầu vào cốc có mỏ trên, rửa bình cầu bằng ít nước cất. Tiếp tục khuấy trong khoảng 2 giờ (để tách sản phẩm khỏi dung môi và hòa tan hết K2CO3 trong nước). Sau đó tiến hành lọc lấy tủa qua phễu Buchner có nối sẵn hệ thống hút chân không (rửa tủa bằng nước cất). Sấy khô dưới đèn hồng ngoại và đem cân, thu được 0,62g sản phẩm.
Kết quả:
- Cảm quan : Bột màu trắng.
- Độ tan : Không tan trong nước, tan trong ethanol, DMF, DMSO.
- Nhiệt độ nóng chảy : 101oC – 103oC. - Hiệu suất : 81,81%.
- Độ tinh khiết : Kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là dicloromethan: methanol (20: 1), thì cho một vết gọn, rõ, Rf = 0,50.
Như vậy, chúng tôi đã tổng hợp được 5 chất. Sau đây là bảng tóm tắt kết quả tổng hợp hóa học:
Bảng 3.1. Tóm tắt kết quả tổng hợp hóa học: STT Chất CTCT Cảm quan t o nc (oC) Hiệu suất (%) 1 II-a N H N SH Tinh thể hình phiến mỏng, màu trắng bạc. 302-306 93,89 2 III-a N H N S (CH2)4 S N N H Bột màu trắng 274-277 92,31 3 III-b N N S (CH2)4 S N N Bột màu trắng hơi vàng. 166-168 78,92 4 III-c N N S (CH2)4 S N N CH2COOCH3 H3COOCH2C Bột màu trắng 130-132 64,15 5 III-d N N S (CH2)4 S N N CH2COOC2H5 C2H5OOCH2C Bột màu trắng 101-103 81,81
3.2. Kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất tổng hợp đƣợc
Sau khi tổng hợp được, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra độ tinh khiết của các