Triển khai sắc ký lớp mỏng alcaloid toàn phần 2 loài Stephania và chất chuẩn trên cùng một bản mỏng:
Cắn alcaloid toàn phần và chất chuẩn (tetrahydropalmatin) được hòa tan trong cloroform. Hệ dung môi khai triển CHCl3 : MeOH (9:1) [6]. Hiện màu với thuốc thử Dragendorf. Kết quả các vết alcaloid thu được thể hiện trên hình 3.3.
Hình 3.3. Sắc ký lớp mỏng đã phun thuốc thử hiện màu có đối chiếu với chất chuẩn tetrahydropalmatin
C : tetrahydropalmatin; S : Stephania sinica; D : Stephania dielsiana
Nhận xét: Có thể thấy rõ vết lớn nhất của Stephania sinica có Rf trùng với vết của chất chuẩn tetrahydropalmatin, trong khi ở Stephania dielsiana không quan sát thấy vết nào có Rf trùng với Rf của chất chuẩn.
Hiệu suất chiết alcaloid với S. sinica và S. dielsiana tương ứng là 7,1% và 2,8%.
3.3.2. Đánh giá tác dụng giải lo âu của alcaloid toàn phần từ S. dielsiana và S. sinica
Tác dụng giải lo âu của alcaloid toàn phần từ 2 loài S. dielsiana và S. sinica ở mức liều tương đương với liều của dịch chiết toàn phần có tác dụng xác định trong thí nghiệm trước được đánh giá trên mô hình chữ thập nâng cao ở chuột không chịu stress. Kết quả về thời gian lưu lại tay mở và số lần vào tay mở của các lô chuột thí nghiệm trong mô hình chữ thập nâng cao được trình bày trong bảng 3.6; số lần vào tay kín và tổng số lần lưu tại tay kín, tay mở được trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.6. Tác dụng của alcaloid toàn phần, diazepam và tetrahydropalmatin trên số lần và thời gian lưu tại tay mở của chuột không chịu stress trên mô hình EPM
Tên lô n Thời gian lưu tại
tay mở (giây) (a) p(a)
Số lần ra tay mở (b) p(b) NaCl1 11 3,27 ± 1,70 0,36 ± 0,20 Diazepam2 2 mg/kg 13 41,23 ± 15,47 p1-2 = 0,001 3,69 ± 0,75 p1-2 = 0,000 Rotundin 1 mg/kg 3 8 20,75 ± 3,63 p1-3 = 0,000 p2-3 = 0,916 2,13 ± 0,67 p1-3 = 0,004 p2-3 = 0,121 S.sinica4 7,14 mg/kg 13 37,85 ± 21,31 p1-4 = 0,001 p2-4 = 0,650 p3-4 = 0,595 2,23 ± 0,56 p1-4 = 0,001 p2-4 = 0,081 p3-4 = 0,804 S.dielsiana5 0,84 mg/kg 12 13,75 ±4 ,08 p1-5 = 0,032 p2-5 = 0,123 p3-5 = 0,181 1,58 ± 0,42 p1-5 = 0,027 p2-5 = 0,026 p3-5 = 0,571
*Liều alcaloid quy đổi theo liều dịch chiết toàn phần tương ứng dựa vào hiệu suất chiết alcaloid từ củ 2 loài Stephania.
Bảng 3.7. Tác dụng của alcaloid toàn phần, diazepam và tetrahydropalmatin trên số lần vào tay kín và thời gian lưu tại tay kín, tay mở của chuột không chịu stress trên
mô hình EPM.
Tên lô n Số lần vào tay kín (c) p(c) so với nhóm chứng NaCl Tổng số lần vào tay kín, tay mở (d) p(d) so với nhóm chứng NaCl NaCl 11 7,73 ± 0,91 8,09 ± 0,95 Diazepam 2mg/kg 13 8,46 ± 1,22 0,459 12,15 ± 1,53 0,072 Rotundin 1mg/kg 8 4,38 ± 1,56 0,026 6,50 ± 2,15 0,206 S.sinica 7,14 mg/kg 13 9,54 ± 1,12 0,134 11,77 ± 1,55 0,082 S.dielsiana 0,84 mg/kg 12 9,00 ± 0,59 0,169 10,58 ± 0,69 0,051
*Liều alcaloid quy đổi theo liều dịch chiết toàn phần (tương ứng 2 mức liều 20 mg/kg và 100 mg/kg) dựa vào hiệu suất chiết alcaloid từ củ 2 loài Stephania.
Nhận xét: diazepam (2 mg/kg) và tetrahydropalmatin (1 mg/kg) thể hiện tác dụng giải lo âu rõ rệt thông qua khả năng tăng có ý nghĩa số lần vào tay mở và thời gian lưu lại tay này so với lô chứng uống nước muối sinh lý. Ở mức liều tương đương với liều 30 mg/kg (S. dielsiana) và 100 mg/kg với (S. sinica) tính theo dịch chiết toàn phần, cắn alcaloid toàn phần cũng làm tăng rõ rệt cả hai chỉ tiêu quan sát (p < 0,05). Tác dụng của cắn alcaloid toàn phần và tetrahydropalmatin ở mức liều thử có xu hướng yếu hơn tác dụng của diazepam nhưng sự khác biệt chưa đạt mức có nghĩa thống kê trừ tác dụng của S. dielsiana trên chỉ tiêu số lần vào tay mở. Tetrahydropalmatin không làm thay đổi tổng số lần vào tay kín, tay mở so với nhóm
chứng NaCl. Diazepam và 2 loại dược liệu không làm thay đổi có ý nghĩa số lần vào tay kín và tổng số lần vào tay kín vào tay mở so với nhóm chứng NaCl.
3.3.3.Đánh giá tác dụng an thần của alcaloid toàn phần từ 2 loài Stephania
Tác dụng an thần của alcaloid toàn phần từ 2 loài S. dielsiana và S. sinica ở mức liều tương đương với liều của dịch chiết toàn phần có tác dụng xác định trong thí nghiệm trước được đánh giá trên ảnh hưởng tới thời gian ngủ do thiopental ở chuột không chịu stress. Kết quả được trình bày trong hình 3.4.
0 5 10 15 20 NaCl DZP ** 0 2 S. dielsiana mg/kg 1 2,80 7,14 * THP S. sinica ** 0,84 2,14 ** ** ** T h o i g ia n n g u ( p h u t)
Hình 3.4: Ảnh hưởng trên thời gian ngủ do thiopental của diazepam (DZP), tetrahydropalmatin (THP) và alcaloid toàn phần của 2 loài Stephania trên chuột bình thường. * p < 0,05, ** p < 0,01 so với nhóm chứng uống nuớc muối sinh lý.
Nhận xét: Ở mức liều tương đương với liều 30 mg/kg và 100 mg/kg tính theo dịch chiết toàn phần, cắn alcaloid của cả 2 loài Stephania đều làm tăng có ý nghĩa thời gian ngủ do thiopental (1,31 - 1,87 lần so với lô uống nước muối sinh lý). Tác dụng này kém hơn có ý nghĩa so với tác dụng của tetrahydropalmatin (ở cả 2 mức liều thử của 2 loài S. dielsiana và S. sinica) và của diazepam (ở mức liều thấp của cắn alcaloid từ S. sinica). Tác dụng của S. dielsiana mạnh hơn so với S. sinica ở mức liều thấp (p < 0,05). Trong khi đó ở mức liều cao, tác dụng của 2 loài
3.4. BÀN LUẬN
Giải lo âu là tác dụng dược lý thần kinh quan trọng được nhiều nghiên cứu tập trung tiếp cận nhằm tìm nguồn dược liệu có hiệu quả, ít tác dụng phụ để thay thế hoặc bổ sung cho các thuốc hóa dược đang được sử dụng trong điều trị [57]. Những kết quả nghiên cứu về hóa học và dược lý tâm thần của các loài trong chi Stephania
Lour. nói chung, 2 loài S. sinica và S. dielsiana mới được tập trung nghiên cứu ở Việt nam nói riêng là cơ sở cho việc đánh giá tác dụng giải lo âu và an thần thực nghiệm được thực hiện trong nghiên cứu này.
Về tác dụng giải lo âu, kết quả từ 3 mô hình dược lý thực nghiệm sử dụng trong nghiên cứu cho thấy dịch chiết toàn phần của S. sinica và S. dielsiana đều thể hiện tác dụng giải lo âu. Tuy nhiên có sự khác biệt giữa mức độ và đặc điểm giải lo âu giữa 2 dược liệu này.
Trên mô hình chữ thập nâng cao (EPM), mô hình kinh điển được sử dụng phổ biến để sàng lọc tác dụng giải lo âu dựa trên đáp ứng lo âu không điều kiện của động vật thực nghiệm do sợ độ cao khi khám phá cánh tay mở và xu hướng lưu lại nơi ẩn nấp an toàn (tay kín) trong mê cung chữ thập [18], dịch chiết toàn phần của
S. dielsiana và S. sinica đều làm tăng số lần di chuyển vào tay mở và thời gian lưu lại ở tay này so với lô chứng, thể hiện tác dụng giải lo âu tương tự thuốc đối chiếu diazepam (bảng 3.1). Khả năng tăng thời gian lưu lại tay mở có thể liên quan đến tác dụng an thần quá mức làm giảm hoạt động tự nhiên của chuột được loại trừ do số lần khám phá tay kín và tổng số lần khám phá tay kín và tay mở của mê cung (bảng 3.2; bảng 3.4) ở các nhóm thử thuốc trên chuột bình thường và chuột chịu stress do cô lập đều tăng hoặc giảm không có ý nghĩa so với nhóm chứng dùng nước muối sinh lý [22], [45]. Trong khoảng liều lựa chọn thử trên mô hình (từ 30 mg/kg đến 1000 mg/kg), tác dụng giải lo âu ít phụ thuộc vào liều, đồng thời không có sự khác biệt về mức độ tác dụng giữa 2 loài ở cùng một mức liều sử dụng.
Lựa chọn liều tối thiểu có tác dụng để đánh giá tiếp trên mô hình EPM ở chuột chịu stress do cô lập, kết quả cho thấy chỉ có S. sinica thể hiện tác dụng giải (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
lo âu trên các chỉ tiêu đánh giá tương tự như diazepam (bảng 3.3). Chuột chịu stress do cô lập thể hiện trạng thái lo âu rõ rệt hơn nhóm chuột nuôi bầy đàn, thể hiện rõ rệt trên số lần ra tay mở và thời gian lưu lại tay này [2]. Mô hình này được Korte và cộng sự đánh giá có nhiều ưu điểm hơn so với mô hình kinh điển trên chuột không chịu stress cho phép đánh giá hành vi tăng cường sợ hãi, tăng cường tình trạng lo âu đã được tạo ra trước đó trên động vật thực nghiệm bởi tác nhân gây stress, phản ánh cảm xúc bất an của động vật khi đứng trước đe dọa hoặc nguy hiểm [30]. Sự thay đổi về hành vi của chuột chịu stress, được giả thuyết liên quan đến hoạt hóa hệ noradrenergic trung ương và yếu tố giải phóng corticotrophin (CRF) ở vùng dưới đồi [41] hay giảm khả năng điều biến của GABA trong việc mở kênh Cl-, có thể thay đổi tác dụng giải lo âu của các thuốc [49]. Điều này cho thấy, có thể phải sử dụng mức liều cao hơn với S. dielsiana, như đã quan sát với chế phẩm Sleepcare trong nghiên cứu trước đây để quan sát được tác dụng giải lo âu của dịch chiết trên chuột chịu stress do cô lập [2].
Mô hình chữ thập nâng cao kinh điển (EPM) với chỉ tiêu đánh giá chính dựa trên số lần vào và thời gian lưu lại tay mở của động vật thực nghiệm được coi là mô hình “trộn lẫn”, không cho phép phân biệt các thể lo âu khác nhau [54]. Vì vậy, Graeff và cộng sự đã phát triển mô hình chữ T nâng cao (ETM), cải tiến dựa trên mô hình EPM kinh điển để phân biệt đáp ứng chạy trốn (escape) khi động vật thực nghiệm được tiếp xúc với tay mở (liên quan đến rối loạn hoảng sợ) và đáp ứng né tránh ức chế (inhibitory avoidance) sau ghi nhớ phơi nhiễm với vùng nguy hiểm (liên quan đến rối loạn lo âu toàn thể) áp dụng đánh giá tác dụng giải lo âu của thuốc. Theo đó, sợ hãi có điều kiện (conditioned fear) hay đáp ứng né tránh ức chế được tính là thời gian để chuột rời tay kín trong 3 thí nghiệm liên tiếp (avoidance 1,2,3), còn sợ hãi không điều kiện (unconditioned fear) là khoảng thời gian để chuột trốn thoát khỏi tay mở hay đáp ứng chạy trốn. Theo Deakin và Graeff, sợ hãi có điều kiện có liên quan đến rối loạn lo âu lan tỏa (Generalized Anxiety Disorder- GAD) ở người, trong khi sợ hãi không điều liện liên quan đến rối loạn hoảng sợ – Panic Disorder (PD) [20]. Việc cho động vật thực nghiệm tiếp xúc với mô hình
(trong vòng 30 phút) 24 h trước khi tiến hành thí nghiệm giúp giảm thời gian chạy trốn do đó tăng độ nhạy phát hiện tác dụng chống hoảng sợ của các thuốc đã được thực hiện trong nghiên cứu [50]. Trên mô hình này, dịch chiết toàn phần của S. dielsiana làm tăng có ý nghĩa thời gian tiềm tàng của đáp ứng chạy trốn (escape) khi chuột được đặt ở tay mở, thể hiện tác dụng chống rối loạn hoảng sợ tương tự thuốc đối chứng chống trầm cảm 3 vòng clomipramin [44], mà không làm thay đổi đáp ứng né tránh (avoidance) so với lô chứng (bảng 3.5). Ngược lại, dịch chiết toàn phần của S. sinica lại có tác dụng làm giảm rõ rệt thời gian tiềm tàng của đáp ứng né tránh (avoidance 1) nhưng không làm thay đổi đáp ứng chạy trốn, thể hiện tác dụng chống rối loạn lo âu lan tỏa tương tự các dẫn chất benzodiazepin và buspiron [24]. Như vậy, có thể giả thuyết về sự khác biệt về thành phần có hoạt tính và cơ chế tác dụng giải lo âu giữa 2 loài S. sinica và S. dielsiana.
Thành phần hoạt chất chính tạo nên tác dụng giải lo âu của 2 loài Stephania
là alcaloid. Alcaloid toàn phần của của cả hai dược liệu với mức liều tương đương với liều tối thiểu có tác dụng của dịch chiết toàn phần đều làm tăng có ý nghĩa số lần vào tay mở và thời gian lưu lại tay mở tương tự diazepam và tetrahydropalmatin (bảng 3.6) trong khi không làm thay đổi có ý nghĩa số lần vào tay kín và tổng số lần vào tay kín, tay mở so với nhóm chứng NaCl (bảng 3.7). Sinomenin và tetrahydropalmatin, 2 alcaloid phân lập được từ cả S. sinica và loài S. dielsiana [6], [16] đều đã được chứng minh có tác dụng giải lo âu trên các mô hình thực nghiệm [19], [32]. Ở liều thấp (0,5 - 10 mg/kg), THP có tác dụng giải lo âu rõ rệt trên mô hình chữ thập nâng cao, trong đó tác dụng liều tối thiểu có tác dụng là 1 mg/kg đã được chúng tôi lựa chọn sử dụng trong nghiên cứu này. Ở mức liều cao hơn (50 mg/kg), tác dụng giải lo âu của THP giảm rõ rệt, thay thế bằng tác dụng an thần và giãn cơ. Tác dụng giải lo âu của tetrahydropalmatin bị đối kháng bởi flumazenil, một chất cạnh tranh vị trí gắn của benzodiazepin trên receptor GABAA, chứng tỏ cơ chế giải lo âu của THP thông qua, ít nhất một phần, tương tác với vị trí gắn của benzodiazepin trên receptor GABAA [26], [32]. Tuy nhiên, dữ liệu hiện tại chưa giải thích được sự khác biệt về mức độ tác dụng và đặc tính giải lo âu của 2 loài
Stephania. Sự khác biệt có thể một phần liên quan đến hàm lượng tetrahydropalmatin trong hai loài Stephania, nhưng cũng không loại trừ vai trò của các alcaloid khác với cơ chế tác dụng không thông qua trung gian GABAA như tetrahydropalmatin [58] để giải thích tác dụng trên rối loạn hoảng sợ của S. dielsiana tương tự các thuốc tác dụng thông qua hệ serotoninergic [43].
Về tác dụng an thần, kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết toàn phần của
S. sinica và S. dielsiana đều có tác dụng an thần thể hiện trên khả năng kéo dài thời gian ngủ do thiopental, đồng thời alcaloid là thành phần chính tạo tác dụng an thần của 2 dược liệu ở mức liều thể hiện tác dụng giải lo âu. Tuy nhiên, trên chuột chịu stress do cô lập, dịch chiết của cả 2 loài Stephania đều không thể hiện tác dụng an thần làm đảo ngược tác dụng rút ngắn thời gian ngủ do thiopental gây ra bởi stress ở mức liều đã thể hiện rõ tác dụng an thần trên chuột bình thường.
Kéo dài thời gian ngủ do thuốc ngủ barbituric là thử nghiệm kinh điển thăm dò tác dụng an thần của thuốc [36]. Kết quả trong nghiên cứu này khẳng định tác dụng an thần của dịch chiết toàn phần, của alcaloid toàn phần và của tetrahydropalmatin (hình 3.1; hình 3.2 và hình 3.4), nhưng ở mức liều thấp hơn rất nhiều so với các nghiên cứu trước đây cho thấy tầm quan trọng của việc lựa chọn liều có tác dụng. Nguyễn Quốc Huy và cộng sự ghi nhận tác dụng kéo dài thời gian ngủ do thiopental gấp 3 lần và 8 lần tương ứng khi dùng liều 1,25 g/kg và 2,5 g/kg dịch chiết S. dielsiana (LD50 = 22,2 g/kg) [10]. Nguyễn Lan Thùy Ty và cộng sự quan sát thấy Stilux-60 (L-tetrahydropalmatin) thể hiện tác dụng kéo dài thời gian ngủ do thiopental gấp khoảng 7 lần khi dùng liều 48 mg/kg trên chuột nhắt trắng [15].
Tương tự tác dụng giải lo âu, tác dụng an thần của 2 dược liệu chủ yếu được giải thích do hoạt tính của alcaloid trong đó có tetrahydropalmatin. Tuy nhiên, tác dụng này, đặc biệt với S. dielsiana còn có thể có vai trò của các alcaloid khác do hàm lượng rất thấp tetrahydropalmatin ở loài này. Tác dụng an thần của tetrahydropalmatin đã được chứng minh có liên quan đến khả năng hoạt hóa
receptor GABAA [26]. Trên chuột chịu stress do cô lập, khác với diazepam, cả 2 loài
Stephania đều không thể hiện tác dụng an thần thông qua khả năng kéo dài thời gian ngủ do thiopental ở 2 mức liều 30 mg/kg và 100 mg/kg (hình 3.2). Chuột chịu stress do cô lập trong nghiên cứu này với những biểu hiện thay đổi về hành vi và tâm lý: tăng hoạt động vận động tự nhiên, tăng tâm lý sợ hãi với những khu vực cao và được chiếu sáng trong mô hình chữ thập nâng cao, có thời gian ngủ do thiopental ngắn hơn so với nhóm chuột nuôi bầy đàn [2]. Kết quả từ nghiên cứu Kurmar và Kulkarni cũng cho thấy chuột chịu stress do cô lập có biểu hiện kéo dài thời gian tiềm tàng và rút ngắn thời gian ngủ gây ra bởi pentobarbital, tăng hoạt động vận động (di chuyển, đứng lên) của chuột so với chuột nuôi bầy đàn [31]. Sự thay đổi này cũng có thể làm thay đổi đáp ứng của động vật thực nghiệm với các thuốc an thần [46]. Có khả năng cơ chế hoạt hóa hệ noradrenergic trung ương và yếu tố giải